Xác định tính đa hình thái đơn Pro47ser gen P53 trên bệnh nhân ung thư phổi bằng kỹ thuật giải trình tự gen

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014

XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN PRO47SER GEN P53
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN
Trần Khánh Chi, Trần Vân Khánh, Nguyễn Đức Hinh,
Nguyễn Thị Hà, Lê Văn Hưng, Tạ Thành Văn, Trần Huy Thịnh
Trư ng
H YH N
Ngh n
ư th h n
ụ t
nh t nh
h nh th
ơn t
tr
n 4 (Pr 4
r)
g n 5
nh nh n ng thư h
ng hương h g tr nh t g n 1 0 nh nh n ng thư h
9 ngư
h ng
nh ng thư ư
h n
ngh n
th t g tr nh t g n
ư
ụng
nh NP Pr 4
r
(P4 )

g n 5
t
h ng h t h n ư
n
g n Pr rt
tr
n4
g n 5
tr n
2 nh
ngh n
Từ khóa: ung thư phổi, đa hình thái đơn nucleotid Pro47Ser, gen p53

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Gen áp chế ung thư p53 (OMIM, 191170) nằm tại vị
trí p13.3 trên NST số 17, mã hoá protein p53 với 393
acid amin, có trọng lượng phân tử 53kDa [1]. Đột biến
gen p53 gặp ở 50 - 70% ung thư ở người. Ước tính
có 85 đa hình thái và 27.580 đột biến soma trên gen
p53 đã được biết đến [2]. Một số đa hình thái gen p53
có liên quan đến khuynh hướng dễ mắc bệnh ung thư
do làm tăng tính nhạy cảm với bệnh. Các biến đổi của
gen như đột biến hay đa hình thái làm mất chức năng
và bất hoạt vai trò của protein p53 dẫn đến phát sinh
ung thư. Nhiều đa hình thái của gen đã được phát hiện
trên vùng không mã hoá và vùng mã hoá trong đó đa
số là các đa hình thái đơn Nucleotid (Single Nucleotide
Polymorphisms-SNP)[3,4].
Đa hình Pro47Ser nằm trên vùng exon 4 của gen
p53. Đa hình codon 47 là sự thay thế acid amin prolin

bằng serin tại vị trí codon 47 do biến đổi nucleotid từ C
- T, được xác định đầu tiên bởi Felley – Bosco năm
1993. Các biến thể đa hình Ser47 là rất hiếm, với tần
số alen ít hơn 5% trong dân số có nguồn gốc châu Phi
[5,6]. Trong điều kiện bình thường, dưới tác động của
protein p38 và (homeodomain - interacting protein kinase 2) HIPK2, p53 được phosphoryl hóa tại vị trí Ser46
dẫn đến sự tăng cường sao chép các gen liên quan đến
quá trình apoptosis. Và khi alen p53 - Pro47 được thay
thế bởi alen p53 - Ser47 sự phosphoryl hóa tại vị trí
Ser46 bị giảm sút làm giảm hoạt tính tác động lên các
gen đích của quá trình apoptosis và tăng khả năng mắc
h n h Tr n h nh Ch
h YH N
h h
g
Ng nh n 2
2014
Ng
h th n 1 11 2014

nH

nh trư ng

ung thư. Tuy nhiên, mối tương quan giữa tính đa hình
thái của SNP P47S gen p53 với nhiều loại ung thư trong
đó có ung thư phổi chưa được khẳng định nhất quán
trên các quần thể nghiên cứu khác nhau [7; 8].
Nhằm góp phần nghiên cứu về đặc điểm gen người
Việt Nam trong mối liên quan đến bệnh ung thư phổi,

đề tài này được thực hiện với mục tiêu: Xác định tính
đa hình thái đơn tại vị trí codon 47 (SNP P47S) của gen
p53 trên bệnh nhân ung thư phổi bằng phương pháp
giải trình tự gen.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
- 170 mẫu máu của bệnh nhân ung thư phổi nguyên
phát tại trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học Hạt nhân và
Ung bướu - bệnh viện Bạch Mai, được chẩn đoán xác
định bằng xét nghiệm mô bệnh học.
- 97 mẫu máu của người không mắc bệnh ung thư được
lựa chọn tại khoa Khám bệnh - bệnh viện Bạch mai
- Hóa chất dùng trong nghiên cứu của các hãng QIAGEN, Sigma, Fermentas.
2. Quy trình nghiên cứu
- Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu máu theo phương
pháp sử dụng enzym protease K và phenol: chloroform:
isoamyl alcohol.
- Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng
phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% và đo mật
độ quang tại bước sóng 260/280 nm.
- Khuếch đại vùng gen chứa codon 47 trên exon 4 gen
p53 bằng phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi đặc
hiệu:
F: 5’ - CGT TCT GGT AAG GAC AAG GG – 3’
R: 5’-CAC TGA CGA GAA GCC AAA GG – 3’
1


