Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính kháng kháng sinh của Neisseria meningitidis tại các ổ dịch lưu hành trong quân đội

                                                           LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm  ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh Học­Trường  
Đại Học Khoa Học Tự Nhiên­Đại Học Quốc Gia Hà Nội, đã hết lòng tạo  
điều kiện để  chúng tôi có thể  học tập tốt và đạt được những thành quả 
như ngày hôm nay.
Đặc biệt, với lòng biết  ơn sâu sắc, tôi xin gửi lơi cam 
̀ ̉ ơn tơi th
́ ầy  
hướng dẫn TS.  Đoàn  Trọng Tuyên và GS.TS. Phạm Văn Ty đa tân tâm
̃ ̣
 
hương dân, giup đ
́
̃
́ ỡ, tao điêu kiên thuân l
̣
̀
̣
̣ ợi đê tôi hoan thanh luân văn tôt
̉
̀
̀
̣
́ 
nghiêp.
̣
Tôi cung xin g
̃
ửi lơi cam 
̀ ̉ ơn chân thanh nhât đên can bô nhân viên cua

̀
́ ́ ́ ̣
̉  
khoa Vi sinh Vật viên Y h
̣
ọc Dự  phòng Quân đội va Lanh đao ch
̀ ̃
̣
ỉ  huy viện 
đa giup đ
̃ ́ ỡ va tao điêu kiên đê tôi thu th
̀ ̣
̀
̣
̉
ập số liệu, thực hiện nghiên cứu và 
hoan thanh lu
̀
̀
ận văn tôt nghiêp.
́
̣
Xin gửi tới Ban lãnh đạo Bệnh viện Phổi Hà Nội lời cảm ơn sâu sắc  
đã tạo điều kiện về thời gian để tôi có thể hoàn thành khóa học này.
Một lần nữa, tôi xin gửi lời cảm  ơn tới các thầy cô, bạn bè và toàn 
bộ những người thân trong gia đình đã luôn giúp đỡ nhiệt tình và động viên  
tôi trong suốt quá trình học tập.
Học Viên

Vũ Thị Xuân Thu

                                                          MỤC LỤC
                                                          MỤC LỤC........................................................................2
DANH MỤC HÌNH................................................................................................................6
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................1
NMC:   Não mô cầu................................................................................................................1
VMN:  Viêm màng não...........................................................................................................1
PS:   Polysaccharide................................................................................................................1
LOS:   Lipo – oligosaccharide..................................................................................................1
LPS:   Lipopolysaccharide.......................................................................................................1
MỞ ĐẦU................................................................................................................................1
Chương 1................................................................................................................................3
TỔNG QUAN.........................................................................................................................3
1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh viêm màng não do Neisseria meningitidis.......3
1.1.1.Dịch tễ học của bệnh viêm màng não ................................................................4
1.1.2.Dịch tễ học người mang mầm bệnh không triệu chứng....................................5
1.2. Đặc điểm sinh học của N. meningitidis....................................................................6
1.2.1.Danh pháp và phân loại Não mô cầu [32]............................................................6
Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy[63]....................................7
1.2.2. Tính chất nuôi cấy...............................................................................................7
Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. [63]...............................................8
Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu. [63]......................................................9
1.2.3. Sức đề kháng.......................................................................................................9
Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.[18]............................................9
1.3. Các kỹ thuật chẩn đoán phòng thí nghiệm..............................................................11
Hình 1.5: Hình ảnh nuôi cấy N. meningitidis trên môi trường thạch chocolate có kháng sinh
..............................................................................................................................................12
Hình1.6: Hình ảnh định danh N. meningitidis trên thanh định danh API NH.........................12
Hình 1.7 : Hình ảnh bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis.................................14

    1.3.5. Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn gây viêm màng não ...........14
1.4.  Đặc điểm gene đích phát hiện N. meningitidis......................................................15
Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên của N. meningitidis....................................16
1.5. Đặc điểm gene đích (gen đặc hiệu) xác định nhóm huyết thanh của N. 
meningitidis......................................................................................................................17
Hình 1.9 : Bản đồ gene capsule (CPS) của Nmen (14), ctrABCD operon mã hóa ATP­protein 
(khung kẻ ô). SynABC(màu ghi), D/E/F/G (chấm), sacABCD (sọc ngang), xcbABC (gạch 
chéo), mã hóa  nhóm huyết thanh­specific enzymes cho tổng hợp capsule . oatC (nhóm huyết 
thanh C) và oatWY (nhóm  huyết thanh  W135 và Y), kết hợp sao chép cùng với syn operons 
và mã hóa O­acetyltransferases. lipA và lipB  mã hóa protein. ctrE and ctrF được biết như 
LipA và LipB........................................................................................................................20
1.6. Đáp ứng miễn dịch...................................................................................................20


Bảng 1.3 . Protein màng ngoài của N. meningitidis...............................................................21
1.7. Điều trị và dự phòng.................................................................................................22
Bảng 1.4. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán, điều trị nhiễm N. meningitidis...........................22
Chương 2..............................................................................................................................25
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................25
2.1. Đối tượng ................................................................................................................25
2.2. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................................25
2.2.1.Thiết bị................................................................................................................25
2.2.2. Sinh phẩm..........................................................................................................25
2.3. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................26
2.3.1. Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang.......................................................26
2.3.2. Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm:.......................................26
Hình 2.1   : Thiết kế nghiên cứu đặc điểm sinh học của N. meningitidis.............................27
Bảng 2. 1. Các hóa chất gắn trong các giếng của thẻ định danh NH....................................27
Bảng 2.2:  Trình tự mồi khảo sát phát hiện gene đích của N. meningitidis và các nhóm  
huyết thanh  (A; B; C)...........................................................................................................32

