Khảo sát đột biến CALR trên bệnh nhân xơ tủy nguyên phát bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN CALR TRÊN BỆNH NHÂN XƠ TỦY NGUYÊN PHÁT
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA
Phan Thị Xinh*, Hoàng Anh Vũ**

TÓMTẮT
Mục tiêu: Xơ tủy nguyên phát là một dạng bệnh lý thuộc nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy có tủy
xương bị xơ hóa, tăng sinh reticulin và gan lách tạo máu thay tủy. Các đột biến đặc trưng cho thể bệnh này
bao gồm JAK2V617F (60%) và MPLW515L/K (5%). Gần đây, đột biến CALR được phát hiện trong khoảng
20 – 30% trường hợp xơ tủy nguyên phát với 2 loại đột biến phổ biến là mất 52 bp (loại 1), chèn 5 bp (loại
2) tại exon 9 gây lệch khung đọc và một số kiểu đột biến hiếm gặp khác. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này
nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA exon 9 của gen CALR để khảo sát đột biến, góp
thêm 1 dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy nguyên phát trên lâm sàng.
Đối tượng và phương pháp: Mẫu máu ngoại vi trong ống chống đông EDTA của bệnh nhân xơ tủy
nguyên phát âm tính với đột biến JAK2V617F được tách chiết DNA. Các cặp mồi xuôi và mồi ngược được
thiết kế để khuếch đại đặc hiệu exon 9 của gen CALR. Sản phẩm PCR được giải trình tự theo hai chiều xuôi
và ngược trên hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer để khảo sát đột biến.
Kết quả: Cặp mồi CALR-g8F và CALR-g9R dùng để khuếch đại vùng exon 9 của gen CALR có nhiệt
độ bắt cặp tối ưu là 550C. Phân tích kết quả giải trình tự chuỗi DNA ghi nhận 7/9 trường hợp có đột biến
CALR chiếm 77,78%, trong đó phát hiện 2 kiểu đột biến bao gồm mất đoạn 52 bp (c.1099_1150del) và đột
biến chèn thêm 5 bp (c.1154_1155insTTGTC), và các đột biến này đều ở dạng dị hợp tử. Kiểu mất đoạn 52
bp gặp ở 6 bệnh nhân, là kiểu đột biến thường gặp nhất trong nghiên cứu này.
Kết luận: Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phát hiện các
đột biến CALR exon 9, giúp dễ dàng chẩn đoán các trường hợp xơ tủy nguyên phát không có đột biến
JAK2V617F và MPLW515L/K trên lâm sàng.
Từ khóa: Xơ tủy nguyên phát, gen CALR, đột biến gen, giải trình tự chuỗi DNA

ABSTRACT

DETECTION OF CALR MUTATIONS IN PRIMARY MYELOFIBROSIS BY DNA SEQUENCING
Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 21 - No 2 - 2017: 322 - 326
Purpose: Primary myelofibrosis (PMF) is a type of myeloproliferative neoplasms (MPNs)
characterized by fibrosis in bone marrow, increased proliferation of reticulin and replacing bone marrow by
liver and spleen for hematopoiesis. The typical mutations in this disease consist of JAK2V617F (60%) and
MPLW515L/K (5%). Recently, CALR mutations were detected in approximately 20 – 30% of PMF patients
with 2 common types of mutations including 52 bp deletetion (type 1) and 5 bp insertion (type 2) in exon 9
leading to the frameshift and several other rare mutations. We aim to establish a procedure of DNA
sequencing for CALR exon 9 and use for screening CALR mutations as an additional marker for diagnosis
of PMF patients in clinical practice.
* Bộ môn Huyết học - Đại học Y Dược TP.HCM; khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện Truyền máu
Huyết học TP.HCM
** Bộ môn Mô phôi; Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM.
Tác giả liên lạc: TS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932 728 115 Email:

