Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

TRỊNH THỊ HOÀI THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE
VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG
NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn ThS.
Cao Bá Cường, nguời thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa
học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia
đình, bạn bè tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tôt nhất,
tuy nhiên do buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như
hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu

sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận hoàn
chỉnh hơn.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 4 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Trịnh Thị Hoài Thu


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định những gì viết trong khóa luận “Nghiên cứu khả
năng giải phóng thuốc Berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ
môi trường nước dừa già” là kết qủa nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự
hướng dẫn trực tiếp của ThS. Cao Bá Cường, giảng viên khoa Sinh - KTNN
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Tất cả những số liệu đều được thu thập từ
thực nghiệm và qua xử lý thống kê, không trùng với bất cứ tài liệu nào.
Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2017
Sinh viên
Trịnh Thị Hoài Thu


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
A. xylinum: Acetobacter xylinum
BH: Berberine hydrochloride
CVK: Cellulose vi khuẩn
cs : Cộng sự


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài........................................................................................... 1

2. Mục đích nghiên cứu..................................................................................... 2
3. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu .................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
5. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 4
1.1. Tổng quan về màng CVK .......................................................................... 4
1.1.1. Vi sinh vật tổng hợp CVK ...................................................................... 4
1.1.2. Cấu trúc của CVK ................................................................................... 4
1.1.3. Đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum........................................... 5
1.1.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................................. 5
1.1.5. Các phương pháp sản xuất CVK từ A. xylinum ...................................... 7
1.1.5.1. Lên men tĩnh ........................................................................................ 7
1.1.5.2. Lên men động....................................................................................... 7
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn trên thế giới
và tại Việt Nam ................................................................................................. 8
1.2.1. Trên thế giới ............................................................................................ 8
1.2.2. Ở Việt Nam ............................................................................................. 9
1.3. Tổng quan về Berberin.............................................................................. 9
1.3.1. Công thức hóa học và tính chất............................................................... 9
1.3.1.1. Công thức hóa học ............................................................................. 10
1.3.1.2. Nguồn gốc .......................................................................................... 10
1.3.1.3. Tính chất vật lý................................................................................... 10
1.3.1.4. Tính chất hóa học ............................................................................... 11
1.3.1.5. Tác dụng............................................................................................ 11


1.4. Tình hình nghiên cứu Berberin trên thế giới và tại Việt Nam ................. 12
1.4.1. Trên thế giới .......................................................................................... 12
1.4.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 14

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 14
2.1.1. Giống vi khuẩn...................................................................................... 14
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất........................................................................ 14
2.2. Thiết bị và dụng cụ................................................................................... 14
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 14
2.2.2. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu.............................................. 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 15
2.3.1. Phương pháp tạo màng CVK ................................................................ 15
2.3.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ...................... 16
2.3.3. Phương pháp xây dựng đường chuẩn của BH ...................................... 18
2.3.4. Phương pháp pha môi trường đệm PBS ( Phosphate buffered saline) 20
2.3.5. Phương pháp đưa thuốc BH vào màng CVK để hấp thụ ...................... 20
2.3.6. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK ...... 21
2.3.7. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng CVK............. 21
2.3.8. Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của BH ................. 22
2.3.9. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................. 22
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 23
3.1. Màng BC được nuôi cấy từ môi trường nước dừa già. ............................ 23
3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường........................................................... 24
3.3. Tinh chế màng CVK ................................................................................ 24
3.4. Lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK ...................................................... 25
3.5. Xác định lượng thuốc BH giải phóng khỏi màng CVK........................... 26
3.6 Dược động học giải phóng thuốc BH của màng CVK – BH.................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 34


1. Kết luận ....................................................................................................... 34
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 35

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của BH ............................................................. 10
Hình 2.1 Dùng máy khuấy từ khuấy đều môi trường nuôi cấy ...................... 16
Hình 2.2: Sơ đồ tinh chế màng CVK. ............................................................. 17
Hình 2.3: Phương trình đường chuẩn của BH ................................................ 19
Hình 3.1: Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già ........... 23
Hình 3.2: Màng CVK thô................................................................................ 24
Hình 3.3: CVK ngâm trong HCl

Hình 3.4: Màng CVK sau khi được tinh

chế ................................................................................................................... 25
Hình 3.5: Màng CVK dày 0.7cm .................................................................... 25
Hình 3.7: Màng CVK đang hấp thụ thuốc ...................................................... 26
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc BH của màng CVK ........... 28
Hình 3.9: Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =12................................................... 30
Hình 3.10: Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH = 2.................................................. 30