Hình 2.2. Thanh E test...........................................................................................................35
Hình 2.3. Kết quả thử nghiệm MIC bằng E test...................................................................35
Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và chuẩn thức 
phòng thí nghiệm (CLSI) năm 2013[]...................................................................................35
Chương 3..............................................................................................................................37
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN........................................................................37
3.1. Đặc điểm sinh học và cơ cấu nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis phân 
lập tại một số đơn vị tân binh trong quân đội................................................................37
3.1.1. Đặc điểm sinh học của chủng Neisseria meningitidis phân lập tại các đơn vị 
tân binh trong quân đội ...............................................................................................37
Bảng 3.1. Đặc điểm chuyển hóa axit amin của N.meningitidis............................................37
theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH......................................................................37
Bảng 3.2. Đặc điểm chuyển hóa đường của  N.meningitidis...............................................38
theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH ......................................................................38
theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH..........................................................39
Bảng 3.4. Đặc điểm chuyển hóa đường của  N.meningitidis...............................................39
 theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH.........................................................39
3.1.2. Cơ cấu nhiễm Neisseria meningitidis và các nhóm huyết thanh của các chủng 
Neisseria meningitidis phân lập tại các đơn vị tân binh trong quân đội bằng phương 
pháp PCR......................................................................................................................40
Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh..............................................40
lưu hành tại 03 đơn vị giám sát.............................................................................................40
Bảng 3.6: Tần suất nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh.........................................41
theo trung đoàn......................................................................................................................41
Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh theo địa phương nhập ngũ....43
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra chủng N. meningitidis trên thanh NH và...................................45
cơ cấu nhóm huyết thanh bằng kỹ thuật Multiplex­PCR.....................................................45


3.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học phân tử của các chủng N.meningitidis phân lập 

được bằng các cặp mồi đặc hiệu loài và nhóm N.meningitidis thông qua phản ứng 
PCR..............................................................................................................................47
Lựa chọn 32 trong tổng số 61 chủng đã phân lập được ở trên tiến hành khảo sát 
đặc điểm sinh học phân tử bằng các cặp mồi đặc hiệu cho loài và nhóm 
N.meningitidis .............................................................................................................47
Hình 3.1: Khảo sát gene CtrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................48
Hình 3.2: Khảo sát gene ctrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................49
Hình 3.3: Tiếp tục khảo sát sự xuất hiện của gen ctrA trên 32 chủng ................................50
N. meningitidis......................................................................................................................50
Hình 3.4:  Kết quả khảo sát sự có mặt của gene Por A trên 32 chủng ................................51
N. meningitidis phân lập được..............................................................................................51
Hình 3.5: Khảo sát gene CrgA mã hóa LysR của N. meningitidis trên 32..............................52
             Hình 3.6: Khảo sát gene SodC trên 32 chủng N. meningitidis ..................................53
Khảo sát bằng các cặp mồi phát hiện nhóm N. Meningitidis...............................................54
Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm A của N. meningitidis [31]..................54
Hình 3.7 : Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A, ..................55
Hình 3.8: Khảo sát gene siaDb phát hiện N. meningitidis nhóm B........................................56
Khảo sát cự có mặt của gene siaDc  phát hiện nhóm huyết thanh C của N. meningitidis [31].
..............................................................................................................................................56
Hình 3.9: Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm C........................................57
3.2. Đánh giá sự nhậy cảm với kháng sinh của các chủng N. meningitidis nhóm huyết 
thanh B và C.....................................................................................................................57
Bảng 3.9: Xác định MIC của chủng Neisseria meningitidis, ................................................57
nhóm huyết thanh B (n=23)..................................................................................................57
Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................59
 N. meningitidis, nhóm huyết thanh B...................................................................................59
Bảng 3.11 : Xác định MIC (in vitro) của chủng Neisseria meningitidis, ...............................59
 nhóm huyết thanh C (n=4)...................................................................................................59
Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................60
 N. meningitidis, nhóm huyết thanh C...................................................................................60

KẾT LUẬN...........................................................................................................................62
PHỤ LỤC.............................................................................................................................76


DANH MỤC BẢNG
                                                          MỤC LỤC........................................................................2
DANH MỤC HÌNH................................................................................................................6
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................1
NMC:   Não mô cầu................................................................................................................1
VMN:  Viêm màng não...........................................................................................................1
PS:   Polysaccharide................................................................................................................1
LOS:   Lipo – oligosaccharide..................................................................................................1
LPS:   Lipopolysaccharide.......................................................................................................1
MỞ ĐẦU................................................................................................................................1
Chương 1................................................................................................................................3
TỔNG QUAN.........................................................................................................................3
Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy[63]....................................7
Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. [63]...............................................8
Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu. [63]......................................................9
Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.[18]............................................9
Hình 1.5: Hình ảnh nuôi cấy N. meningitidis trên môi trường thạch chocolate có kháng sinh
..............................................................................................................................................12
Hình1.6: Hình ảnh định danh N. meningitidis trên thanh định danh API NH.........................12
Hình 1.7 : Hình ảnh bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis.................................14
Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên của N. meningitidis....................................16
Hình 1.9 : Bản đồ gene capsule (CPS) của Nmen (14), ctrABCD operon mã hóa ATP­protein 
(khung kẻ ô). SynABC(màu ghi), D/E/F/G (chấm), sacABCD (sọc ngang), xcbABC (gạch 
chéo), mã hóa  nhóm huyết thanh­specific enzymes cho tổng hợp capsule . oatC (nhóm huyết 
thanh C) và oatWY (nhóm  huyết thanh  W135 và Y), kết hợp sao chép cùng với syn operons 
và mã hóa O­acetyltransferases. lipA và lipB  mã hóa protein. ctrE and ctrF được biết như 

LipA và LipB........................................................................................................................20
Bảng 1.3 . Protein màng ngoài của N. meningitidis...............................................................21
Bảng 1.4. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán, điều trị nhiễm N. meningitidis...........................22
Chương 2..............................................................................................................................25
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................25
Hình 2.1   : Thiết kế nghiên cứu đặc điểm sinh học của N. meningitidis.............................27
Bảng 2. 1. Các hóa chất gắn trong các giếng của thẻ định danh NH....................................27
Bảng 2.2:  Trình tự mồi khảo sát phát hiện gene đích của N. meningitidis và các nhóm  
huyết thanh  (A; B; C)...........................................................................................................32
Hình 2.2. Thanh E test...........................................................................................................35
Hình 2.3. Kết quả thử nghiệm MIC bằng E test...................................................................35
Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và chuẩn thức 
phòng thí nghiệm (CLSI) năm 2013[]...................................................................................35
Chương 3..............................................................................................................................37
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN........................................................................37
Bảng 3.1. Đặc điểm chuyển hóa axit amin của N.meningitidis............................................37
theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH......................................................................37
Bảng 3.2. Đặc điểm chuyển hóa đường của  N.meningitidis...............................................38


theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH ......................................................................38
theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH..........................................................39
Bảng 3.4. Đặc điểm chuyển hóa đường của  N.meningitidis...............................................39
 theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH.........................................................39
Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh..............................................40
lưu hành tại 03 đơn vị giám sát.............................................................................................40
Bảng 3.6: Tần suất nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh.........................................41
theo trung đoàn......................................................................................................................41
Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh theo địa phương nhập ngũ....43
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra chủng N. meningitidis trên thanh NH và...................................45

cơ cấu nhóm huyết thanh bằng kỹ thuật Multiplex­PCR.....................................................45
Hình 3.1: Khảo sát gene CtrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................48
Hình 3.2: Khảo sát gene ctrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................49
Hình 3.3: Tiếp tục khảo sát sự xuất hiện của gen ctrA trên 32 chủng ................................50
N. meningitidis......................................................................................................................50
Hình 3.4:  Kết quả khảo sát sự có mặt của gene Por A trên 32 chủng ................................51
N. meningitidis phân lập được..............................................................................................51
Hình 3.5: Khảo sát gene CrgA mã hóa LysR của N. meningitidis trên 32..............................52
             Hình 3.6: Khảo sát gene SodC trên 32 chủng N. meningitidis ..................................53
Khảo sát bằng các cặp mồi phát hiện nhóm N. Meningitidis...............................................54
Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm A của N. meningitidis [31]..................54
Hình 3.7 : Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A, ..................55
Hình 3.8: Khảo sát gene siaDb phát hiện N. meningitidis nhóm B........................................56
Khảo sát cự có mặt của gene siaDc  phát hiện nhóm huyết thanh C của N. meningitidis [31].
..............................................................................................................................................56
Hình 3.9: Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm C........................................57
Bảng 3.9: Xác định MIC của chủng Neisseria meningitidis, ................................................57
nhóm huyết thanh B (n=23)..................................................................................................57
Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................59
 N. meningitidis, nhóm huyết thanh B...................................................................................59
Bảng 3.11 : Xác định MIC (in vitro) của chủng Neisseria meningitidis, ...............................59
 nhóm huyết thanh C (n=4)...................................................................................................59
Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................60
 N. meningitidis, nhóm huyết thanh C...................................................................................60
KẾT LUẬN...........................................................................................................................62
PHỤ LỤC.............................................................................................................................76

DANH MỤC HÌNH
                                                          MỤC LỤC........................................................................2
DANH MỤC HÌNH................................................................................................................6

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................1
NMC:   Não mô cầu................................................................................................................1
VMN:  Viêm màng não...........................................................................................................1
PS:   Polysaccharide................................................................................................................1


LOS:   Lipo – oligosaccharide..................................................................................................1
LPS:   Lipopolysaccharide.......................................................................................................1
MỞ ĐẦU................................................................................................................................1
Chương 1................................................................................................................................3
TỔNG QUAN.........................................................................................................................3
Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy[63]....................................7
Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. [63]...............................................8
Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu. [63]......................................................9
Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.[18]............................................9
Hình 1.5: Hình ảnh nuôi cấy N. meningitidis trên môi trường thạch chocolate có kháng sinh
..............................................................................................................................................12
Hình1.6: Hình ảnh định danh N. meningitidis trên thanh định danh API NH.........................12
Hình 1.7 : Hình ảnh bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis.................................14
Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên của N. meningitidis....................................16
Hình 1.9 : Bản đồ gene capsule (CPS) của Nmen (14), ctrABCD operon mã hóa ATP­protein 
(khung kẻ ô). SynABC(màu ghi), D/E/F/G (chấm), sacABCD (sọc ngang), xcbABC (gạch 
chéo), mã hóa  nhóm huyết thanh­specific enzymes cho tổng hợp capsule . oatC (nhóm huyết 
thanh C) và oatWY (nhóm  huyết thanh  W135 và Y), kết hợp sao chép cùng với syn operons 
và mã hóa O­acetyltransferases. lipA và lipB  mã hóa protein. ctrE and ctrF được biết như 
LipA và LipB........................................................................................................................20
Bảng 1.3 . Protein màng ngoài của N. meningitidis...............................................................21
Bảng 1.4. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán, điều trị nhiễm N. meningitidis...........................22
Chương 2..............................................................................................................................25
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................25

Hình 2.1   : Thiết kế nghiên cứu đặc điểm sinh học của N. meningitidis.............................27
Bảng 2. 1. Các hóa chất gắn trong các giếng của thẻ định danh NH....................................27
Bảng 2.2:  Trình tự mồi khảo sát phát hiện gene đích của N. meningitidis và các nhóm  
huyết thanh  (A; B; C)...........................................................................................................32
Hình 2.2. Thanh E test...........................................................................................................35
Hình 2.3. Kết quả thử nghiệm MIC bằng E test...................................................................35
Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và chuẩn thức 
phòng thí nghiệm (CLSI) năm 2013[]...................................................................................35
Chương 3..............................................................................................................................37
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN........................................................................37
Bảng 3.1. Đặc điểm chuyển hóa axit amin của N.meningitidis............................................37
theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH......................................................................37
Bảng 3.2. Đặc điểm chuyển hóa đường của  N.meningitidis...............................................38
theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH ......................................................................38
theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH..........................................................39
Bảng 3.4. Đặc điểm chuyển hóa đường của  N.meningitidis...............................................39
 theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH.........................................................39
Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh..............................................40
lưu hành tại 03 đơn vị giám sát.............................................................................................40
Bảng 3.6: Tần suất nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh.........................................41
theo trung đoàn......................................................................................................................41


Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh theo địa phương nhập ngũ....43
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra chủng N. meningitidis trên thanh NH và...................................45
cơ cấu nhóm huyết thanh bằng kỹ thuật Multiplex­PCR.....................................................45
Hình 3.1: Khảo sát gene CtrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................48
Hình 3.2: Khảo sát gene ctrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................49
Hình 3.3: Tiếp tục khảo sát sự xuất hiện của gen ctrA trên 32 chủng ................................50
N. meningitidis......................................................................................................................50