322

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017


Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017

Nghiên cứu Y học

Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral blood samples of JAK2V617F- negative PMF
patients. Forward and reverse primers were designed to amplify specifically CALR exon 9. PCR products
were sequenced bidirectionally using Sanger’s technique on an ABI 3130 Genetic Analyzer system.
Result: The primers CALR-g8F and CALR-g9R were used to amplify exon 9 of CALR with optimal
annealing temperature at 550C. The analysis of DNA sequencing results showed that 7 out of 9 patients
(77.78%) carried CALR mutations, with 2 types of mutations including 52-bp deletion (c.1099_1150del)

and 5-bp insertion (c.1154_1155insTTGTC), both were in heterozygous status. The 52-bp deletion type was
the most common mutation, detected in 6 patients.
Conclusion: We have successfully established the DNA sequencing procedure for detection of CALR
exon 9 mutations, facilitating diagnosis of PMF in patients without JAK2V617F and MPLW515L/K
mutations.
Key words: Primary myelofibrosis, CALR gene, gene mutation, DNA sequencing.
protein với trọng lượng 46-kDa có 3 vùng cấu
ĐẶTVẤNĐỀ
trúc và chức năng bao gồm một vùng đầu tận
Nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy bao gồm
N gắn lectin, một vùng giàu proline chứa vị trí
bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, đa hồng cầu
tương tác Ca2+ có ái lực cao, và vùng đầu tận C
nguyên phát, tăng tiểu cầu nguyên phát và xơ
có tính acid. Calreticulin còn có vùng KDEL
tủy nguyên phát. Bệnh đặc trưng bởi tình
tại vị trí đầu tận C với nhiều vị trí gắn Ca2+ và
trạng tăng sinh quá mức các tế bào máu và các
mang nhiều vị trí gắn với bề mặt tế bào và với
giai đoạn biệt hóa của tế bào trong tủy xương
các yếu tố đông máu(3,4,6).
và máu ngoại biên(2). Xơ tủy nguyên phát có
Về mặt chẩn đoán, sinh thiết tủy và nhuộm
tủy xương bị xơ hóa, tăng sinh reticulin và gan
reticulin sẽ giúp chẩn đoán tình trạng xơ tủy
lách tạo máu thay tủy, đặc biệt là lách. Hầu hết
và mức độ xơ tủy, tuy nhiên cần tìm nguyên
các trường hợp xơ tủy nguyên phát đều có
nhân là xơ tủy nguyên phát hay thứ phát. Các
lách to lúc chẩn đoán và khoảng 50% trường

dấu ấn sinh học phân tử giúp các bác sĩ lâm
hợp có gan to. Trong nhóm bệnh tân sản tăng
sàng chẩn đoán được thể nguyên phát và có
sinh tủy có các đột biến gen giúp chẩn đoán
hướng điều trị phù hợp. Trong nghiên cứu
bệnh như nhiễm sắc thể Philadelphia gặp
này, chúng tôi thực hiện khảo sát đột biến
trong bạch cầu mạn dòng tủy và đột biến gen
CALR bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA,
JAK2V617F gặp trong đa hồng cầu nguyên
góp thêm 1 dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy
phát, tăng tiểu cầu nguyên phát và xơ tủy
nguyên phát trên lâm sàng.
nguyên phát với tỷ lệ tương ứng là 99%, 60%,
ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
60%(1). Ngoài ra, các đột biến tăng chức năng
liên quan gen MPL (MPLW515L/K) gặp trong
Đối tượng
5% trường hợp xơ tủy nguyên phát, còn lại
Nghiên cứu được thực hiện trên 10 bệnh
khoảng 40% trường hợp xơ tủy nguyên phát
nhân chẩn đoán xơ tủy nguyên phát theo tiêu
chưa phát hiện đột biến gen.
chuẩn của tổ chức y tế năm 2008 và không
Đến cuối năm 2013, hai nghiên cứu của
phát hiện đột biến JAK2 V617F.
Klampfl (5), Nangalia (Error! Reference source not found.) và
Phương pháp:
cộng sự đã xác định đột biến gen CALR mã
Tách chiết genomic DNA

hóa Calreticulin trên 20 – 30% bệnh nhân (BN)
xơ tủy nguyên phát không có đột biến gen
2 ml máu ngoại vi trong ống chống đông
JAK2 và MPL. Gen CALR nằm trên NST
có EDTA được lắc đều và tách chiết DNA
19p13.2 gồm 9 exon, tổng hợp Calreticulin

