Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (18.15 MB, 92 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
HÀ THỊ TÂM TIẾN
NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH
HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC
9161
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
i
Hà Nội 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Hà Thị Tâm Tiến
NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH
HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC
9161
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỖ THỊ TUYÊN
PGS.TS. NGUY ỄN QUANG
HUY
ii
Hà Nội 2013
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị
Tuyên, Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu,
hướng dẫn, sửa luận văn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài luận văn
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trưởng khoa,
Phụ trách Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã hướng dẫn,
quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tâp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng
Công nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã tạo
mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian cho tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ
sinh học, tập thể Bộ môn Sinh lý thực vật và hóa sinh, trường Đại học Khoa học
tự nhiên, đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng
như chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Hùng Vương, Phòng tổ chức
cán bộ, Khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Hùng Vương đã luôn quan tâm,
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đi học và hoàn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
iii
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè và đồng
nghiệp đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Hà Nội, tháng 11 năm 2013
Học viên
Hà Thị Tâm Tiến
MỤC LỤC
MỤC LỤC
...................................................................................................
iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU
.......................................................................
viii
DANH MỤC HÌNH VẼ
..............................................................................
ix
BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT
..................................................
xiii
MỞ ĐẦU
.....................................................................................................
1
CHƯƠNG . 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
.........................................................
3
.1.1. Khái quát về acarbose
.................................................................
3
.1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose
.................................................
3
.1.3. Vai trò của acarbose
....................................................................
5
.1.3.1. Vai trò của acarbose đối với bệnh đái tháo đường
.............
5
.1.3.2. Nghiên cứu về các tác dụng khác của acarbose
.................
8
.1.4. Vai trò Actinoplanes trong sinh tổng hợp acarbose
....................
9
.1.4.1. Đại cương về Actinoplanes
................................................
9
iv
.1.4.2. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
................................
10
.1.4.3. Ứng dụng Actinoplanes trong sản xuất acarbose
.............
12
.1.5. Nghiên cứu hoạt chất acarbose trên thế giới
...........................
13
.1.5.1. Nghiên cứu về sản xuất acarbose
.....................................
13
.1.5.2. Nghiên cứu về ứng dụng đột biến trên vi sinh vật
..........
17
.1.5.3. Các phương pháp tinh sạch và thu nhận acarbose
............
18
.1.5.4. Nghiên cứu sản xuất acarbose trong nước
.......................
21
CHƯƠNG . 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
.........................................
24
.2.1. Vật liệu và hóa chất
.................................................................
24
.2.1.1. Chủng giống
......................................................................
24
.2.1.2. Hóa chất
.............................................................................
24
.2.1.3. Môi trường
.........................................................................
24
.2.1.4. Thiết bị thí nghiệm
............................................................
25
.2.2. Phương pháp nghiên cứu
..........................................................
26
.2.2.1. Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật
...................................
26
.2.2.2. Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose của
chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
..................................................
26
.2.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
...................................
27
.2.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitrogen khi nuôi cấy . 27
.
.2.2.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc, nhiệt độ và pH khi nuôi cấy 27
.2.3. Gây đột biến bằng NTG
...........................................................
28
v
.2.4. Sắc ký lớp mỏng TLC
..............................................................
28
.2.5. Hoạt tính ức chế αglucosidase của hoạt chất acarbose
........
29
.2.6. Tách chiết và tinh sạch acarbose
..............................................
30
.2.6.1. Tách chiết và tinh sạch sơ bộ
...........................................
30
.2.6.2. Tinh sạch acarbose bằng sắc ký cột
.................................
30
.2.7. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
......................................................
32
.2.8. Sắc ký lỏng ghép khối phổ
......................................................
32
.2.9. Xác định cấu trúc phân tử acarbose bằng cộng hưởng từ hạt
nhân
.........................................................................................................
33
.2.10. Phương pháp xử lý số liệu
.....................................................