Hình 3.4:  Kết quả khảo sát sự có mặt của gene Por A trên 32 chủng ................................51
N. meningitidis phân lập được..............................................................................................51
Hình 3.5: Khảo sát gene CrgA mã hóa LysR của N. meningitidis trên 32..............................52
             Hình 3.6: Khảo sát gene SodC trên 32 chủng N. meningitidis ..................................53
Khảo sát bằng các cặp mồi phát hiện nhóm N. Meningitidis...............................................54
Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm A của N. meningitidis [31]..................54
Hình 3.7 : Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A, ..................55
Hình 3.8: Khảo sát gene siaDb phát hiện N. meningitidis nhóm B........................................56
Khảo sát cự có mặt của gene siaDc  phát hiện nhóm huyết thanh C của N. meningitidis [31].
..............................................................................................................................................56
Hình 3.9: Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm C........................................57
Bảng 3.9: Xác định MIC của chủng Neisseria meningitidis, ................................................57
nhóm huyết thanh B (n=23)..................................................................................................57
Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................59
 N. meningitidis, nhóm huyết thanh B...................................................................................59
Bảng 3.11 : Xác định MIC (in vitro) của chủng Neisseria meningitidis, ...............................59
 nhóm huyết thanh C (n=4)...................................................................................................59
Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................60
 N. meningitidis, nhóm huyết thanh C...................................................................................60
KẾT LUẬN...........................................................................................................................62
PHỤ LỤC.............................................................................................................................76


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

NMC:

 Não mô cầu

VMN:

 Viêm màng não

PS:

 Polysaccharide

LOS:

 Lipo – oligosaccharide

LPS:

 Lipopolysaccharide

OMP:            OuRer membrase protein
PCR:

Polymerase chain reaction

MIC

Minimum inhibition concentration

VSV:                Vi sinh vật


MỞ ĐẦU
Viêm màng não là một bệnh lý nhiễm trùng nghiêm trọng, tỷ  lệ  tử 
vong cao nếu không được nghĩ đến, không chẩn đoán và điều trị  kịp thời.  

Sự hiểu biết về các tác nhân gây bệnh thường gặp, sẽ hỗ trợ cho công tác  
điều trị và xây dựng các chương trình phòng chống bệnh tật tại từng Quốc  
gia. Hầu hết những dữ liệu về dịch tễ của viêm màng não mủ ở người lớn  
đều xuất phát từ những quốc gia đã phát triển, trong đó 4 tác nhân gây bệnh 
thường   gặp   nhất   là:  Streptococcus   pneumoniae  (30%­60%),    Neisseria  
meningitidis  (13­37%),  Listeria monocytogenes  và  Haemophilus influenzae. 
Neisseria   meningitidis,  Haemophilus   influenzae  type   b   (Hib)   và 
Streptococcus   pneumoniae  là   loại   vi   khuẩn   có   vỏ   (polysaccharide­
encapsuleated) là nguyên nhân quan trọng gây bệnh và tử vong trên thế giới 
[23]   Hàng  năm  có  từ  400.000  –  500.000  người  chết  do  viêm  màng  não 
(WHO, 2006). 
Trong thời gian cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đã có sự chuyển đổi 
trong việc chẩn đoán các tác nhân sinh học, kết hợp kiểu hình và huyết 
thanh học với việc xác định kiểu gene bằng các kỹ thuật sinh học phân tử 
[39]. Phân tích tính đa dạng về tổ hợp trình tự nhiều vùng  gene (MLST) là 
tiêu   chuẩn   vàng   cho   việc   xác   định   các   đặc   điểm   của   vi   khuẩn  N.  
meningitidis phục vụ  công tác giám sát dịch tễ  học. Sự  phát triển của các 
kỹ thuật phân tử  cho phép phân tích vi khuẩn gây viêm màng não từ   mẫu  
nuôi cấy phân lập và không phân lập để chẩn đoán xác định được ca bệnh 
và nó trở thành công cụ hữu ích cho nâng cao chất lượng giám sát, phát hiện 
và tiên lượng dịch, đây là chiến lược phòng ngừa chính ở các nước Châu âu 
.

1


Nhằm nâng cao chất lược, hiệu quả của việc phát hiện tác nhân trên 
cơ   sở   xác   định   đặc  điểm   về   cả   kiểu   hình  và   kiểu  gene  của  Neisseria  
meningitidis là hết sức quan trọng giúp tiên lượng, dự báo dịch và đề  xuất  
phác   đồ   dự   phòng,   điều   trị   nhằm   hạn   chế   được   tỷ   lệ   nhiễm  N.  

meningitidis, mắc bệnh trong cộng đồng. Với đề  tài nghiên cứu: “ Nghiên 
cứu đặc điểm sinh học và tính kháng kháng sinh của  Neisseria meningitidis 
tại các ổ dịch lưu hành trong quân đội. Với mục tiêu:
1. Xác định  đặc điểm sinh học và  cơ  cấu  nhóm huyết thanh của 
Neisseria meningitidis phân lập tại một số đơn vị tân binh trong quân đội. 
2.   Xác   định   tính   nhạy   cảm   kháng   sinh   của   các   chủng  Neisseria  
meningitidis phân lập từ người mang mầm bệnh không triệu chứng

2


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh viêm màng não do 
Neisseria meningitidis
Năm   1884 Ettore Marchiafava và Angelo Celli lần đầu tiên quan sát 
được   vi   khuẩn   trong   tế   bào   ở   dịch   não   tủy.   Năm  1887 Anton 
Weichselbaum phân lập được vi khuẩn từ dịch não tủy của bệnh nhân viêm 
màng não  do vi khuẩn và đặt tên là: Diplococcus intracellularis meningitidis. 
Sau đó, năm 1901 Albrecht và Ghon đã đổi thành  Neisseria meningitidis để ghi 
công Albert neisser­ nhà khoa học người Đức.
       N. meningitidis cư  trú  ở  đường hô hấp của người, tỷ  lệ  gây bệnh 
chiếm 1/100.000 người và tỷ lệ người mang mầm bệnh là 1/10 người. Não 
mô cầu  tồn tại trong đường hầu họng nhờ  pili gắn vào các thụ  thể  của 
người  [11]. Bệnh xảy ra chỉ  khi  não mô cầu vượt qua biểu mô đường hô  
hấp để  vào máu. Chúng là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết (nhiễm  
trùng máu) và nếu vi khuẩn vượt qua hàng rào máu não gây viêm màng não, 
viêm não. Khi điều trị bệnh tỷ lệ tử vong do viêm màng não chung là: 11%  
[28], trong đó viêm màng não đơn thuần là 5%. Hầu hết các trường hợp chết 
do viêm màng não có nguyên nhân từ nhiễm khuẩn huyết. Bệnh nhân nhiễm 

khuẩn huyết nhưng không có hội chứng màng não có tỷ  lệ tử  vong là 20%, 
nhưng nếu kèm theo sốc thì tỷ lệ tử vong chiếm đến 50%. 
        

