Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillusthuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera)

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
----***----

Phạm Thùy Dương

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
BACILLUS THURINGIENSIS PHỤC VỤ TẠO CHẾ PHẨM
DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH (DIPTERA)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội, tháng 3 năm 2019

DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ


BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
----***----

Phạm Thùy Dương

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
BACILLUS THURINGIENSISPHỤC VỤ TẠO CHẾ PHẨM
DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH (DIPTERA)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 9.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. Ngô Đình Bính
2. TS. Lê Đức Khánh

Hà Nội, tháng 3 năm 2019

DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ


LỜI CẢM ƠN
TrTrƣớc tiên, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS.
Ngô Đình Bính giáo viên hƣớng dẫn khoa học, ngƣời đã tạo điều kiện và cấp kinh
phí cho tôi thực hiện luận án, đồng thời luôn ở bên truyền dạy kiến thức kinh
nghiệm và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cám ơn TS Lê Đức Khánh, ngƣời hƣớng dẫn khoa học,
đã giúp tôi hiểu sâu sắc hơn về lĩnh vực khoa học thực hiện trong luận án và cấp
kinh phí cho tôi thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Giống và Bảo tồn
nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho
tôi thực hiện phần lớn các thí nghiệm trong phạm vi luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Tăng Thị Chính và tập thể cán bộ
phòng Vi sinh môi trƣờng-Viện Công nghệ Môi trƣờng đã tạo điều kiện cho tôi
đƣợc sử dụng một số thiết bị và tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học dân lập Phƣơng
Đông, Khoa Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng đã luôn động viên và tạo mọi
điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo, các nhà khoa

học, các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài trƣờng Đại học Phƣơng Đông,Viện
Công nghệ sinh học đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn
thành luận án.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai bên gia đình nội ngoại
đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi
cũng xin chân thành cảm ơn chồng và các con của tôi đã cho tôi thêm sức mạnh,
động lực để tôi vƣợt qua mọi khó khăn.
i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng
cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một
phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép
của tác giả. Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày thángnăm 2018
Tác giả

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................ii
MỤC LỤC ............................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... x

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................. 2
2.1. Mục tiêu chung ................................................................................................. 2
2.2. Mục tiêu cụ thể ................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 3
4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................................ 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 4
5.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................. 4
5.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5
1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis ........................................................................ 5
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis ........................ 5
1.1.2. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis ................ 7
1.1.3. Đặc điểm phân loại........................................................................................ 9
1.1.4. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ................................................ 10
1.1.5. Đặc điểm protein độc tố diệt côn trùng ....................................................... 11
1.1.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp độc tố của vi
khuẩn B. thuringiensis ........................................................................................... 21
1.1.7. Nhu cầu dinh dƣỡng của Bacillus thuringiensis ........................................ 23
1.1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn B. thuringiensis ở Việt Nam 26
1.2. Gen cry2 ............................................................................................................. 28
1.3. Hệ biểu hiện Escherichia coli .......................................................................... 29
1.4. Côn trùng thử nghiệm ..................................................................................... 31
iii


1.4.1. Ruồi nhà ...................................................................................................... 31
1.4.2. Muỗi ........................................................................................................ 34
1.5. Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis ............................................... 35

1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT ..................... 35
1.5.2. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis ...................... 38
1.5.3. Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu sinh học BT đến môi trƣờng và con ngƣời40
1.5.4. Tồn dƣ của thuốc trừ sâu BT ....................................................................... 42
1.6. Bã malt bia ........................................................................................................ 44
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 46
2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 46
2.1.1.Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ...................................................... 46
2.1.2. Chủng vi sinh vật ....................................................................................... 46
2.1.3. Cặp mồi khuếch đại gen cry2A và hệ vector ............................................... 46
2.1.4. Hóa chất ...................................................................................................... 47
2.1.5. Thiết bị ........................................................................................................ 47
2.1.6. Môi trƣờng nuôi cấy .................................................................................... 48
2.1.7. Dung dịch .................................................................................................... 48
2.2. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm................................................... 49
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 49
2.3.1. Phƣơng pháp vi sinh .................................................................................... 49
2.3.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học............................................................ 50
2.3.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử .................................................................... 53
2.3.4. Tối ƣu hóa môi trƣờng lên men theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt ........... 60
2.4. Sơ đồ nghiên cứu .............................................................................................. 64
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 66
3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ các
chủng Bacillus thuringiensis ................................................................................... 66
3.1.1. Phân lập các chủng Bacillus ........................................................................ 66
3.1.2. Nghiên cứu protein tinh thể......................................................................... 69
3.1.3. Phân loại dƣới loài các chủng Bacillus thuringiensis phân lập…………..
3.1.4. Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập ..... 73