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014

+ Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10μl) gồm: 1X
đệm PCR; 2,5mM dNTP, 0,2μMmồi xuôi và ngược,
0,5U Taq polymerase, 20-50ng DNA và H2O.
+ Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC/5 phút,
35 chu kỳ [94oC/40 giây, 54oC/30 giây, 72oC/45 giây],
72oC/7 phút. Bảo quản mẫu ở 15oC.
- Giải trình tự gen: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen
chứa codon 47 trên exon 4 của gen p53 bằng kỹ thuật
giải trình tự gen theo quy trình thường quy của trung
tâm Nghiên cứu Gen - Protein.
+ Thành phần phản ứng giải trình tự (thể tích 20μl)
gồm: Đệm 3μl, BigDye 2μl, mồi xuôi hoặc ngược 1μl,
20 - 50ng DNA và nước

phút, 25 chu kỳ [96oC/10 giây, 54oC/5 giây, 60oC/4 phút].
Bảo quản mẫu ở 15oC
+ So sánh kết quả thu được với trình tự gen p53 trên
Genbank (NG_017013).
3. Đạo đức trong nghiên cứu
Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào
nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu
khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Các
thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.

III. KẾT QUẢ
1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu

+ Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: 96oC/1

Bảng 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu

Tuổi

UTP (n1 = 170)

Chứng (n2 =97)

Min

33

47

Max

86

87

59,96 ± 9,72

66,42 ± 8,19

X ± SD

Giới

n

%

n

%

Nam

115

67,6

55

56,7

Nữ

55

32,4

42

43,3

- Bệnh nhân trẻ tuổi nhất là 33 tuổi, lớn tuổi nhất là 86 tuổi, trung bình là 59,96 ± 9,72 tuổi
- Tỷ lệ nam/nữ là 2,09/1.
- Nhóm chứng trẻ tuổi nhất là 47 tuổi, lớn tuổi nhất là 87 tuổi, tuổi trung bình 66,42 ± 8,19
2. Kết quả xác định SNP Pro47Ser trên gen p53
Khuếch đại vùng gen mang SNP Pro47Ser trên gen p53

M
1
2 3
4 5
6 7
8
9 10 11

511pb

Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mang SNP Pro47Ser trên gen p53.
M: Thang chuẩn 100b; 1÷5: sản phẩm PCR của nhóm chứng; 6÷11: sản phẩm PCR của bệnh
nhân ung thư phổi
2


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
Sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt, gồm 1 băng có kích thước đặc hiệu là 511bp.
3. Kết quả giải trình tự xác định kiểu gen SNP Pro47Ser gen p53

Hình 2. Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen chứa codon 47 của gen p53 (a mẫu bệnh),
(b mẫu chứng: đồng hợp tử CCG (Prolin))
Kết quả giải trình tự DNA của bệnh nhân cho phép xác định được kiểu gen tại vị trí codon 47 của gen p53.
Bảng 2. Tần số alen và kiểu gen SNP Pro47Ser của gen p53
trên DNA các mẫu nghiên cứu
n = 267
Alen/Kiểu gen

Nhóm bệnh

Nhóm chứng

n1 = 70

%

n2 = 97

%

C(Prolin)

340

100

194

100

T(Serin)

0

0

0

0

170

100

97

100

CT(Prolin/Serin)

0

0

0

0

TT(Serin/Serin)

0

0

0

0

CC (Prolin)

Tất cả các mẫu nghiên cứu bao gồm cả nhóm bệnh và nhóm chứng đều có kiểu alen Prolin (CCG) và kiểu gen
Prolin/Prolin

IV. BÀN LUẬN
Nghiên cứu được thực hiện trên 170 bệnh nhân ung
thư phổi với tuổi mắc bệnh trẻ nhất là 33, cao nhất là 86
và tuổi trung bình là 59,96 ± 9,72. 97 người không mắc
bệnh ung thư được xác định tính đa hình thái codon 47
gen p53 để đối chứng. Kết quả nghiên nghiên cứu trên
nhóm bệnh nhân ung thư phổi phù hợp với ghi nhận
của một số nghiên cứu trong nước và thấp hơn so với
một số nghiên cứu trên thế giới. Theo Ngô Quý Châu
và cộng sự (2012), tuổi trung bình của bệnh nhân ung
thư phổi là 58,9 ± 8,6[9]. Yang P. và CS (2005) nghiên
cứu các đặc điểm lâm sàng trên 5628 bệnh nhân ung
thư phổi được chẩn đoán từ 1997 đến 2003 tại Mayo
Clinic đã ghi nhận tuổi trung bình của bệnh nhân là 65,4
± 11,0 [10]. Tuổi mắc bệnh được xác định là khác nhau
giữa các khu vực địa lý, chủng tộc và điều kiện sống
[11].