33
CHƯƠNG . 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
................................................
34
.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy
................................................
34
.3.2. Tối ưu các thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy
37
.................................................................................................................
.3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian
...................................................
37
.3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn maltose
.........................................
38
.3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn glucose
..........................................
40
.3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn bột ngô
.........................................
42
.3.2.5. Ảnh hưởng của pH môi trường
.........................................
43
.3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
....................................
44
.3.2.7. Ảnh hưởng của tốc độ lắc
................................................
45
.3.2.8. Môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu
.........................
46
vi
.3.2.9. Xác định hàm lượng acarbose bằng HPLC
.......................
47
.3.3. Gây đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
..................
49
.3.4. Tinh sạch acarbose có hoạt tính ức chế αglucosidase
...........
51
.3.4.1. Chọn lựa các phương pháp tinh sạch acarbose từ dịch lên
men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
..........................................
51
.3.4.1.1. Tinh sạch bằng sắc ký hấp thụ silica gel
..................
51
.3.4.1.2. Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sephadex G100
..........
52
.3.4.1.3. Tinh sạch bằng cột than hoạt tính 1
..........................
53
.3.4.2. Chọn lựa các phương pháp tinh sạch acarbose từ dịch qua
cột than 1
.............................................................................................
54
.3.4.2.1. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion amberlite
IRA400
............................................................................................
54
.3.4.2.2. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion DEAE
sepharose
.........................................................................................
55
.3.4.3. Tinh sạch và thu nhận acarbose
.........................................
55
Như vậy chúng tôi đã tinh sạch được hoạt chất acarbose từ dịch
lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 với kết quả được trình
bày ở bảng 3.1. Từ 500 ml dịch lên men với hàm lượng 10,48 mg/ml
acarbose, qua các bước tinh sạch thu được 20 ml dịch acarbose tinh
sạch cô đặc có hàm lượng 191,5 mg/ml acarbose. Như vậy, hiệu
suất thu hồi sau quá trình tinh sạch đạt 73,1% acarbose.
..................
59
.3.4.4. Hoạt tính ức chế αglucosidase
........................................
59
.3.5. Xác định cấu trúc hóa học acarbose
.........................................
60
vii
.3.6. Quy trình tách chiết tinh sạch acarbose
....................................
64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
....................................................................
65
Kết luận
.....................................................................................................
65
Kiến nghị
...........................................................................................
66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
..........................................................................
66
PHỤ LỤC
...................................................................................................
73
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật .........................24
Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị thí nghiệm được sử dụng....................25
Bảng 2.3. Các môi trường khảo sát nghiên cứu.......................................26
Bảng 3.4. Khối lượng chế phẩm qua các bước tinh sạch acarbose........59
viii
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của acarbose....................................................3
Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose trong ruột non.........................4
Hình 1.3. Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161.......................12
ix
Hình 3.4. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong các môi trường lên men.........................35
Hình 3.5. Hoạt tính ức chế αglucosidase trong các môi trường lên men
.........................................................................................................................36
Hình 3.6. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian..................................................37
Hình 3.7. Hoạt tính ức chế αglucosidase của hoạt chất acarbose từ dịch
lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian.........................38
Hình 3.8. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về
ảnh hưởng của nồng độ maltose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose
chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161..............................................................39
Hình 3.9. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về
ảnh hưởng của nồng độ glucose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ
chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161..............................................................41
Hình 3.10. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về
ảnh hưởng của nồng độ bột ngô đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ
chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161..............................................................42
Hình 3.11. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về
ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ
chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161..............................................................44
Hình 3.12. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về
ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ
chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161..............................................................45
x
Hình 3.13. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) về
ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161..........................................................................46
Hình 3.14. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế αglucosidase (b) hoạt
chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong môi
trường trước và sau tối ưu.............................................................................47
Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 916 trong môi trường tối ưu...................................48
Hình 3.16. Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ các dòng
đột biến của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161........................................50
Hình 3.17. Hoạt tính ức chế αglucosidase của hoạt chất acarbose sinh
tổng hợp từ các dòng đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161...........50
Hình 3.18. Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men biến thể
N217 gây đột biến từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161..........................51
Hình 3.19. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên
men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột silica gel....................52
Hình 3.20. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên
men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột sephadex G100..........52
Hình 3.21. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên
men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột than hoạt tính 1 ........53
Hình 3.22. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột
sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400. .......................................................55
xi
Hình 3.23. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột
sắc ký trao đổi anion DEAEsepharose .........................................................55
Hình 3.24. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột
than hoạt tính 2...............................................................................................56
Hình 3.25. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của chuẩn acarbose............57
Hình 3.26. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose từ
dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161.........................................58
Hình 3.27. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose tinh
sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161...........................58
Hình 3.28. Hoạt tính ức chế αglucosidase của hoạt chất acarbose từ
chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sau khi qua các cột tinh sạch..............59
Hình 3.29. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13CNMR của hoạt chất
acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161.....61
Hình 3.30. Phổ proton 1HNMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ d ịch
lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161.................................................62
Hình 3.31. Cấu trúc phân tử acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161..........................................................................63
Hình 3.32. Qui trình tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161..........................................................................65
xii
BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT
13
CNMR
Carbon13, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
HNMR
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13)
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
cs
ĐTĐ
NMR
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)
Cộng sự
Đái tháo đường
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
NTG
pNPG
Rf
TLC
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)
NmethylN’nitroNnitrosoguanidine
pnitrophenylαDglucopyranoside
Độ di động
Thin layer chromatography
1
(Sắc ký lớp mỏng)
xiii
xiv
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
MỞ ĐẦU
Đái tháo đường (ĐTĐ) hiện nay là một vấn đề sức khỏe mang tính chất toàn
cầu, ảnh hưởng đến nhiều người, nhất là trong độ tuổi lao động trên toàn thế
giới. Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới (WHO) ước tính mỗi năm trên thế
giới có 3,4 triệu người chết do đái tháo đường, trong đó 80% các ca tử vong xảy
ra ở những nước đang phát triển. Hiện nay trên thế giới có 347 triệu người mắc
bệnh đái tháo đường, có 90% số ca mắc đái tháo đường type 2. Chi phí về y tế
dành cho căn bệnh này đã tăng lên 465 tỷ USD .
Ở Việt Nam, theo tổng hội Y học Việt Nam, năm 2012 có 5,7% dân số mắc
ĐTĐ và 12,8% số người mắc rối loạn dung nạp đường. Với tỷ lệ bệnh nhân
tăng 810% mỗi năm, Việt Nam trở thành nước có tỷ lệ gia tăng bệnh ĐTĐ nhanh
nhất thế giới. Chi phí điều trị ĐTĐ chiếm 6% ngân sách của ngành Y tế và hầu
hết đều tập trung cho biến chứng của ĐTĐ như: bệnh tim mạch, tai biến mạch
máu não, mù lòa, hoại tử chi, suy thận gây ra .
Các thuốc điều trị ĐTĐ type 2 chủ yếu tập trung vào nhóm chất có hoạt tính
ức chế αglucosidase như: acarbose, miglitol, voglibose, 1deoxynojimycine.