iv

3.2. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt côn trùng bộ
hai cánh ở các chủng phân lập ............................................................................... 74
3.2.1. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết
thanh bằng phƣơng pháp PCR .............................................................................. 74
3.2.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry2A .............................................................. 76
3.2.3. Biểu hiện gen............................................................................................... 84
3.2.4. Nghiên cứu tối ƣu điều kiện biểu hiện gen ................................................. 88
3.2.5. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin .... 91
3.2.6. Hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh của rCry2A và chủng MSS8.4.......... 92
3.3. Lựa chọn môi trƣờng và tối ƣu lên men làm tăng khả năng hình thành
protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8.4từ bã bia ........................................ 94
3.3.1. Xử lý bã bia làm nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn MSS8.4 .......................... 94
3.3.2. Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dƣỡng bổ sung vào dịch
thủy phân bã bia đến sinh trƣởng và sinh tinh thể độc của vi khuẩn MSS8.4. ... 100
3.3.3. Tối ƣu hóa môi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4 từ nguồn bã bia ... 107
3.4. Nghiên cứu tạo chế phẩm .............................................................................. 114
3.4.1. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men đến sinh trƣởng,hình thành bào tử và
sinh tinh thể độc của chủng MSS8.4 ................................................................... 114
3.4.2. Kết quả thử nghiệm chế phẩm BT với ấu trùng ruồi nhà.......................... 119
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 126
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐƢỢC CÔNG BỐ ................................................. 128
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............................................................................... 128
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 129

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Chữ viết đầy đủ

1

Chữ viết tắt
Bp
Base pair

2

BSA

Bovine serum albumin-albumin huyết thanh bò

3

Bt

Bacillus thuringiensis

4

BT

Chế phẩm Bacillus thuringiensis

5

Btk

Bacillus thuringiensis serova kurstaki

6

CFU

Colony Forming Unit

7

dH2O

Deionized water

8

DNA

Deoxyribonucleotide acid

9

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphates

10

ĐC

Đối chứng

11

E. coli

Escherichiacoli

12

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

13

EtBr

Ethidium Bromide

14

kDa

Kilo Dalton

15

Kb

Kilo base

16

LB

Luria-Bertani- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn

17

SDS

Sodium dodecyl sulphate

SDS-

Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium

PAGE

doecyl sunfat

19

Sol

Solution- Dung dịch

20

IPTG

Isopropyl- β-D-thiogalactoside- Chất cảm ứng

21

TE

Tris EDTA

22

X-gal

5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside

23

MTCS

Môi trƣờng cơ sở

24

OD

Optical density-Mật độ quang học

25

TCC

Tổng tế bào đếm đƣợc (gồm tế bào và bào tử sống)

18

vi


26

SC

Số bào tử đếm đƣợc

27

TS

Tổng chất rắn

28

DTPBB

Dịch thủy phân bã bia

vii


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Phân tích trình tự của độc tố cry đại diện với cấu trúc đƣợc nghiên cứu
bằng tinh thể tia X ..................................................................................................... 14
Bảng 1.2. Thành phần một số môi trƣờng lên men sản xuất chế phẩm BT .............. 23
Bảng 1.3. Thành phần bã malt (%) ........................................................................... 44
Bảng 1.4. Thành phần trung bình của tro .................................................................. 45
Bảng 2.1. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy ....................................................... 48
Bảng 2.2. Thành phần và nồng độ các loại dung dịch .............................................. 48
Bảng 2.1. Các thí nghiệm đƣợc thiết kế bởi phần mềm design expert 10.1 ............. 63
Bảng 3.1. Kết quả phân loại dƣới loài các chủng B. thuringiensis bằng phƣơng pháp
huyết thanh ................................................................................................................ 72
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng bộ 2 cánh của các chủng B.
thuringiensis .............................................................................................................. 73
Bảng 3.3. Thử hoạt tính sinh học của rcry2a và protein tinh thể từ B. thuringiensis
với ấu trùng M. domestica ......................................................................................... 88
Bảng 3.4. Hoạt tính diệt côn trùng của protein tinh thể từ chủng MSS8.4 và protein
tái tổ hợp RCry2A ..................................................................................................... 93
Bảng 3.5.Ảnh Hƣởng Của Phƣơng Pháp Xử Lý Đến Khả Năng Sinh Trƣởngvà Sinh
Tổng Hợp Protein Tinh Thể Của MSS8.4 ................................................................ 94
Bảng 3.6.Thành Phần Hóa Học Của Dịch Thủy Phân Bã Bia .................................. 96
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của tỷ lệ bã bia đến sinh trƣởng, sinh protein tinh thể của
chủng vi khuẩn MSS8.4. ........................................................................................... 98
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng hữu cơ bổ sung vào dịch thủy phân bã
bia đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể ............................................ 100
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nguồn khoáng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh
trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể ................................................................. 101