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017

323


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017

bằng QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ) theo
hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

Thiết kế mồi
Các đoạn mồi được thiết kế bằng phần
mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của
gen CALR mang mã số NM_004343 trong
GenBank (bảng 1).
Thực hiện PCR
Mỗi tube PCR có thể tích 15 l chứa các
thành phần gồm 1,5 µL 10X PCR buffer; 1,5 µL
dNTP 2,5 mM; 0,75 µL mồi xuôi và 0,75 µL
mồi ngược (10 M cho mỗi loại); 0,12 µL
TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara,

Nhật Bản) và 2 µL genomic DNA (50 - 100 ng).
Chu trình luân nhiệt được thực hiện trên máy
ABI 2700 (Apllied Biosystems, Mỹ). Sản phẩm
PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch
agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide và
quan sát dưới hệ thống chụp ảnh điện di
ChemiDoc (Biorad, Mỹ). Sản phẩm PCR sau
đó được tinh sạch bằng illustraTM GFXTM PCR
DNA and Gel Band Purification Kit (GE
Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng của nhà
sản xuất.
Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA
Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được
thực hiện phản ứng cycle sequencing với
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing
kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều
xuôi và ngược. Sản phẩm sau đó được kết tủa
bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formanide,
biến tính ở 95C trước khi làm lạnh đột ngột.
Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130
Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và
capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết
Bảng 1: Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu
Tên mồi
Dùng cho PCR
Dùng cho sequencing

CALR-g8F
CALR-g9R
CALR-g9F

KẾTQUẢVÀBÀNLUẬN
Xây dựng quy trình giải trình tự DNA
của gen CALR
Đột biến gen CALR gặp trong khoảng 25%
trường hợp xơ tủy nguyên phát và là đột biến
thường gặp sau JAK2V617F (5,7,8). Các đột biến
CALR gây ra các biến đổi liên quan trực tiếp
đến con đường truyền tín hiệu JAK-STAT và
là nhân tố tiên lượng độc lập về mức độ nguy
cơ(2,5,8). Khi xảy ra đột biến CALR, protein
calreticulin bị thay đổi ở vùng C-terminus và
làm mất vùng KDEL, dẫn tới sự tăng sinh bất
thường các dòng tế bào máu và sinh bệnh(7).
Khi phân tích về thời gian sống toàn bộ của
các trường hợp xơ tủy nguyên phát, nhiều
nghiên cứu đã cho thấy các BN mang đột biến
CALR có nguy cơ tử vong thấp hơn so với các
BN mang đột biến JAK2V617F hoặc MPL (3,8,9).
Gen CALR có nhiều kiểu đột biến khác nhau,
trong đó 2 kiểu đột biến thường gặp là mất
đoạn 52-bp và chèn 5-bp TTGTC nên sử dụng
kỹ thuật giải trình chuỗi DNA để phát hiện
các đột biến là cần thiết(8).
Trong nghiên cứu, chúng tôi thiết kế mồi
để khuếch đại vùng exon 9 của gen CALR
(bảng 1) là vị trí thường xảy ra các đột biến
làm thay đổi cấu trúc và chức năng của
protein calreticulin.