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già ........................................ 6
Bảng 2.1 Môi trường tạo màng CVK.............................................................. 15
Bảng 2.2: Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch BH ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3) .............................................................................. 19
Bảng 2.3: Môi trường đệm PBS với pH 2, 12................................................. 20
Bảng 3.1: Khối lượng hấp thụ thuốc BH cuả màng CVK .............................. 26
Bảng 3.2: Giá trị OD của BH giải phóng từ màng CVK - BH trong môi
trường pH = 2, pH =12 với các độ dày màng khác nhau (n = 3) .................... 27
Bảng 3.3: Tỉ lệ thuốc BH được giải phóng tại các thời điểm lấy mẫu (n = 3) 29

Bảng 3.4: Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ
giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau (n = 3) ......................... 32


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Berberin là hoạt chất được chiết từ cây hoàng đằng (còn có tên vàng
đắng, hoàng liên, tên khoa học là Coptis teeta),… (là loại cây dây leo thân gỗ
có phân nhánh, mọc hoang ở nhiều nơi). Trong hoàng đằng có nhiều alcaloid
dẫn xuất của izoquinolein, chủ yếu là berberin tỷ lệ từ 1,5 đến 2-3%.
Berberine hydrochloride (BH) là một alkaloid thực vật nổi tiếng với
lịch sử lâu đời, đã được sử dụng ở cả Việt Nam và Trung Quốc trong y học cổ
truyền. Nó được sử dụng để điều trị tiêu chảy do kháng khuẩn của nó, chống
tăng và tính chất chống tiết. Gần đây, các nghiên cứu cũng đã chứng minh
rằng BH có thể có những tính chất dược lý khác bao gồm chống ung thư,
chống HIV, chống bệnh tiểu đường, đau mắt hột, giải lo âu và thuốc giảm
đau, nấm da, trị bỏng, …
Berberin có một ưu thế là khi dùng điều trị các nhiễm trùng đường ruột
berberin sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có
ích ở ruột. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh, khi dùng một số thuốc
kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng không mong
muốn gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột.
Berberin rất lành tính, rất hiếm gặp trường hợp dùng mà bị dị ứng. Tuy
nhiên đối với những người quá mẫn cảm với thuốc và phụ nữ có thai thì
không dùng vì berberin có khả năng gây co bóp tử cung làm ảnh hưởng tới
thai nhi.
Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Cellulose vi khuẩn và cellulose thực
vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose vi khuẩn bao gồm các liên kết
β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hóa khác nhau. CVK có độ tinh sạch

cao so với các loại cellulose khác, không chứa các hợp chất cao phân tử như
ligin, hemicellulose do vậy chúng có những đặc tính vượt trội và dẻo dai, bền
1


chắc. Trên thế giới Cellulose vi khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn
bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp
thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, xử lý nước thải, bảo vệ môi
trường… Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da
tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân
tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Ở Việt
Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các
nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Kết quả cho thấy màng CVK có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc
chậm lại, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc.
Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng A. xylium,
từ đó chế tạo màng sinh học để nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc qua
màng nhằm hạn chế các tác dụng phụ, khắc phục tính ít tan trong nước và
tăng khả dụng sinh học của berberin trong việc điều trị bệnh. Đó là lí do
chúng tôi đã chọn đề tài:
“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Berberin của màng cellulose vi
khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già”.
2. Mục đích nghiên cứu
-

Chế tạo màng CVK từ vi khuẩn Acetobacter xylium.

-

Thiết kế chế tạo hệ thống gồm màng CVK nạp thuốc và nghiên cứu khả

năng giải phóng để tạo ra hệ thống giải phóng chậm, kéo dài của thuốc, điều
này có thể giúp tăng lượng thuốc hấp thụ vào cơ thể, khắc phục những tác
dụng không mong muốn của thuốc Berberin, phát huy được tối đa hiệu quả
của thuốc trong điều trị bệnh đường ruột.
3. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
-

Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK, thuốc Berberin dạng chế phẩm và

dạng tinh khiết, nước dừa già…
-

Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro.


-

Địa điểm nghiên cứu: Phòng TN Sinh lý học người động vật khoa Sinh-

KTNN, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
-

Ý nghĩa khoa học: Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.