viii


Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng bổ sung vào dịch thủy phân bã
bia đến sinh trƣởng của MSS8.4 ............................................................................. 106
Bảng 3.11. Kết quả phân tích hồi quy nồng độ protein tinh thể ............................. 108
Bảng 3.12. Hàm lƣợng protein tinh thể tính theo mô hình và thực nghiệm ........... 111
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của ph ban đầu đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp delta
endotoxin của vi khuẩn MSS 8.4 ............................................................................ 114
Bảng 3.14. Giá trị ph ban đầu và sau 48 giờ lên men ............................................. 115
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh
thể của vi khuẩn MSS8.4 ........................................................................................ 116
Bảng 3.16. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica của chế
phẩm ........................................................................................................................ 119
Bảng 3.17. Hoạt tính diệt ấu trùng ruồi của chế phẩm BT qui mô pilot ................. 121
Bảng 3.18. Các công thức chế phẩm bt diệt ruồi cho thử nghiệm ngoài thực địa ......... 123
Bảng 3.19. Hiệu quả diệt dòi của chế phẩm bt dạng bột thấm ƣớt. ........................ 124

ix


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình ảnh bào tử và tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis ........................ 8
Hình 1.2. Cấu trúc tinh thể của Cry1Aa, cry2aa (. .................................................... 15
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của colicin N.................................................................. 15
Hình 1.4. Tóm tắt phổ hoạt tính của B. thuringiensisδ-endotoxins .......................... 18
Hình 1.5. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng ............................ 20
Hình 1.6. Ruồi nhà .................................................................................................... 31

Hình 1.7. Vòng đời của ruồi nhà (musca domestica) ................................................ 32
Hình 1.8. Trứng của ruồi nhà (musca domestica) ..................................................... 33
Hình 1.9. Các giai đoạn phát triển của muỗi ............................................................. 34
Hình 1.10. Quy trình sản xuất chế phẩm bt bằng phƣơng pháp lên men chìm ......... 40
Hình 3.1. Sự phân bố của các chủng B. thuringiensis phân lập tại 7 vùng địa lý của
Việt Nam ................................................................................................................... 66
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn B. thuringiensis trên môi trƣờng MPA sau
72 giờ nuôi cấy ở 300C .............................................................................................. 67
Hình 3.3. Kết quả phân lập của B. thuringiensis trong các mẫu đất, lá thuộc 7 vùng
của Việt Nam............................................................................................................. 68
Hình 3.4. Hình ảnh tinh thể của các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam
chụp bằng kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10000 lần. ........................................ 69
Hình 3.5. Kết quả phân loại hình thái tinh thể của B. thuringiensis trong các mẫu
đất, lá thuộc 7 vùng của Việt Nam ............................................................................ 70
Hình 3.6. Hình ảnh ngƣng kết của chủng MSS8.4 phân lập với typ huyết thanh dƣới
kính hiển vi quang học. ............................................................................................. 72
Hình 3.7. Kết quả PCR sàng lọc các 7 chủng B. thuringiensis bằng cặp mồi khuếch
đại gen cry2A ............................................................................................................. 76
Hình 3.8. Kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật pcr khuẩn lạc, các dòng biến nạp gen
cry2A từ 2 chủng LNT7.12 và MSS8.4..................................................................... 76

x


Hình 3.9. Kết quả cắt các dòng biến nạp mang gen cry2A từ 2 chủng LNT7.12 và
MSS8.44 bằng 2 enzyme BamHI,XhoI ..................................................................... 77
Hình. 3.10. Phân nhóm quan hệ của trình tự DNA phân lập từ chủng MSS8.4 với
các trình tự gen cry. ................................................................................................... 79
Hình 3.11. So sánh trình tự gen của chủng MSS8.4 với với các gen cry2A từ ngân
hàng gen quốc tế........................................................................................................ 81

Hình 3.12. So sánh trình tự a.a suy diễn của chủng MSS8.4 với các trình tự protein
độc tố cry2A từ ngân hàng gen quốc tế..................................................................... 82
Hình 3.13. Cấu trúc 3D mô phỏng của cry2Aa từ chủng MSS 8.4 ......................... 83
Hình 3.14. Kết quả sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc, các dòng biến nạp gen
cry2A với cặp mồi đặc hiệu. ..................................................................................... 84
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp mang gen cry2A với
BamHI ,XhoI ............................................................................................................ 85
Hình 3.16. Kiểm tra sự biểu hiện của gen cry2A trên gel polyacryamide 12,6%. .... 86
Hình 3.17. Phân tích sự biểu hiện của protein cry2A bằng kỹ thuật Western blot. ...... 87
Hình 3.18. Sản phẩm protein của chủng E. Coli tái tổ hợp mang gen cry2Atheo nhiệt
độ trên gel 12,6 % polyacrylamide. .......................................................................... 89
Hình 3.19. Sản phẩm protein của chủng E. Coli tái tổ hợp mang gen cry2A theo
nồng độ chất cảm ứng (IPTG) trên gel 12,6 % polyacrylamide. .............................. 90
Hình 3.20. Sản phẩm protein của chủng E. Coli tái tổ hợp mang gen cry2Atheo thời
gian trên gel 12,6 % polyacrylamide. ....................................................................... 91
Hình 3.21. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide. ........ 92
Hình 3.22. Tỷ lệ chuyển hóa thành bào tử sau 48 giờ lên men ............................... 100
Hình 3.23. Ảnh hƣởng của nồng độ MgSO4 đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp
protein tinh thể của chủng MSS8.4 ............................................................................ 104
Hình 3.24. Ảnh hƣởng của nồng độ MnSO4 đến khả năng tổng hợp protein tinh thể
của chủng vi khuẩn MSS 8.4................................................................................... 105
Hình 3.25. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng bổ sung vào dịch thủy phân bã
bia đến nồng độ protein tinh thể thu đƣợc sau 48 giờ lên men ............................... 107