Acarbose là hợp chất hữu cơ giả đường pseudooligosaccharide có tác dụng
kìm hãm hoạt động của αglucosidase, là enzyme chuyển hóa các oligosaccharide
thành glucose và monosaccharide trong ruột non, với ưu điểm làm giảm đường
huyết sau ăn, không làm tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn
tế bào beta, giảm nồng độ HbA1c, triglyceride và giảm các biến chứng do tiểu
đường. Do đó, acarbose được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh đái tháo đường
type 2, tạo cho bệnh nhân khả năng kiểm soát hàm lượng đường trong máu tốt
hơn sau khi ăn thức ăn chứa tinh bột. Acarbose được sinh tổng hợp từ các chủng
vi sinh vật khác nhau như Streptomyces, đặc biệt là chủng Actinoplanes.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
1
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Hiện nay, ở Việt Nam nhu cầu sử dụng dược phẩm để sản xuất thuốc chữa
bệnh ĐTĐ chủ yếu được nhập từ nước ngoài với giá thành cao, hoặc sử dụng
thuốc có nguồn gốc từ thảo dược như quả mướp đắng xanh có chứa hoạt chất
charantin, glycosid steroid có tác dụng hạ đường máu, làm tăng khả năng dung
nạp glucose của người bệnh; dây thìa canh chứa gymnemic acid làm tăng tiết
insulin của tuyến tụy; bạch truật có hoạt chất achactan A, B và C có tác dụng hạ
đường máu; cam thảo đất có hoạt chất amellin có thể làm giảm đường máu và
các triệu chứng của bệnh ĐTĐ type 2... Tuy nhiên sử dụng nguồn nguyên liệu từ
thảo dược phụ thuộc nhiều vào thời vụ, với hàm lượng hoạt chất thấp, số
nguyên liệu sử dụng phải rất nhiều, một số thảo dược quý hiếm ngày càng khan
hiếm. Do đó, việc sản xuất các hoạt chất bằng sử dụng nguồn vi sinh vật đang
là một hướng nghiên cứu mới và cấp thiết. Việc sản xuất acarbose từ xạ khuẩn
Actinoplanes sẽ mang lại hiệu quả kinh tế, sản xuất nhanh, chủ động, giá thành
thấp do sử dụng nguồn nguyên liệu dễ kiếm. Xuất phát từ những lý do trên,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch
hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161” trong khuân khổ đề
tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose làm nguyên liệu thuốc
chữa bệnh đái tháo đường” do TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm với các mục
tiêu: (1) Tối ưu được môi trường lên men thu nhận hoạt chất acarbose từ
Actinoplanes sp. KCTC 9161 đạt năng xuất cao; (2) Nâng cao khả năng sản xuất
hoạt chất acarbose bằng phương pháp gây đột biến; (3) Xây dựng được quy trình
tách chiết, tinh sạch acarbose.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
2
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
CHƯƠNG . 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
.1.1. Khái quát về acarbose
Acarbose là một pseudooligosacharide có tên hóa học O{4,6dideoxy4[1S
(1,4,6/5)4,5,6trihydroxy3hydroxymethyl2cyclohexen1yl]aminoαDgluco
pyranosyl}(1→4)OαDglucopyranosyl(1→4)Dglucopyranose. Acarbose có
cấu trúc lõi acarviosyl gồm một nửa valienamine liên kết với 4amino4,6
dideoxyglucose qua liên kết Nglycosidic (Hình 1.1). Acarviosyl liên kết với phân
tử maltose qua liên kết α1,4 tạo nên phân tử acarbose hoàn chỉnh . Acarbose
thành phẩm có dạng bột màu trắng, trọng lượng phân tử 645,6, có thể hòa tan
trong nước, trong ethanol, methanol, có pKa 5,1 và công thức phân tử C25H43NO18.
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của acarbose
.1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose
Acarbose là một chất ức chế cạnh tranh. Khả năng ức chế cạnh tranh của
acarbose có được là nhờ vào cấu tạo phân tử của nó. Acarbose có cấu trúc và kích
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
3
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
thước gần giống với một tetrasachacride: gồm có bốn tiểu phần nhỏ cấu tạo nên.
Bốn tiểu phần này nối với nhau bằng liên kết α1,4 giống như trong phân tử
đường. Do đó, acarbose có thể liên kết dễ dàng với αglucosidase, cạnh tranh vị
trí liên kết với các oligosaccharide (Hình 1.2).
Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose trong ruột non
Khi ăn, tinh bột bị αamylase thủy phân thành các oligosaccharide; ở màng ruột
non, αglucosidase tiếp tục thủy phân oligosaccharide, trisaccharide và
disaccharide thành glucose và các monosaccharide khác. Acarbose liên kết trực
tiếp với αglucosidase ở bề mặt niêm mạc ruột non, những liên kết trên có thể
kéo dài từ 46 giờ, khi đó αglucosidase không thể liên kết để thủy phân
oligosaccharide thành glucose. Do đó bệnh nhân tiểu đường tránh được hiện
tượng tăng đường huyết sau khi ăn. Acarbose không có hoạt tính ức chế lactase
và do đó không gây ra hiện tượng không dung nạp lactose trong cơ thể .
Hấp thu acarbose: sau khi uống phần lớn acarbose lưu lại trong ống tiêu hóa
để được các enzyme tiêu hóa và chủ yếu là vi khuẩn đường ruột chuyển hóa để
acarbose phát huy tác dụng dược lý. Dưới 2% liều uống được hấp thụ dưới dạng
thuốc có hoạt tính, trong khi đó khoảng 35% liều uống được hấp thu chậm dưới
dạng chất chuyển hóa được tạo thành trong đường tiêu hóa. Nồng độ đỉnh
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
4
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
acarbose trong huyết tương khoảng 1 giờ sau khi uống. Nồng độ đỉnh các chất
chuyển hóa trong huyết tương từ 1424 giờ sau khi uống.
Chuyển hóa acarbose: acarbose được chuyển hóa hoàn toàn ở đường tiêu hóa,
chủ yếu do vi khuẩn chí đường ruột và một lượng ít hơn do enzyme tiêu hóa.
Đào thải: acarbose hoạt tính được sử dụng trong huyết tương khoảng 2 giờ,
không có hiện tượng tích lũy khi uống 3 lần mỗi ngày. 51% liều uống được đào
thải qua phân dưới dạng acarbose không hấp thu trong vòng 96 giờ. Khoảng 34%
liều uống đào thải qua thận dưới dạng chất chuyển hóa hấp thu. Dưới 2% liều
uống đào thải qua nước tiểu dưới dạng acarbose và chất chuyển hóa hoạt động .
.1.3. Vai trò của acarbose
.1.3.1. Vai trò của acarbose đối với bệnh đái tháo đường
Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là một nhóm các bệnh chuyển hóa được đặc
trưng bởi tăng đường máu mãn tính do hậu quả của sự thiếu hụt hoặc giảm hoạt
động của insulin hoặc cả hai trong cơ thể người bệnh. Trên thế giới, hàng năm
căn bệnh ĐTĐ tiêu tốn hơn 132 tỷ USD. Ước tính năm 2010, có trên 221 triệu
người mắc bệnh ĐTĐ, năm 2025 sẽ lên tới trên 400 triệu người bệnh.
Trong đái tháo đường, ĐTĐ type 2 là dạng ĐTĐ thường gặp nhất. Thông
thường, với bệnh ĐTĐ type 2, trong cơ thể vẫn còn sản xuất insulin, nhưng các
tế bào không thể sử dụng nó. Điều này được gọi là đề kháng insulin. Theo thời
gian, đường huyết sẽ tăng cao trong máu. Béo phì và ít vận động sẽ làm tăng
nguy cơ phát triển bệnh ĐTĐ type 2 .