Trong nhiễm khuẩn não mô cầu 15% thể viêm màng não tiến triển  

nhanh từ khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong. Khởi phát của 
viêm màng não kết hợp với đau họng, đau đầu, ngủ lơ mơ, sốt, kích thích,  
cứng gáy. Độc tố của vi khuẩn trong dịch não tủy gây viêm và gây hôn mê. 

3


      

 Thể nhiễm khuẩn huyết biểu hiện lâm sàng như: ban xuất huyết ngoài 

da và không mờ  đi khi làm dấu hiệu dây thắt. Theo thống kê có 35% bệnh 
nhân nhiễm khuẩn huyết có biều hiện nặng như đông cục máu ở  tĩnh mạnh 
ngoại vi, ngập hệ tuần hoàn cùng với nội độc tố, sốc và  bí niệu. Trong hầu 
hết các trường hợp có thể xảy ra xuất huyết não và tuyến thượng thận  [13]. 
N. meningitidis  là vi khuẩn Gram (­), cần phải điều trị  tích cực ngay bằng 
kháng sinh penicillin, ampicillin hoặc chloramphenicol. Nếu không điều trị tỷ 
lệ tử vong do bệnh viêm màng não 100%.  Sau giai đoạn cấp của viêm màng 
não bệnh nhân được điều trị bằng rifampin để làm sạch vi khuẩn ở hầu họng 
và người tiếp xúc gần với bệnh nhân cũng được điều trị  dự  phòng bằng  
rifampin [13].  
1.1.1.Dịch tễ học của bệnh viêm màng não 
Sự  lưu hành của bệnh viêm màng não có sự  khác nhau trên toàn 
cầu, theo mùa khí hậu, và tuổi mắc bệnh, qui mô dịch tễ  học của bệnh là 

ranh giới của các quốc gia gần nhau thì không có sự  khác biệt dịch tễ  học  
của bệnh, cho đến nay xét về  lịch sử của bệnh viêm màng não đã có 7 vụ 
dịch lớn mang tính chất toàn cầu và ảnh hưởng tới một số nước trong một  
khoảng thời gian. 
Viêm màng não thường xuyên bùng phát  ở Cận Saharan – Châu Phi,  
lứa tuổi thường mắc là 8­12, tỷ lệ 500 ca bệnh/100.000 dân [67]. Dịch bùng 
phát  ở  các nước phát triển  ở  đại chiến thế  giới lần thứ  II, gồm các nước 
Châu Âu, Bắc Mỹ. Trong những năm 1970 dịch bùng phát  ở  Na Uy với 
cường độ  tấn công là 10 ca bệnh/100.000 dân, sau đó lan truyền dọc Châu 
Âu bao gồm: Nước Anh và vươn ra các nước xa hơn như: Cuba, Chile và 
Brazil. Năm 1987 vụ dịch giết chết nhiều người trong các lễ hành hương từ 
thánh địa HaJ đến Mecca và lan rộng trên toàn cầu, khi họ  quay về  đất 
4


nước họ  [67].  Bệnh viêm màng não  ở  các nước phát triển nhìn chung có  
đặc điểm: xảy ra lác đác, không thường xuyên cùng với cường độ tấn công  
1/100.000 dân .
Bệnh dịch bùng phát do  ảnh hưởng của việc thay đổi khí hậu:  Ở 
Châu Phi dịch bùng phát vào mùa khô, trong thời gian khí hậu đặc trưng này  
biểu hiện: độ ẩm, bụi, mưa rào và gió thay đổi, dẫn đến thay đổi về  hành  
vi hoạt động của con người, sau các đợt gió khô, bụi ở vùng cận Saharan là 
đến mùa mưa. Ngược với khí hậu này ở Châu Âu và Bắc Mỹ thì tỷ lệ mắc 
bệnh cao trong các tháng mùa đông và thấp ở các tháng mùa thu . Rất nhiều  
các tác nhân vi khuẩn và nhiễm virus xẩy ra trong cùng mùa, nhưng lứa tuổi là  
yếu tố quan trong tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não. Bệnh viêm màng não tác 
động chủ yếu đến trẻ dưới 5 tuổi: đỉnh cao ở trẻ 6 tháng tuổi và suy giảm ở 
nhóm lứa tuổi cao hơn . Ví dụ: Bệnh viêm màng não ở Mỹ, ở nhóm 1 tuổi chỉ 
chiếm ½ so với nhóm 4 tuổi (Centers  for  Disease  Control  and  Prevention  
2000), và tỷ lệ tử vong lại xảy ra đáng kể ở trẻ vị thành niên ở Mỹ và Anh là  

tương đương.
1.1.2.Dịch tễ học người mang mầm bệnh không triệu chứng
Người mang mầm bệnh không triệu chứng cao hơn tỷ lệ mắc bệnh. 
Tỷ  lệ  người mang  ở Mỹ  và Châu Âu khoảng 10% 7],[10], cao gấp 10.000  
lần tỷ lệ mắc bệnh. Tuy nhiên trong nhà khép kín hoặc một cộng đồng sinh 
hoạt khép kín thì tỷ  lệ mang mầm bệnh còn cao hơn: các đơn vị  quân đội, 
trường học, nhà tù thì tỷ lệ  người mang mầm bệnh có thể  đạt 50% .  Mô  
hình người mang mầm bệnh liên quan tới cường độ bệnh, phân vùng địa lý, 
ảnh hưởng của khí hậu và lứa tuổi cảm nhiễm. Mùa viêm màng não  ở 
Châu Á và Châu Phi thường xuất hiện liên quan tới sự  thay đổi mùa khí 
hậu đã được báo cáo ở Nigeria và India    . Tương tự như vậy, tỷ lệ người  