xi


Hình 3.26. Bề mặt đáp ứng của từng cặp yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp độc tố
protein tinh thể của chủng vi khuẩn B.thuringiensis ............................................... 111
Hình 3.27.Thiết bị lên men chế phẩm ..................................................................... 118

Hình 3.28. Sinh khối thu đƣợc đặt trong tủ âm ....................................................... 118
Hình 3.29. Chế phẩm BT sau khi đông khô ........................................................... 119
Hình 3.30. Thử hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà của chế phẩm BT quy mô phòng thí
nghiệm ..................................................................................................................... 120
Hình 3.31. Thử nghiệm hoạt tính diệt ruồi nhà Musca dometisca .......................... 122
Hình 3.32. Một số hình ảnh thử nghiệm chế phẩm diệt dòi ngoài hiện trƣờng ...... 125

xii


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn có khả năng sinh sản ra các protein tinh thể độc
có khả năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc hại cho con
ngƣời và môi trƣờng sinh thái và sinh vật có ích. Trong nhiều năm qua, thuốc trừ
sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng để
diệt trừ côn trùng có hại đối với cây trồng cũng nhƣ bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Càng ngày thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis càng đƣợc sử
dụng một cách rộng rãi bởi nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch ngày
càng cao. Không những thế thuốc trừ sâu sinh học BT còn có những ƣu điểm rất
vƣợt trội từ việc khắc phục đƣợc tính kháng thuốc của côn trùng và chỉ diệt các loài
côn trùng có hại, không ảnh hƣởng tới môi trƣờng sinh thái cũng nhƣ sức khỏe con
ngƣời.
Côn trùng bộ hai cánh là một trong những bộ lớn trong lớp côn trùng với số
lƣợng và thành phần đa dạng. Côn trùng thuộc bộ hai cánh rất đa dạng về mặt sinh
thái học và chủ yếu là các tác nhân gây hại trong nông nghiệp (ruồi đục quả) hay
cho con ngƣời nhƣ ruồi, muỗi. Chúng là tác nhân trung gian chủ yếu truyền bệnh
giữa ngƣời với ngƣời hay giữa động vật và ngƣời. Các bệnh do muỗi truyền có thể
gây tử vong cao nhƣ Anopheles gambiae là trung gian truyền bệnh sốt rét cho
ngƣời. Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết. Culex tritaeniorhynchus truyền

bệnh viêm não Nhật Bảncòn ruồi là tác nhân truyền khoảng 100 bệnh nhƣng chủ
yếu là các bệnh nguy hiểm nhƣ: bại liệt, bệnh đau mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi
qui do Rickettsiae,lỵ, tả, thƣơng hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng
(Staphyloccocus).
Ngày nay, có nhiều phƣơng pháp diệt côn trùng bộ hai cánh khác nhau mà
con ngƣời áp dụng. Biện pháp diệt đƣợc sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại
thuốc diệt ruồi, muỗi. Tuy nhiên, những loại thuốc này hiện nay thƣờng có giá
thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh
hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh.
Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh của các
1


chủng Bacillus thuringiensisphân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm ra những
chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học
diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh.
Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillusthuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn
trùng bộ hai cánh (Diptera)”
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh
protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ hai cánh (Diptera) cao. Biểu hiện, tinh
sạch đƣợc protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh trong vi khuẩn
E.coli phục vụ nghiên cứu chuyên sâu và sản xuất đƣợc chế phẩm sinh học Bacillus
thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ bã thải nhà
máy bia .
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Thu thập và sàng lọc đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các
mẫu đất, lá tại một số tỉnh của Việt nam có khả năng sinh gen cry2A mã hóa protein

tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh và xác định đƣợc trình tự nucleotide của gen
cry2A này.
- Biểu hiện và tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp (rCry2A) trong E.coli BL 21
(DE3).
- Tìm ra đƣợc phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi
khuẩn B. thuringiensis và nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh
tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis khi sử dụng bã malt bia làm
môi trƣờng nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. Đồng thời đánh giá đƣợc sơ bộ hiệu
quả diệt côn trùng bộ hai cánh của chế phẩm BT từ vi khuẩn B. thuringiensis