Trình tự chuỗi (5’-3’)
GAAACCCTGTCCAAAGCAAG
CAGGGCTGGACTGAGGCCTG
ACAACTTCCTCATCACCAACG

Cặp mồi CALR-g8F và CALR-g9R được
dùng để khuếch đại vùng exon 9 của gen
CALR với kích thước là 476 bp (hình 1). Sau

324

quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần
mềm CLC Main Workbench, so sánh với trình
tự chuẩn của gen CALR mang mã số
NM_004343 trong GenBank để xác định đột
biến gen.

Đoạn gen được khuếch đại
Exon 8 – 9 (476 bp)

khi thay đổi nhiệt độ bắt cặp mồi trong
khoảng 550C – 600C, chúng tôi chọn được nhiệt
độ thích hợp cho phản ứng khuếch đại là 550C.

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017


Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017

Nghiên cứu Y học

trường hợp). Trong 9 BN trên đã xác định âm
tính JAK2V617F thì có 7/9 trường hợp phát hiện
đột biến CALR, chiếm 77,78% với 2 kiểu đột biến
là mất đoạn 52 bp (c.1099_1150del) và đột biến
chèn thêm 5 bp (c.1154_1155insTTGTC), và các
đột biến đều ở dạng dị hợp tử (hình 2). Mất đoạn
52 bp gặp trong 6 BN và là kiểu đột biến thường
gặp nhất.

Hình 1: Khuếch đại exon 8 – 9 gen CALR. Giếng
1: Mẫu BN; giếng 2: chứng dương (476 bp); giếng
3: nước; giếng 4: 1kb DNA Ladder.
Sản phẩm khuếch đại được thực hiện giải
trình tự chuỗi DNA theo phương pháp Sanger
trên hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer. Kết
quả khuếch đại gen CALR của các mẫu phù
hợp với trình tự gen CALR từ dữ liệu genome.
Điều này cho thấy cặp mồi do chúng tôi thiết
kế đã khuếch đại đặc hiệu trình tự gen CALR
để phát hiện đột biến.

Kết quả giải trình tự DNA của gen CALR
trên mẫu BN xơ tủy nguyên phát
Ứng dụng quy trình kỹ thuật đã được thiết
lập ở trên để khảo sát đột biến gen CALR cho 9
BN được chẩn đoán xơ tủy nguyên phát
không mang đột biến gen JAK2V617F, chúng
tôi phát hiện 7 BN có đột biến và hầu hết là
đột biến mất đoạn (Bảng 2).

Bảng 2: Đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu
Mã nghiên cứu
PMF-01
PMF-02
PMF-03
PMF-04
PMF-05
PMF-06
PMF-07
PMF-08
PMF-09

Tuổi
30
60
50
32
77
38
61
83
42

Giới Tình trạng đột biến
Nữ c.1154_1155insTTGTC
Nữ
Không
Nữ
c.1099_1150del
Nữ

Không
Nữ
c.1099_1150del
Nữ
c.1099_1150del
Nam
c.1099_1150del
Nữ
c.1099_1150del
Nam
c.1099_1150del

Kết quả nghiên cứu ở bảng 2 cho thấy các
BN được chẩn đoán xơ tủy nguyên phát có
tuổi trung bình là 53 tuổi, thấp nhất là 30 tuổi
và cao nhất là 83 tuổi, và hầu hết là BN nữ (7/9

Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi đã
cho thấy rằng các trường hợp có mang đột
biến CALR chiếm tỷ lệ cao ở BN xơ tủy
nguyên phát âm tính JAK2V617F, trong đó đột
biến mất đoạn 52 bp là kiểu đột biến thường
gặp nhất, tương đồng với các nghiên cứu khác
trên thế giới(7,8,10). Nghiên cứu của Nangalia J
và cộng sự (2013) đã phát hiện đột biến CALR
xuất hiện ở 18/32 trường hợp xơ tủy nguyên
phát âm tính đột biến JAK2V617F, chiếm tỷ lệ
là 56,25%(7). Năm 2014, Rumi E và cộng sự
khảo sát trên 218 trường hợp xơ tủy nguyên
phát âm tính với JAK2V617F cho kết quả là