Các nghiên cứu về dịch tễ học trên thế giới cũng
như ở Việt Nam đều khẳng định ung thư phổi phổ biến
hơn ở nam giới. Nghiên cứu này gồm 115 bệnh nhân
nam giới (67,6%) và 55 bệnh nhân nữ giới (32,4%), tỷ lệ
nam/nữ là 2,1/1. Kết quả thu được phù hợp với nghiên
cứu của Ngô Quý Châu và cộng sự (2012), bệnh nhân
nam giới chiếm 73,3%, tỷ lệ nam/nữ là 2,75/1 [9]. Theo
ghi nhận về tình hình ung thư năm 2007, ước tính có
khoảng 1.549.121 trường hợp ung thư phổi mới phát

hiện trên toàn thế giới, trong đó nam giới chiếm 71,6%,
tỷ lệ nam/nữ là 2,5/1 [11].
Mặc dù mối tương quan giữa đa hình codon 47 và
ung thư phổi đã cómột số tác giả nghiên cứu, tuy nhiên
vì là một đa hình hiếm và chưa có nhiều công bố nên
chưa cho thấy được mối tương quan giữa SNP P47S
với ung thư phổi. Trong nghiên cứu này, kết quả giải
trình tự gen cho thấy đoạn gen khuếch đại exon 4 gen
p53 là đặc hiệu, chính xác và cho phép xác định được
3


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
kiểu gen tại vị trí codon 47. Với kết quả xác định tính
đa hình thái đơn codon 47 trên 170 bệnh nhân ung thư
phổi và 97 người không mắc ung thư đối chứng thấy
100% có kiểu gen đồng hợp tử Pro/Pro. Kết quả này
phù hợp với nghiên cứu của Auer và cộng sự năm 1999
khi toàn bộ 64 bệnh nhân ung thư phổi nghiên cứu đều
có kiểu gen đồng hợp tử Pro/Pro [12]. Nghiên cứu của
Felley - Bosco và cộng sự năm 1993 trên 101 bệnh
nhân ung thư phổi ghi nhận được 3 trường hợp có kiểu
gen Pro/Ser ở người Mỹ gốc Phi và không tìm thấy trên
người da trắng [5]. Nhiều nghiên cứu về tính đa hình
thái đơn codon 47 cũng được tiến hành trên các đối
tượng nghiên cứu khác nhau, tuy nhiên tần suất gặp
alen Ser47 rất thấp. Năm 2008, Siraj và cộng sự tiến
hành nghiên cứu trên 223 bệnh nhân ung thư tuyến
giáp và 229 đối chứng người Ả Rập nhưng không ghi
nhận được alen Ser47 [13]. Tương tự, nghiên cứu trên

100 bệnh nhân ung thư vú và 100 đối chứng người Ả
Rập của Al-Qasem thấy 100% đối tượng nghiên cứu
đều có kiểu gen đồng hợp tử Pro/Pro [14]. Sameer và
cộng sự nghiên cứu trên 226 bệnh nhân ung thư đại
trực tràng và 156 người đối chứng người Kashmir. Kết
quả nghiên cứu này ghi nhận được 5 trường hợp bệnh
nhân, 4 trường hợp đối chứng có kiểu gen đồng hợp tử
Ser/Ser, tuy nhiên không thấy mối liên quan giữa tính
đa hình thái đơn codon 47 với bệnh ung thư đại trực
tràng [15]. Nghiên cứu của Jaiswal năm 2011 ở Bắc
Ấn Độ trên 181 bệnh nhân ung thư bàng quang và 176
đối chứng ghi nhận được 6% nhóm bệnh, 3,5% nhóm
chứng có kiểu gen dị hợp tử Pro/Ser, 3,5% nhóm bệnh
và 8,5% nhóm chứng có kiểu gen đồng hợp tử Ser/Ser.
Sự xuất hiện của alen Ser47 ở các nghiên cứu này có
thể do đặc điểm chủng tộc.

đề tài nhánh cấp nhà nước “Đánh giá sự phân bố kiểu
gen của một số gen liên quan đến ung thư phổi và ung
thư gan” thuộc đề tài nhiệm vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc
điểm di truyền người Việt Nam”. Nhóm nghiên cứu trân
trọng cảm ơn trung tâm Hô Hấp, trung tâm Y học Hạt
nhân và Ung bướu - bệnh viện Bạch Mai, trung tâm
Gen - Protein đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình
nghiên cứu.