2


3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus
thuringiensis (B. thuringiensis) có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh.
- Nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự đƣợc gen cry2 của các chủng Bt
phân lập từ đất, lá có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánhcủa chủng vi khuẩn B.
thuringiensis tuyển chọn.
- Nghiên biểu hiện gen mã hóa protein Cry2 diệt côn trùng bộ hai cánh của
chủng vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn.
- Nghiên cứu các phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi
khuẩn B. thuringiensis. Hoàn thiện môi trƣờng lên men vi khuẩn B. thuringiensis từ
bã malt bia.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein
tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn khi sử dụng bã malt bia làm môi
trƣờng nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Lên men sản xuất chế phẩm sinh học diệt côn trùng bộ hai cánh từ vi khuẩn
B. thuringiensis tuyển chọn và đánh giá sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ hai cánh
của chế phẩm trong phòng thí nghiệm và ngoài thực địa.

4. Những đóng góp mới của luận án
- Phân lập và tuyển chọn đƣợc 7 chủng vi khuẩn B. thuringiensis mang gen
cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh cao.
- Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ
thống về gen cry2A từ chủng vi khuẩn B. Thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4
của Việt Nam có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh phục vụ cho việc phát triển
thuốc trừ sâu sinh học.
- Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen cry2A của các chủng B. thuringiensis
Việt Nam phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng về sau.

3


- Sử dụng bã malt bia là một chất thải của ngành sản xuất đồ uống làm
nguồn nguyên liệu cung cấp các chất dinh dƣỡng (các bon, nitơ, chất khoáng…) cho
sự sinh trƣởng của vi khuẩn B. thuringiensis và đƣợc sử dụng nhƣ một nguyên liệu
thay thế cho các hợp chất hữu cơ tổng hợp đắt tiền để sản xuất thuốc trừ sâu sinh
học BT.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu một cách hệ thống và đầy đủ về gen cry2A là cơ sở khoa học đáng
tin cậy cho những nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn Bacillus thuringiensis nói chung và
gen cryA nói riêng. Trên cơ sở đánh giá đƣợc tác động của gen cryA mã hóa protein
tinh thể có khả năng diệt đƣợc một số côn trùng bộ hai cánh nhƣ ruồi nhà là một bƣớc
đi mới để mở ra khả năng tạo ra đƣợc các chế phẩm sinh học diệt các côn trùng này.
Kết quả của luận án còn góp phần phát triển công nghệ lên men chế phẩm BT từ nguồn
nguyên liệu thay thế rẻ tiền là phế thải của ngành sản xuất bia.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án góp phần khai thác có hiệu quả nguồn gen của vi sinh
vật nói chung và gen cry2A của vi khuẩn B. thuringiensis nói riêng để góp phần tạo

ra các chế phẩm sinh học diệt một số côn trùng bộ hai cánh.Mặt khác sử dụng bã malt
bia - một loại chất thải của ngành sản xuất công nghiệp đƣợc xử lý thành nguồn
nguyên liệu cho quá trình sản xuất khác chế phẩm BT là rất cần thiết. Đây là một
hƣớng nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị của bã malt bia, tạo ra sản phẩm thân thiện
môi trƣờng phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững.

4


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis
Năm 1870, Louis Pasteur phát hiện một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh
cho tằm và ông đặt tên loại vi khuẩn này là Bacillus bombyces. Năm 1901, Bacillus
soto đƣợc nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata phát hiện và đặt tên khi ông
nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu. Đến mƣời năm sau (1911), loài vi khuẩn này đƣợc
nhà khoa học ngƣời Đức là Berliner phân lập đƣợc từ xác ấu trùng bƣớm Địa Trung
Hải (Anagasta kuhniella) và ông đã có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn đất
này, đó là vi khuẩn đất có tế bào hình que, có khả năng sinh bào tử. Đến năm 1915,
vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensisdo phân lập từ nhà máy bột
vùng Thuringen của Đức.
Từ đó, chế phẩm sử dụng B. thuringiensis để diệt sâu đục thân có hại
Angasta kuhniella ở châu Âu đƣợc ra đời năm 1930 tên là chế phẩm BT. Chế phẩm
thƣơng mại đầu tiên đƣợc sản xuất để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp năm 1938.
Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có
bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh đƣợc hoạt tính diệt sâu của B.
thuringiensislà do tinh thể độc này đƣợc sinh ra từ tế bào và bào tử vi khuẩn.
Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thƣơng mại của B.
thuringiensis đã đƣợc sản xuất ở nhiều quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức. Sau
đó, Howard Dulmage và Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA

đã thu thập đƣợc bộ sƣu tầm đầu tiên về các chủng B. thuringiensis. Năm 1962, De
Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra phƣơng pháp phân loại mới cho các chủng B.
thuringiensis và B. sphaericus (Bs) bằng phƣơng pháp huyết thanh. Năm 1970,
Dulmage đã phân lập đƣợc chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn đƣợc sử dụng cho
nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm B. thuringiensis.
Trong những năm 1970 và 1980, rất nhiều nghiên cứu về B. Thuringiensis

5


đƣợc thực hiện nhằm tìm ra phổ côn trùng đích của B. thuringiensis. Năm 1977,
Goldberg và Margarit đã phát hiện ra B. thuringiensis subsp. isralensis diệt đƣợc cả
ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Đặc biệt, gen mã hóa protein tinh thể diệt
sâu đầu tiên đƣợc tách dòng và đọc trình tự năm 1981. Từ đó trở đi, rất nhiều gen
của vi khuẩn B. thuringiensis đã đƣợc tách dòng và nghiên cứu đặc tính diệt côn
trùng. Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phát hiện dƣới loài Bacillus thuringiensis
subsp. tenebrionis diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu
Tenebrio molitar. Sau đó không lâu thì công ty Mycogen phát hiện chủng tƣơng tự
B. thuringiensis subsp. morrisoni đặt tên là B. thuringiensis subsp. sandiego và đã
tổng hợp đƣợc chuỗi gen độc tố của chúng. Đặc biệt, vi khuẩn này còn đƣợc phát
hiện ra hoạt tính đối với giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và
diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Đáng chú ý, đây cũng là giai đoạn diễn ra những
nghiên cứu đầu tiên về chuyển gen B. thuringiensis vào cây trồng (1985).
Giai đoạn từnăm 1990 đến nay, các phƣơng pháp truyền thống nhằm tuyển
chọn và đánh giá hoạt tính của các chủng B. thuringiensis thông qua các thử nghiệm
hoạt tính sinh học và kiểm tra đặc tính sinh hóa dần dần đƣợc thay thế bởi PCR đặc
hiệu cho các gen mã hóa độc tố. Phổ côn trùng đích không chỉ thu đƣợc nhờ việc
phát hiện ra các độc tố mới mà còn nhờ việc tạo ra các chủng B. thuringiensis mới
không chỉ mang những gen mã hóa độc tố sẵn có mà còn mang những gen mới
đƣợc chuyển vào bằng chuyển nạp hoặc biến nạp trực tiếp (Osman và cộng sự,

2015). Đáng chú ý là năm 1995, cây chuyển gen thƣơng phẩm đầu tiên đƣợc đƣa
vào sản xuất, từ đó một chƣơng trình mới về ứng dụng B. thuringiensis vào cây
trồng - thực vật chuyển gen (Genetically Modified Organisms - GMOs). Cho đến
năm 2009 (Sanahuja và cộng sự, 2011), tổng diện tích toàn cầu dành cho cây trồng
chuyển gen kháng côn trùng từ B. thuringiensis trong năm 2009 là> 50 triệu ha
(36% tổng số cây trồng biến đổi gen) (James, 2010). Một loạt các cây trồng chuyển
gen cry1A, cry1Ab và cry1Actừ B. Thuringiensis đƣợc thử nghiệm ở quy mô lớn
vào năm 2007 (Huang và cộng sự, 2007) và đã đƣợc thƣơng mại hóa vào tháng 11
năm 2009.
6


Gần đây, việc chuyển gen từ B. thuringiensis vào cây đã thành công đáng kể.
Mặc dù vậy, các nghiên cứu tìm kiếm các chủng có hoạt lực cao hơn vẫn tiếp tục
đƣợc thực hiện (Christou và cộng sự, 2006; Crickmore, 2006). Đặc biệt, các phƣơng
pháp nghiên cứu protein có thể đƣợc sử dụng để sàng lọc các độc tố mới trên quy
mô lớn. Sun và Park (2010) gần đây đã xác định Cry60Ba từ B. thuringiensis
serovar malayensis có hoạt tính diệt muỗi và Zhang và cộng sự (2010) gần đây đã
phân lập chủng LLP29 từ phylloplane của Magnolia denudate, xác định một độc tố
mới (Cyt1Aa6) gây chết ấu trùng muỗi (Sanahuja và cộng sự, 2011).Đặc biệt, rất
nhiều nghiên cứu gần đây tập trung vào viêc nâng cao độc tính của các protein Cry
bằng các kỹ thuật protein nhƣ thay thế axit amin, đƣa các vị trí phân cắt vào vùng
đặc hiệu của protein hoặc loại bỏ các mảnh nhỏ từ vùng đầu N (Pardo-López và
cộng sự, 2009).
1.1.2. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis
1.1.2.1. Vị trí phân loại
Bacillus thuringiensis đƣợc xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae,
ngành Firmicutes. Nhóm này gồm hơn 20 loài khác nhau, ngoài B. thuringiensis
còn có vi khuẩn B. subtilis, B. cereus (vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm), vi khuẩn
B. anthracis (vi khuẩn gây bệnh than). Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus thƣờng đƣợc