5


mang mầm bệnh trong vùng khí hậu ôn đới thường không xuất hiện theo 
sự  thay đổi mùa đã được nghiên cứu  ở  Bỉ  và Mỹ  ;   Hà Lan, tỷ  lệ  người  
mang mầm bệnh cao phản ánh nguy cơ  dịch lớn, có thể  lên tới 70% trong 
một số bệnh gây dịch.
Tuổi mắc mang mầm bệnh  ở Anh, năm 1986 có sự khác biệt giữa các 
nhóm tuổi : thấp  ở lứa tuổi nhỏ và trẻ vị thành niên và cao đến 25% ở lứa  
tuổi từ 13­19 tuổi và từ  20­29 tuổi. Sự tương phản đầu tiên quan sát thấy 
là tỷ   lệ  tử  vong  cao  ở   trẻ  dưới   5 tuổi  và thấp hơn   là tỷ   lệ  mang   N.  
lactamica cao ở tuổi ẵm ngửa [14].
1.2. Đặc điểm sinh học của N. meningitidis
1.2.1.Danh pháp và phân loại Não mô cầu [32]
Danh pháp khoa học
Giới (Kingdom): Bacteria

Họ (Family): Neisseriaceae

Ngành (Phylum): Proteobacteria

Chi (Genus): Nesseria

Lớp (Class): Beta Proteobacteria

Loài (Species): N. meningitidis

Bộ (Ordo): Neisseriales

Nhóm huyết thanh: A, B, C, D, 29E, 

H, I,L,W135,X,Y,Z
Tên gọi não mô cầu theo danh pháp quốc tế: Neisseria meningitidis.
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh học của Neisseria meningitidis
Chi Loài đặc trưng Nhuộm  Hình thể Tạo 
Gram

vỏ

Sắp 
xếp

Di 

Hô 

Môi 

động hấp trường 
phát 
triển

6

Trong/ ngoài 
tế bào


Neiss N. gonorrhoeae
eria N. meningitidis

Gram (­) Hình hạt  Tạo vỏ  Phế  Không  Hiếu  Thayer­
cà phê, hai  hoặc 
mặt dẹt 

cầu 

di 

không khuẩn động

đối xứng 

khí Martin 

Gonococcus: 
trong tế bào­ 
N.meningitidis: 

ngoại bào

nhau

Não mô cầu là cầu khuẩn Gram âm, kích thước thay đổi, có thể thấy ở 
dạng đơn độc hoặc song cầu hình hạt cà phê với hai mặt dẹt đối diện nhau 
và có thể nằm trong hoặc ngoài bạch cầu đa nhân, không lông, không sinh  
bào tử, đa số các chủng đều có vỏ.

Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy[63].
1.2.2. Tính chất nuôi cấy
Tính chất nuôi cấy
Não mô cầu là vi khuẩn hiếu khí, phát triển  ở  môi trường có 5% 
thạch   máu,   thạch   Thayer­Martin   cải   tiến   hoặc   môi   trường   chocolate,   ở 
nhiệt độ  35­370C, khí trường 5­7% CO2. Trên thạch máu, khuẩn lạc nhỏ, 

7


tròn, mờ đục, lồi, màu hơi trắng xám, không tan máu, đường kính 1­ 3 mm.  
Khi dùng que cấy đẩy, khuẩn lạc trượt dễ dàng trên mặt thạch.
Phân biệt vi khuẩn não mô cầu thông thường được căn cứ  trên hình 
dạng, kết quả nhuộm Gram, các thử nghiệm sinh hoá: phản ứng oxidase và 
catalase dương tính, lên men đường glucose, maltose nhưng không lên men 
đường sucrose hay lactose.

Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. [63].

8

Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu. [63]
1.2.3. Sức đề kháng
      

Não mô cầu có sức đề  kháng yếu: chỉ  sống được trong bệnh phẩm 

dịch não tủy khoảng 3 – 4 giờ sau khi ra khỏi cơ thể. Bị tiêu diệt ngay bởi  
tia cực tím, dung dịch Cloramin B 0,5 – 1% hoặc cồn 70 0.  Ở  nhiệt  độ 
550C/30 phút hoặc  ở  600C/10 phút Não mô cầu cũng bị  tiêu diệt. Não mô 
cầu có sức đề kháng yếu với điều kiện khô và ánh sáng, dễ bị tiêu diệt bởi 
các thuốc sát trùng thông thường. 
1.2.4. Nh ững kháng nguyên quan trọng của Não mô cầu  [2], [5], 
[9], [62].
Protein màng tế bào chất
Por A

Màng tế bào chất
Khoảng gian màng
Màng ngoài tế bào
Lipooligosaccharide

Por B

Pili
Vỏ
Protein màng ngoài
Phospholipid

Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.[18]

    

Lớp polysaccharide (PS) nang: là  kháng nguyên vỏ, có tác dụng tạo 

kháng thể bảo vệ (ngoại trừ nhóm B). Căn cứ vào tính không đồng nhất về 

9


cấu trúc và tính kháng nguyên của PS người ta đã tìm được 13 nhóm huyết 
thanh của cầu khuẩn màng não bao gồm: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135,  
X, Y, Z. Nhóm huyết thanh A chứa mannosamine phosphate, trong khi đó 
nhóm huyết thanh B, C, Y, W135 chứa acid sialic ­ chất đóng vai trò quan 
trọng trong sự tồn tại và độc tính. Polysaccharide vỏ của nhóm huyết thanh 
B và C bao gồm homopolymer của acid N ­ acetyl ­ neuraminic liên kết với 
α  ­ 2,8 và  α  ­ 2,9. Sự  khác nhau nhỏ  trong cấu trúc dẫn đến các đặc tính  
miễn dịch khác nhau một cách rõ ràng: trong khi cấu trúc  α  ­ 2,9 là kháng 
nguyên mạnh đối với cơ thể  và sinh ra kháng thể bảo vệ thì α ­ 2,8 lại có  
tính kháng nguyên rất yếu.
­ Lớp lipo­ oligosaccharide (LOS)­ Endotoxin
Cấu   tạo   của   LOS   gồm   1   glycolipid   màng   ngoài   nhưng   khác   với  
lipopolysaccharide (LPS) của Enterobacteriaceae  vì thiếu các chuỗi O đặc 
trưng và hình thái “xù xì” (ráp) tương tự như của LPS. Nó bao gồm 3 thành 
phần  chính: oligosaccharide nhân; lipid A kỵ  nước (thành phần gây độc); 
một chuỗi oligosaccharide nhánh có thể thay đổi (thành phần tạo miễn dịch). 
gene glycosytranspherase (lgt) trên nhiễm sắc thể đảm nhiệm việc sinh tổng 
hợp của các chuỗi oligosaccharide  khác nhau. 4 glycosyltranspherase (lgtA,  
lgtC, lgtD và lgtG), sử dụng để phân loại các chủng thành 12 type miễn dịch  
khác nhau. Type miến dịch L1 ­ L8 liên quan chi phối đầu tiên tới não mô 
cầu nhóm huyết thanh B, C, trong khi đó type miễn dịch L9 ­ L12 liên quan 