64,22% trường hợp mang đột biến CALR,
trong đó đột biến mất đoạn 52 bp chiếm 72%,
đột biến chèn đoạn 5 bp chiếm 16% và các đột
biến khác chiếm tỷ lệ thấp(8). Đồng thời Tefferi
A và cộng sự cũng đã công bố tỷ lệ các kiểu
đột biến CALR xuất hiện ở 113 BN xơ tủy
nguyên phát với 98 trường hợp (74,8%) là đột
biến mất đoạn 52 bp, 15 trường hợp (11,5%) là
kiểu đột biến chèn đoạn 5 bp, và 18 trường
hợp còn lại (13,7%) là các kiểu đột biến khác(10).
Việc phát hiện các kiểu đột biến khác nhau và
tỷ lệ đột biến tương đồng với các nghiên cứu
khác cho thấy kỹ thuật giải trình tự chuỗi
DNA trong nghiên cứu này phù hợp với việc
khảo sát đột biến CALR trên BN xơ tủy
nguyên phát. Kết quả trên cho thấy chúng tôi
đã xây dựng thành công quy trình giải trình tự
chuỗi DNA cho phân tích đột biến gen CALR,
giúp chẩn đoán chính xác xơ tủy nguyên phát
để điều trị phù hợp.

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017

325


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017

Hình 2: Đột biến CALR trên exon 9.
Dạng đột biến mất đoạn thường gặp
c.1099_1151del52 (A) và đột biến chèn
đoạn c.1154_1155insTTGTC (B).

6.

KẾTLUẬN
Kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phát
hiện các đột biến CALR đã được thiết lập trong
điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam,
giúp chẩn đoán và tiên lượng bệnh cho các BN
xơ tủy nguyên phát. Hơn nữa, nghiên cứu này
cũng cung cấp nền tảng để xây dựng cơ sở dữ
liệu riêng cho BN tại Việt Nam.

2.
3.

4.

5.

326

8.

9.

TÀILIỆUTHAMKHẢO

1.

7.

Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al (2005), Acquired
mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human
myeloproliferative disorders, Lancet, 365(9464):1054-61.
Campbell PJ, Green AR (2006), The myeloproliferative
disorders, N Engl J Med, 7;355(23):2452-66.
Chi J, Nicolaou KA, Nicolaidou V, et al (2014),
Calreticulin gene exon 9 frameshift mutations in patients
with thrombocytosis. Leukemia, 28(5):1152-4.
Gold LI, Eggleton P, Sweetwyne MT, et al (2010),
Calreticulin: non-endoplasmic reticulum functions in
physiology and disease, FASEB J, 24:665–83.
Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al (2013).
Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative
neoplasms. N Engl J Med, 369:2379–90.

10.

Kuwabara K1, Pinsky DJ, Schmidt AM, et al (1995),
Calreticulin, an antithrombotic agent which binds to
vitamin K-dependent coagulation factors, stimulates
endothelial nitric oxide production, and limits thrombosis
in canine coronary arteries, J Biol Chem. Apr
7;270(14):8179-87.
Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al (2013), Somatic
CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with
nonmutated JAK2, N Engl J Med;369: 2391–405.

Rumi E, Pietra D, Pascutto C, et al (2014), Clinical effect of
driver mutations of JAK2, CALR, or MPL in primary
myelofibrosis, Blood, 124(7):1062-9.
Mario Cazzola, Robert Kralovics (2014), From Janus
kinase 2 to calreticulin: the clinically relevant genomic
landscape of myeloproliferative neoplasms, Blood,
123:3714-3719.
Tefferi A, Lasho TL, Tischer A, et al (2014), The prognostic
advantage of calreticulin mutations in myelofibrosis
might be confined to type 1 or type 1-like CALR variants,
Blood, 2014, 124:2465-2466.

Ngày nhận bài báo:

06/03/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

15/03/2016

Ngày bài báo được đăng:

05/04/2017

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017