Về mặt khoa học thì việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK vào việc khắc
phục hạn chế của thuốc berberin sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không
chỉ dừng lại ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng

trên nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển
hơn.
Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của màng
CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả màng
CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh
vực khác nhau.
-

Ý nghĩa thực tiễn

+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum.
+ Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng làm hệ thống nhằm khắc phục
được những tác dụng phụ không mong muốn .
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.
5. Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A. xylinum với các nguyên liệu có sẵn

(nước dừa già).
-

Thu sản phẩm CVK từ dịch nuôi cấy và tiến hành xử lý màng CVK thu

được sau khi nuôi cấy.
-

Thử nghiệm tác dụng của màng CVK trong quá trình giải phóng thuốc.

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về màng CVK
1.1.1. Vi sinh vật tổng hợp CVK
Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A.
xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp
cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của
cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau.
A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter.
Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào [6].
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc:

Schizomycetes

Lớp:


Pseudomonadales

Pseudomonadieae

Pseudomonadaceae

Bộ:
Bộ phụ:
Họ:

A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng
0.6 – 0.8 μm, dài khoảng 2-3 μm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm,
không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già

hay do điều kiện môi trường nuôi cấy thì hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [6].
1.1.2. Cấu trúc của CVK
Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau
bằng liên kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp lại
với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1.5 nm. Đây là những thớ sợi tự


nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một
vài loại thực vật. Các thớ sợ thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi


tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3-4nm, và
chiều dài 130-177nm ( Yamanaka et al, 2000). Các dải siêu mịn của cellulose
vi khuẩn có chiều dài từ 1-9µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn
định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki at al, 2001).
Màng CVK do A. xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với PC, tuy
nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [4].
1.1.3. Đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum
-

Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể

mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao.
-

Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là

cellulose I.
-

Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: Khả năng giữ nước đáng

kể, lực ẩm cao. Màng CVK có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút 60 700 lần trọng nước của nó [10].
-

Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và

hemicellulose.
-

Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài

nguyên có thể phục hồi.
-

Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.

-

Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: Tinh thể cellulose vi khuẩn có

độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao.
-

Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản

xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian.
Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc
dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ.

1.1.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum


Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh
dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố
tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [3].
Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước dừa
già chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố tăng trưởng như 1,3 –
diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, … Vì vậy A. xylinum
rất thích hợp phát triển trong môi trường này [6].
Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu làm
cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất kém
[6].
Thành phần của nước dừa già [6] được trình bày như ở bảng 1.1
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già
Nước (%)
Protein (%)
Chất béo toàn phần (%)

94.99

Đồng (mg/100g)

0.72 Mangan (mg/100g)
0.2

Selenium (µg/100g)

Carbonhydrat (%)

3.17

Vitamin C (mg/100g)

Đường (%)

2.16

Thiamin (mg/100g)

Calcium (mg/100g)
Sắt (mg/100g)
Magie (mg/100g)

24
0.29
25

Riboflavin (mg/100g)
Niacin (mg/100g)

0.04
0.142
1
2.4
0.03
0.057
0.08

Acid Panthenic (mg/100g) 0.043

Phosphorus (mg/100g)

20 Vitamin B6 (mg/100g)

Kali (mg/100g)

250

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0.1

0.032

Folate (µg/100g)

3

1.1.5. Các phương pháp sản xuất CVK từ A. xylinum
1.1.5.1. Lên men tĩnh
Môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các khay
lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các khay được đậy
bằng 9 giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và
môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ

thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC. Sợi cellulose mới được tổng hợp
sẽ di chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose
nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí. Cellulose tiếp tục
được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7-10 ngày có thể thu
CVk [3, 31].
1.1.5.2. Lên men động
Vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy
lắc. Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy
đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt
ở 28-30ᴼC, 180-200 vòng/phút. CVK được tạo ra từ môi trường lắc có dạng
hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường.
Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và khả
năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá trình lên men đạt


hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men
[3, 31].
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn trên thế
giới và tại Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Nghiên cứu của Wei B và
cộng sự (2011) cho thấy màng khô CVK thu được sau khi ngâm trong
benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn; Merck KGaA, Darmstadt,
Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được
tìm thấy là 0,116 kg/cm2 và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24h chống lại
hoạt động của S. Aureus và B. Subtilis [11].
Tác giả Brown (1989), dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá
trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho
tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để

biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất
trong sinh học, thực phẩm.
Dựa vào đặc tính đặc biệt của CVK như khả năng thấm nước cao, khả
năng kết dính chặt chẽ và trơ về mặt hóa học nên CVK có vai trò như màng
sinh học. Người ta đã dùng màng sinh học để thay thế da tạm thời. Ở Brazil,
người ta cũng đã ứng dụng thành công màng CVK để làm da nhân tạo.
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng CVK là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997),
Cienchansk (2004), Legeza và cs (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs
(2006) sử dụng màng CVK đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được
kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm
màng CVK từ A.xylium dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998),