đến các chủng não mô cầu nhóm A.  Gene  truyền ngang của  các  Neisseria 
hoại sinh chi phối tính đa dạng về gene của vị trí lgt.[]
         ­ Màng ngoài chứa hơn 50% LOS, nó tương tự như polysaccharide của  
vi khuẩn Gram âm và chứa lipid A
         ­ Lớp protein của màng ngoài (PorA và PorB): đặc hiệu type huyết  

10


thanh và phân type huyết thanh Màng ngoài não mô cầu chứa một số protein 
màng ngoài chính (OMPs): chức năng của PorB (tên trước đây là protein lớp  
2/3) và PorA (protein lớp 1) như porin, cho phép các chất dinh dưỡng đi vào. 
Giống như  hầu hết các kháng nguyên bộc lộ  trên bề  mặt não mô cầu, độ 
lớn của kháng nguyên giữa các chủng là khác nhau, do đó có thể  sử  dụng  
chúng để phân loại não mô cầu thành các nhóm huyết thanh và phân nhóm 
huyết thanh. Các chủng  N. meningitidis được phân chia thành trên 20 nhóm 
huyết thanh và phân nhóm huyết thanh khác nhau chủ  yếu  ở  nhóm huyết  
thanh B, C. Nhiều chủng phân lập không thể phân loại được là nhóm huyết 
thanh hay phân nhóm huyết thanh bằng kháng thể đơn dòng hiện tại.
        ­ Cấu trúc kháng nguyên của nhóm huyết thanh và phân nhóm huyết  
thanh thay đổi in vivo một cách nhanh chóng trên một cá thế người và trong 
cộng đồng. Các vòng ( mạch) có thể  thay đổi trên bề  mặt lộ  diện của cả 
hai porins, có thể thay đổi về  mặt kháng nguyên bằng cách thêm vào hoặc  
bớt đi amino­acid hoặc bằng cách truyền ngang các mảnh phụ của các gene 
đại diện. Sự  thay đổi này làm cho việc phát triển vắc xin mới là hết sức  
khó khăn.
            ­ Kháng nguyên X: kháng nguyên này chung với cầu khuẩn lậu, cầu 
khuẩn phổi. Kháng nguyên này được dùng trong một số  kỹ  thuật chẩn đoán  
huyết thanh.
1.3. Các kỹ thuật chẩn đoán phòng thí nghiệm

1.3.1. Kỹ thuật nhuộm soi
Các thử nghiệm nhanh phất hiện NMC có thể dương tính, là cơ sở cho  
liệu pháp sử  dụng kháng sinh trước đó. Một số  lượng nhỏ  mẫu dịch não 
tủy gửi đến phòng thí nghiệm càng sớm các tốt để phân tích. Kết quả chẩn  
đoán nghi ngờ  khi: Nhuộm gram mẫu dịch não tủy ly tâm cho thấy, hình 

11


ảnh phế  cầu khuẩn; gram (­), nằm trong hoặc ngoài tế  bào bạch cầu, kết 
quả  này xác định từ  1­2 giờ khi mẫu bệnh phẩm được chuyển đến phòng  
thí nghiệm
1.3.2.Kỹ thuật phân lập
Tiêu chuẩn vàng để  chấn đoán là phân lập N. meningitidis từ  dịch tiết 
vô trùng của cơ  thể  như: dịch não tủy, máu. Chẩn đoán xác định khi vi  
khuẩn phát triển trên môi trường thạch chocolate. Sự  khác biệt với các vi 
khuẩn   thuộc   loài   khác   là   khuẩn   lạc   được   thử   nghiệm   oxidase,   catalase  
dương tính và thử nghiệm sinh hóa lên men. Cuối cùng là xác đinh về huyết  
thanh xác định dưới nhóm của  N. meningitidis, đây là vấn đề  quan trọng 
trong giám sát dịch tễ  học, phần này chỉ  có thực hiện tại các phòng thí 
nghiệm chuyên dụng.
Bệnh phẩm là dịch não tuỷ, máu (lấy trước khi dùng kháng sinh) được  
cấy trên môi trường thạch máu, thayer­ Martin cải tiến hoặc chocolate và 
được  ủ   ở  370C, 10% khí CO2. Chọn khuẩn lạc, thử  các tính chất sinh vật  
hoá học và ngưng kết với kháng huyết thanh để xác định nhóm

Hình 1.5: Hình ảnh nuôi cấy N. 

Hình1.6: Hình ảnh định danh N. 

meningitidis trên môi trường 

meningitidis trên thanh định danh API NH

thạch chocolate có kháng sinh
12


1.3.3.Kỹ  thuật điện di miễn dịch:   Phát hiện polysaccharide đặc 
hiệu của N. meningitidis trong dịch não tuỷ, máu và nước tiểu. Kỹ thuật này 
có thể phát hiện được polysaccharide ở mức 0,1µg/ml
1.3.4.Kỹ   thuật   ngưng   kết:  Gắn   anti­polysaccaride   lên   hồng   cầu 
hoặc hạt latex để phát hiện kháng nguyên polysaccaride của N. meningitidis 
trong bệnh phẩm máu, dịch não tủy, nước tiểu, độ  nhạy giao động từ 2,5 ­ 
62,5 ng/ml (62,5ng/ml đối với  N. meningitidis  nhóm B) và chỉ  dùng trong 
phát hiện ca bệnh. Do đó trung tâm kiểm soát bệnh tật CDC khuyến cáo 
không sử dụng kỹ thuật này trong thường qui xét nghiệm chẩn đoán nhiễm 
não mô cầu.