coi là vi khuẩn đất, sống trong môi trƣờng đất, côn trùng và bề mặt tiếp xúc với côn
trùng (Eugene và cộng sự, 2000).
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái
B. thuringiensis hình que có khả năng di động nhờ có tiên mao mọc trên bề
mặt tế bào, bắt màu Gram dƣơng. Vi khuẩn B. thuringiensis hô hấp hiếu khí hoặc kị
khí không bắt buộc. Mỗi tế bào B. thuringiensis có khả năng sinh bào tử và tinh thể
độc có bản chất protein có khả năng diệt côn trùng. Kích thƣớc tế bào khoảng 0,8 1,4µm x 2,5 – 10µm (Canh và cộng sự, 2004). Đặc điểm chung là bào tử hình oval,
kích thƣớc 0,5 - 1,2µm x 1,5 - 2,6 µm, quá trình hình thành bào tử không làm thay
đổi hình dạng tế bào. Một đặc điểm quan trọng là trong quá trình hình thành bào tử
7


hầu hết các chủng B. thuringiensisđều tổng hợp protein tinh thể.Protein tinh thể ở
mỗi chủng khác nhau sẽ có hình dạng, kích thƣớc và số lƣợng khác nhau, tuy nhiên
các protein tinh thể này mang đặc điểm chung là có khả năng gây độc đối với nhiều
loài côn trùng. Khi ở trong tế bào sinh dƣỡng, tinh thể thƣờng nằm kề với bào tử;
khi tế bào tan, tinh thể và bào tử đều thoát ra ngoài (Dean, 1984).
Trong môi trƣờng lỏng B. thuringiensis có khả năng chuyển động, khả năng
này có đƣợc là nhờ các lông roi trên bề mặt tế bào có kích thƣớc lớn hơn 0,9 µm
(Thiery và Frachon, 1997).

Hình 1.1. Hình ảnh bào tử và tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis
Mũi tên đỏ: Bào tử; mũi tên xanh: tinh thể
Ảnh chụp bằng kính hiển vi đối pha(EFSA BIOHAZ Panel, 2016).
B. thuringiensis đƣợc xem nhƣ là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều
môi trƣờng khác nhau nhƣ côn trùng, thực vật, đất và bụi khi lƣu trữ nông sản
(Ibrahim và cộng sự, 2008).
1.1.2.3. Đặc điểm sinh hóa
B. thuringiensis không lên men sinh axit trong môi trƣờng có chứa đƣờng
arrabinoza, xylose, manitol, nhƣng sinh axit ở môi trƣờng có chứa đƣờng glucose;

có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển đƣợc ở môi trƣờng
có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5,7 có phản ứng với lòng đỏ trứng

8


gà; không sử dụng axit citric, không khử muối sunphat. B. thuringiensis có khả
năng sinh trƣởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 45oC. Nhiệt độ tối ƣu cho
sinh trƣởng là 28 - 30oC. B. thuringiensis không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối
ƣu cho sự phát triển của B. thuringiensis là pH = 7. B. thuringiensis có khả năng
oxy hoá hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình EmbdenMeyerhoff- Panas.
1.1.3. Đặc điểm phân loại
Có nhiều phƣơng pháp phân loại B. thuringiensis khác nhau đƣợc sử dụng
trong các nghiên cứu, cụ thể:
a. Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, sinh hóa
B. thuringiensis đƣợc phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh
hóa (Heimpel và cộng sự, 1958), kết hợp với các phƣơng pháp phân loại đã đƣợc
mô tả bởi Gordon (1973), Claus và Berkeley (1986), Logan và Devos (2009). Đây
đƣợc xem là công cụ hiệu quả trong việc phân loại các vi khuẩn sinh bào tử nhƣ B.
thuringiensis (Logan và cộng sự, 2009; Rabinovitch và cộng sự, 2017). Tuy nhiên
phân loại theo phƣơng pháp này không phân biệt đƣợc các chủng B. thuringiensis
một cách rõ ràng bởi vì B. thuringiensis có các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
rất giống các đại diện trong nhóm trực khuẩn sinh bào tử B. cereus, B. thuringiensis,
B. mycoides, B. anthacis, B. pseudomycoides và B.weihenstephanensis (Canh và
cộng sự, 2004; Barjac và Frachon, 1990).
b. Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên H (de Barjac và Bonnefoi, 1962;
1973).
Năm 1962, Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra một phƣơng pháp phân loại B.
thuringiensis bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 typ huyết thanh chính có
hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động

vật, động vật chân khớp…Phƣơng pháp phân loại theo typ huyết thanh H đƣợc sử
dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao.