Czaja và cs (2006) đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng
da cho phụ nữ [2] Luan J. và cs (2012) [12] đã nghiên cứu màng CVK cho
băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng
trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng. Kết quả cho thấy sau khi sử
dụng màng CVK ngâm tẩm bạc sulfadiazine đắp lên vết thương, hoạt động
kháng khuẩn đối với P. aeruginosa, E. coli và S. aureus đạt hiệu quả tốt hơn
dạng kem bôi hay dung dịch thông thường.
1.2.2. Ở Việt Nam
Từ năm 2000, Bộ môn Vi Sinh - Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố
Hồ Chí Minh đã bước đầu nghiên cứu dùng màng CVK từ A. xylinum phối
hợp với hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u điều trị vết bỏng thực nghiệm cho
kết quả tốt.
Nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã có một số
công trình nghiên cứu về màng CVK từ A. xylium và bước đầu nghiên cứu về
các đặc tính màng CVK thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học điều trị
bỏng ở VN [3].

Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter
xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, kết quả
cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợ có sợi cellulose nhỏ,
dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng làm
màng trị bỏng [4].
Từ những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên đã chứng minh CVK
có khả năng tuyệt vời trong việc hấp thu và giải phóng một số loại thuốc qua
da. Đây cũng là một hướng đi khả quan trong việc nghiên cứu phát triển ứng
dụng màng CVK trong việc hấp thu và giải phóng thuốc BH.
1.3. Tổng quan về Berberin
1.3.1. Công thức hóa học và tính chất


1.3.1.1. Công thức hóa học
- Tên quốc tế: Berberine hydrochloride
- Tên khoa học: 5,6-dihydro-8,9-dimethoxyl-1,3- dioxa 6a - azoniaindeno (5,6
- a) anthracen clorid dihydrat.
- Công thức hóa học: C20H18NO4Cl.2H2O
- Khối lượng phân tử: 371.82

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của BH
1.3.1.2. Nguồn gốc
BH thường có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi Berberis,
Hydrastis candensis, Coptis chinensis, BH có nhiều trong thân và rễ cây vằng
đắng với tỷ lệ 1.5 - 3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid toàn
phần.
BH thường có lẫn tạp chất alcaloid khác nhau như: palmatin, jatrorrhizin.
Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhzin không quá 5%.
1.3.1.3. Tính chất vật lý

Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng. Độ chảy khi ở
dạng base là 145ºC (bị phân hủy). Độ tan dạng base tan chậm trong nước, hơi
tan trong ethanol, khó tan trong ether. Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400


trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong
cloroform và ether. Dạng muối Sulfat dễ tan trong nước, tan trong ethanol
[13].
1.3.1.4. Tính chất hóa học
Berberin có tính chất như một base yếu, tạo muối bằng cách thay thế nhóm
OH, việc tạo muối Berberin không giống như các alcaloid khác mà muối tạo
thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có loại phân tử nước [1].
Hóa tính của oxy: Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, N
không vững bền trong môi trường kiềm mạnh, dễ hỗ biến mở vòng cho chức
andehyd gọi là berberial [1].
Hóa tính mạnh kép: Berberin có thể mất mạch kép tại nhân giữa để cho các
hydro alkaloid không màu [1].
1.3.1.5. Tác dụng
BH có tác dụng kháng khuẩn được dùng chủ yếu trong các bệnh rối loạn
đường tiêu hóa [13].
Berberin có tác dụng kháng khuẩn với shigella, tụ cầu và liên cầu khuẩn, thể
protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng gây bệnh ( kí sinh
trùng sốt rét, kí sinh trùng đường ruột) [14]. Những năm gần đây, một số
nghiên cứu mới nhất ở nước ngoài đã xác định berberin có tác dụng chống lại
nhiều loại vi khuẩn gram dương (nhuộm theo phương pháp gram vi khuẩn bắt
màu tím), gram âm (bắt màu đỏ) và các vi khuẩn kháng axit. Ngoài ra, nó còn
có tác dụng chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên
sinh.
BH có tác dụng kìm khuẩn tả và E. coli, đặc biệt khi dùng sẽ không ảnh
hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột, khi dùng

phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các
thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đường ruột.


Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy, berberin còn có tác dụng hạ huyết áp,
cường tim và chống loạn nhịp. Các nhà khoa học cũng phát hiện ra khả năng
ức chế bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ, giảm cholesterol và
triglyceride, chống đái tháo đường, giảm viêm cho người bị viêm khớp...
Không dùng berberin cho người quá mẫn với thuốc, phụ nữ có thai (vì thuốc
có khả năng gây co bóp tử cung làm ảnh hưởng tới thai nhi).
1.4. Tình hình nghiên cứu Berberin trên thế giới và tại Việt Nam
1.4.1. Trên thế giới
Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang và
Guang [15] nghiên cứu tạo ra Chitosan tráng (bọc) nano-liposome cho việc
phân phối uống berberine hydrochloride. Kết quả cho thấy chitosan bọc nanoliposome là hiệu quả hơn so với những người không tráng cho việc cung cấp
bằng miệng của BH.
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của Berberin
trong điều trị bệnh nhân tiểu đường loại 2 [16].
Ryan Bradley, ND, MPH, và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về Berberin
trong bệnh tiểu đường [31].
Gần đây, Lin Huang và cs [17] nghiên cứu việc sử dụng màng CV cho việc
kiểm soát in vitro của thuốc berberin. Ngoài thẩm thấu qua da, thí nghiệm
kiểm soát sự giải phóng thuốc berberin qua màng CV còn được thử nghiệm
mô phỏng trong dạ dày, ruột. Các kết quả thu được cho thấy thuốc berberin đã
được giải phóng từ màng CV với một tốc độ chậm.
1.4.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về Berberin như:
- Vũ Bình Dương, Nguyễn Trọng Diệp, Nguyễn Thị Thùy, Hoàng Văn Lương
(2010), Nghiên cứu bào chế viên nén Berberin giải phóng tại đích đại tràng,
kết quả đã nghiên cứu bào chế viên nén Bereberin clorid 100 mg giải phóng

tại đích đại tràng theo cơ chế phân hủy bởi hệ vi sinh vật đại tràng [9].


- Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây thuốc
Việt Nam [8].
- Nguyễn Liêm - chiết xuất Berberin bằng áp lực nóng .
- Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm - góp phần nghiên cứu cải tiến quy trình
sản xuất Berberin từ cây vàng đắng.
- Hồ Đắc Trinh - chiết Berberin clorid trong vàng đắng bằng dung dịch acid
sulfuric loãng [5].


CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi phòng thí nghiệm
vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất


Nguyên liệu: Nước dừa già



Hóa chất: Sử dụng các hóa chất đặc biệt và các hóa chất thông thường

có nguồn gốc từ Trung Quốc và Việt Nam.


BH dạng tinh khiết > 99%



Đường glucose



Pepton



(NH4)2SO4



Acid acetic



NaOH, HCl



Nước cất



KH2PO4

2.2. Thiết bị và dụng cụ
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu


Bể ổn nhiệt 1013



Bể rung siêu âm S60/H



Buồng cấy vô trùng (Haraeus)



Cân kĩ thuật TE412



Cân phân tích.



Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức)



Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản)



Nồi hấp khử trùng HV – 110/ HIRAIAMA



Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)



Máy lắc TEIO TRCH (Hàn Quốc)

2.2.2. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
Bình định mức loại 100 ml, 500 ml, 1000 ml, pipet chính xác 1 ml, 5 ml, 10
ml, ... giấy bạc, vải lọc, giấy thấm và một số dụng cụ khác trong phòng thí
nghiệm cần thiết.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng CVK
Sử dụng môi trường cải biến từ môi trường chuẩn Hestrin – Schramm [6] (cao
nấm men được thay thế bằng nước dừa già). Thành phần và khối lượng các
chất có trong môi trường nuôi cấy tạo màng CVK được thể hiện trong bảng
2.1.
Bảng 2.1 Môi trường tạo màng CVK
STT

Hóa chất

Hàm lượng

1

Nước dừa già

1000ml

2

Glucose

30g

3

KH2PO4

0.3g

4

(NH4)2SO4

0.5g

5

Pepton

10g

6

Acid axetic

2%

7

Dịch giống

10%

A. xylium