13


Hình 1.7 : Hình ảnh bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis
    1.3.5. Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn gây viêm màng 
não 
    Ở các nước phát triển, hầu hết sử dụng chuẩn thức để phát hiện đặc  
điểm của tác nhân vi sinh vật gây viêm màng não, bao gồm: nuôi cấy, nhuộm 
gram và ngưng kết hạt latex. Thậm chí nuôi cấy được coi như  tiêu chuẩn 
vàng để  khằng định ca bệnh trong lâm sàng, tỷ  lệ  dương tính là tương đối 
thấp do bảo quản và điều kiện vận chuyển, thực hành kỹ thuật nuôi cấy và  

tình trạng sử  dụng kháng sinh trước khi thu thập mẫu. Thời gian trong kỹ 
thuật nhuộm gram là quan trọng, giá thành rẻ  nhưng chỉ  cho phép xác định  
hình thể, tính chất bắt mầu của tác nhân, không xác định được loài. Đọc kết  
quả của kỹ thuật ngưng kết hạt latex phụ thuộc vào nhận định chủ quan của  
người đọc kết quả  và có thể  rất khó nhận định, nhất là khi nồng độ  vi 
khuẩn thấp trong máu. Nuôi cấy được coi như  tiêu chuẩn vàng xác định 
được nguồn gốc các thông tin về  tính nhậy cảm kháng sinh, định nhóm  
huyết thanh, biểu hiện kháng nguyên là cơ  sở  cho việc sản xuất vắc xin. 
Mẫu không sử dụng trong phân lập có thể được phân tích bằng kỹ thuật sinh  
học phân tử  trên cơ  sở   ứng dụng DNA tách chiết từ  mẫu bệnh phẩm lâm 
sàng (dịch tiết, máu và dịch não tủy…).
Phương pháp PCR không yêu cầu cần thiết vi khuẩn sống trong mẫu  
bệnh phẩm và là công cụ  tốt cho phát hiện tác nhân vi sinh vật từ  mẫu  
bệnh phẩm lâm sàng (vi khuẩn chết, hoặc đang bị ly giải do điều kiện bảo  
quản hoặc trước khi sử  dụng kháng sinh), cho đến nay PCR đã được xử 
dụng rộng rãi trong chẩn đoán và giám sát tác nhân vi sinh vật vì có độ 
nhậy và độ đặc hiệu cao, là công cụ bổ xung cho các phương pháp xác định 

14


kiểu hình khác như: nuôi cấy, nhuộm gram, và ngưng kết hạt latex đề nâng 
cao nhận định khẳng định kết quả. 
1.4.  Đặc điểm gene đích phát hiện N. meningitidis
Một vài vùng gene bao gồm: ctrA, porA, crgA và 16 SrRNA đã được 
sử dụng rộng rãi trong các thử nghiệm PCR cơ bản [9], [22], [41]. Đặc thù 
hơn   nữa   gene  sacB  và  siaD  đã   sử   dụng   từ   genogroup   cho   hầu   hết   : 
A,B,C,W135 và Y [4], [5], [9], [16]. Tuy nhiên chúng ta biết rằng không có  
phương pháp phân tử  nào phân biệt được 12 nhóm   huyết thanh của  N.  
meningitidis mà phát hiện chỉ bằng kháng huyết thanh.

Sự thay đổi vùng  gene mã hóa capsule trong choromosome đã tạo ra 
CPS  khác nhau trong nhóm huyết thanh.   Gene  mã hóa capsule bao gồm  
các vùng A, B, C, D và E:
      ­ Vùng A và C giữa gene  galE và tex trong chromosome [38]. Gene A mã 
hóa tổng hợp polysaccharide.
       ­   Vùng B là chiều ngược của vùng A hoặc xuôi của vùng C [43], gene 
trong vùng B là: LipA và LipB liên quan vận chuyển và biểu hiện bề mặt của 
capsule.
           ­   Vùng C bao gồm 4 gene ( ctrA, ­B ,­C và –D),  cần thiết cho vận 
chuyển capsule tới màng [43].
      ­ Vùng D gồm có một loạt các gene (rmlA, ­B, và –C, galE), không liên 
quan tới biểu hiện capsule, nhưng chịu trách nhiệm tổng hợp LOS (lipo­
oligosaccharide) [19].
     ­ Vùng E chỉ có 01 gene, tex: điều chỉnh tổng hợp CPS [25].
Trình tự gene trong vùng A cho sự khác biệt riêng của từng nhóm huyết 
thanh, và vùng B, C, D và E có sự bảo thủ cao giữa Nhóm huyết thanh (A; B;  
C; Y; W135; X; Z; 29E) [40].

15


    Polysascharide   capsule                                    PorA (lớp 1­OMP)
                                                 Phân nhóm huyết thanh (VR1;VR2;VR3)
                                                                   
 Phenotype (B:NT:NT/P1.4/NT)
                                                                              
PCR phát hiện Nm 
(CtrA;CrgA).
Nhóm huyết thanh: 
­ SiaD (B;C;Y;W135)

­ mynB (A)                                                                
PorB (lớp 2 hoặc 3 OMP)
Dịch tễ học phân tử:
MLST; PorA;fetA                                                                Nhóm huyết thanh
Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên của N. meningitidis
Hai gene đích đặc hiệu cho loài N. meningitidis (CtrA và sodC) đây là 
gene vận chuyển capsule đến bề mặt tế bào. Gene CtrA có tính bảo thủ cao 
và thường được sử  dụng trong các phản  ứng PCR [43] nó là  gene  trong 
vùng mã hóa capsule  (Hình 2), Tuy nhiên không dưới  16%  mất   CtrA  ở 
người  mang mầm bệnh không triệu chứng [16], [20], [50] Thử  nghiệm  
gene đích không làm biến đổi Cu, Zn và muối Ca, đó là gene SodC, không 
thuộc vùng gene mã hóa capsule, thử  nghiệm SodC trực tiếp phát hiện vỏ 
của cầu khuẩn (encapsuleated), nhưng nó hoàn toàn được sử dụng cho phát 
hiện cầu khuẩn màng não ở người mang mà ở đó không có  gene CtrA, đó là 
lý do cần thiết gene SodC bổ xung trong phát hiện N. meningitidis

16