Hiện nay, hầu hết bệnh ung thư vẫn còn là thách
thức lớn đối với Y học thế giới, phần lớn bệnh nhân tử
vong hoặc để lại hậu quả nặng nề cho gia đình và xã
hội. Đối với bệnh ung thư phổi, các nhà khoa học trên

thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu tìm ra liệu pháp
gen điều trị hiệu quả bệnh ung thư phổi. Do đó, phát
hiện sớm và phòng ngừa các yếu tố nguy cơ vẫn là
những biện pháp tốt nhất nhằm giảm thiểu tỷ lệ bệnh
ung thư phổi ở Việt Nam và trên toàn Thế giới.

7. Li X., Dumont P., Pietra A.D,. et al (2005). The codon 47 polymorphism in p53 is functionally significant,
Ch
280, 24245 - 24251.

V. KẾT LUẬN
100% đối tượng nghiên cứu đều mang kiểu gen
đồng hợp tử Pro47Pro của gen p53.

Lời cảm ơn
Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của
4

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. McBride O.W., D.Mery and D. Givol (1986). The
gene for human p53 cellular tumor antigen is located on
chromosome 17 short arm (17p13). Pr
N t
, 83, 130 - 134.
2. Hollstein M., D. Sidransky, B. Vogelstein et al.
(1991). P53 mutations in human cancers.
n , 253:
49 - 53.
3. Costa S., D. Pinto, D. Pereira et al. (2008). Importance of TP53 codon 72 and intron 3 duplication 16bp
polymorphisms in prediction of susceptibility on breast

cancer.
C C n r 8, 8 - 32.
4. Whibley C, Pharoah PD and Hollstein M (2009).
p53 polymorphisms: cancer implications. N t
C n r 9: 95 - 107.
5. Felley-Bosco E, Weston A, Cawley HM, Bennett
WP, et al. (1993). Functional studies of a germ-line
polymorphism at codon 47 within the p53 gene.
H
n t 53, 752 - 759.
6. Pietsch EC, Humbey O and Murphy ME (2006).
Polymorphisms in the p53 pathway. n g n 25:
1602 - 1611.

8. Feng L., Hollstein M. and Xu Y., (2006). Ser46
phosphorylation regulates p53-dependent apoptosis
and replicative senescence. C C
5, 2812 - 2819.
9. Ngô Quý Châu, Lê Hoàn, Nguyễn Thanh Phương
(2012). “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm
sàng ung thư phổi nguyên phát di căn sọ não tại Trung
tâm Hô Hấp- Bệnh viện Bạch Mai”, T
h Yh
ng 68, 30 - 34
10. Yang P., Allen M.S., Marie C. Aubry M.C., et al.
(2005). Clinical Features of 5,628 Primary Lung Cancer
Patients: Experience at Mayo Clinic From 1997 to 2003,
Ch t 128, 452 - 462.
11. American Cancer Society (2007).
t

g r 200

C n

r


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
12. Auer H., Warncke K., Nowak D. Et al., (1999). Variations of p53 in cultured fibroblast of patients with lung
cancer who have a presumed genetic predisposition,
C n n
22, 278 - 282.

14. Al-Qasem A., Toulimat M., Tulbah A. Et al.,
(2012). The p53 codon 72 polymorphism is associated
with the risk and early onset of breast cancer among
Saudi women, n
tt 3, 875 - 878

13. Siraj A.K., Al-Rasheed M., Ibrahim M. et al.,
(2008). RAD52 polymorphisms contribute to the development of papillary thyroid cancer susceptibility in Middle Eastern population,
n
rn
n
t 31,893899.

15. Sameer A. S., Shah Z. A., Syeed N. Et al., (2010).
TP53 Pro47Ser and Arg72Pro polymorphisms and colorectal cancer prdisposition in an ethnic Kashmiri population,
n t
9, 651 - 660.

Summary
DETERMINATION OF PRO47SER POLYMOPHISM OF P53 GENE IN LUNG
CANCER PATIENTS SEQUENCING METHOD
This study was conducted to determine Pro47Ser polymorphism of p53 gene in lung cancer patients by sequencing
method.170 lung cancer patients and 97 controls were selected for this study. The sequencing method was used to
analyze Pro47Ser polymorphism in p53 gene. Results: we did not find any P47S polymorphism of p53 gene in both
lung cancer patient group and control group.
Keywords: Lung cancer, Pro47Ser polymorphism, p53 gene

5