9


Nguyên lý: kháng nguyên lông roi có khả năng kết hợp với kháng thể tạo ra
phản ứng ngƣng kết, với dấu hiệu điển hình là tạo ra cặn lắng màu trắng xuống
đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Dƣới kính hiển vi đối pha
hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không
chuyển động đƣợc.
Cho đến năm 2016, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 69 typ huyết thanh, bao gồm
82 thứ huyết thanh khác nhau của B. thuringiensis (EFSA BIOHAZ Panel (EFSA
Panel on Biological Hazards), 2016). Đây là phƣơng pháp phân loại đã đƣợc sử
dụng phổ biến và là phƣơng pháp đáng tin cậy đƣợc trung tâm quốc tế Bacillus
thuringiensis đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí
nghiệm B. thuringiensis trên thế giới từ năm 1982 (Ngô Đình Bínhvà cộng sự,
2002, Lecadet và cộng sự; 1999; Zheng và cộng sự, 2017).
c. Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực
khuẩn thể khác nhau (Ackermann và cộng sự, 1995).
d. Phân loại theo đối tƣợng gây bệnh, dựa trên hoạt tính kháng côn trùng bộ cánh
vảy, bộ hai cánh và bộ cánh cứng. Ngoài ra, các chủng B. thuringiensis cũng đƣợc
phân lập có hoạt tính kháng côn trùng bộ cánh màng, bộ cánh thẳng, giun tròn, mối
và động vật nguyên sinh (Ibrahim và cộng sự, 2010).
e. Phân loại bằng phƣơng pháp sinh học phân tử: Có nhiều công cụ phân tử đã đƣợc
đề xuất nhƣ 16S, 23S rDNA RNA, RAPD, RFLP, REP-PCR, ERIC-PCR và MLST.
Ngoài ra, gen gyrB (gen house-keeping mã hóa tiểu phẩn B của DNA gyrase,
topoisomerase loại I) đƣợc coi là một công cụ hữu ích trong việc phân loại các
thành viên nhóm B. cereus (Park và cộng sự, 2007). Tuy nhiên, do sự đa dạng loài,
sự không đồng nhất giữa phổ gen và hoạt tính diệt côn trùng của các chủng B.

thuringiensis, việc ứng dụng những phƣơng pháp này gặp nhiều khó khăn (Bottone,
2010; Logan, 2012; Sanchis và Bourquet, 2009; Rabinovitch và cộng sự, 2017).

1.1.4. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
10


Kích thƣớc hệ gen của vi khuẩn B. thuringiensis vào khoảng 2,4 - 5,7.106bp.
Trên thế giới một số chủng B. thuringiensis. đã đƣợc mô tả bản đồ cấu trúc gen tự
nhiên. So sánh hệ gen cho thấy các chủng B. thuringiensis có cùng tổ chức ở vùng
gần điểm khởi đầu sao chép và thể hiện biến đổi lớn hơn ở vùng còn lại (Carlson và
cộng sự, 1996). Thể nhân (nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thủy,
chƣa có màng nhân nên không có hình dạng nhất định và đƣợc gọi là vùng nhân.
Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn B. thuringiensis. Hầu hết các
chủng B. thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài NST, các nhân tố
di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng (Lereclus và cộng sự, 1983).
Trong một thời gian dài ngƣời ta cho rằng các protein tinh thể đƣợc mã hóa chung
trên các plasmid lớn. Khi sử dụng kỹ thuật lai ADN với các mẫu dò cho gen cry đã
nhận thấy chúng có mặt cả trên NST (Bietlot và cộng sự, 1993; Kalman và cộng sự,
1995).
1.1.5. Đặc điểm protein độc tố diệt côn trùng
Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại của
các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu (ICP -Insecticidal Crystal Protein) ở các
loài phụ B. thuringiensis khác nhau. Một số nghiên cứu về mối tƣơng quan giữa sự
có mặt của plasmid và khả năng hình thành tinh thể diệt côn trùng. Các phƣơng
pháp xử lý plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã chứng minh rằng
các gen mã hoá protein diệt côn trùng thƣờng nằm trên các plasmid lớn có số bản
sao thấp. Theo kết quả nghiên cứu của Carlton và Gonzalez, plasmid có mặt trong
hầu hết các chủng B. thuringiensis, số lƣợng plasmid dao động từ 2 đến 12 trong
các chủng nghiên cứu. Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại

các gen tổng hợp nhiều độc tố trong một tế bào B. thuringiensis. Ví dụ các plasmid
trong B. thuringiensis. aizawai và kurstaki HD-1 có 5 gen mã hóa protein diệt côn
trùng nằm ở nhiều vị trí khác nhau trong tế bào (Ngô Đình Bínhvà cộng sự, 2002;
Ereclus và cộng sự, 1994).
1.1.5.1. Phân loại độc tố diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis

11