Các loại thuốc dùng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2: Các dẫn xuất của
sulfonylurea (glibenclamid, glipizid, gliclazid), có tác dụng hạ đường huyết do
ngăn cản tế bào tuyến tụy tạo ra glucagon, kích thích tế bào beta ở tụy tiết ra
insulin. Các loại thuốc hạ đường máu đang được sử dụng trong điều trị bệnh
ĐTĐ gồm: Nhóm thuốc cải thiện sự nhạy cảm của insulin (glitazon, benfluorex)
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
5
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
làm hạ đường huyết, nhờ làm giảm đề kháng insulin, có tác dụng điều hòa
chuyển hóa lipid. Thuốc chữa bệnh ĐTĐ có nguồn từ thực vật chuyển gene,
insulin “thực vật”. Gene tổng hợp insulin được cấy vào cây hoa rum để tổng hợp
insulin; thuốc chữa bệnh ĐTĐ có nguồn gốc từ thảo mộc, chế phẩm dikamo
được phối chế từ cao quả mướp đắng và cao quả nhàu dùng trong điều trị bệnh
ĐTĐ type 2. Quả mướp đắng (Monordica charantia) chứa charantin có hoạt tính
ức chế αglucosidase, hợp chất monordicosid làm giảm đường huyết, có hoạt
tính như insulin . Quả nhàu (Morinda citrifolia) làm tăng cường miễn dịch, hỗ trợ
việc trị bệnh ĐTĐ type 2 . Cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre) có hoạt chất
chính là gymnemic acid làm tăng tiết, tăng cường hoạt lực của insulin tuyến tụy,
ức chế hấp thu glucose ở ruột, giảm cholesterol và lipid máu, làm dược liệu quý
cho người bệnh ĐTĐ ở Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ, Nhật, Singapore từ lâu . Ngoài
ra cây é tía (Ocimum tenuiflorum), dừa cạn (Catharanthus roseus), hoài sơn
(Dioscorea persimilis) dùng để điều chế hoạt chất metformin chữa bệnh ĐTĐ ;
nhóm thuốc ức chế men αglucosidase dùng điều trị ĐTĐ type 2: acarbose,
miglitol, voglibose, có thể dùng một mình hoặc kết hợp với insulin hoặc các
thuốc điều trị bệnh ĐTĐ khác.
Acarbose là một oligosaccharide phức tạp có tác dụng ức chế việc tiêu hóa
carbohydrate, kìm hãm sự gia tăng nồng độ đường trong máu sau bữa ăn.
Acarbose làm giảm mức độ glycosyl hóa hemoglobin ở bệnh nhân ĐTĐ type 2.
Hệ thống phi enzyme proteinđường như được phản ánh theo mức độ đường
huyết, làm chức năng duy trì nồng độ đường huyết trung bình trong cơ thể. Vì
vậy, acarbose có thể kiểm soát hàm lượng đường trong máu của bệnh nhân sau
khi ăn.
Acarbose là chất ức chế enzyme αglucosidase trong ru ột, làm chậm tiêu hóa
và hấp thu carbohydrate. Kết quả là glucose máu tăng chậm hơn sau ăn, giảm
nguy cơ tăng glucose máu và nồng độ glucose máu ban ngày ít dao động hơn . Do
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
6
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
đó, acarbose đã được sử dụng là thuốc điều trị ĐTĐ type 2 với ưu điểm không
làm tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta, giảm
nồng độ HbA1c, triglyceride và giảm các biến chứng do tiểu đường. Acarbose
không có hoạt tính ức chế chống lại lactase và do đó sẽ không gây ra hiện tượng
không dung nạp lactose trong cơ thể. Ngoài ra, acarbose có thời gian bán hủy
tương đối lâu, khoảng từ 68 giờ và được chuyển hóa hoàn toàn trong ruột
người. Các sản phẩm chuyển hóa chủ yếu là dẫn xuất của 4methylpyrogallol
không độc. Một phần nhỏ được hấp thụ vào máu sẽ được bài tiết qua đường
nước tiểu .
Hiện nay, acarbose được nhiều công ty dược phẩm sản xuất và bán ở 110
nước trên thế giới với nhiều tên thương mại khác nhau như: glucobay® (Châu
Âu và Trung Quốc), precose® (Mỹ), glucor® (Pháp) và prandase® (Canada). Ở
nước ta Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang sản xuất viên nén có tên thương mại
glumeca, glucobay với hàm lượng 100 mg acarbose.
Thuốc acarbose được dùng đơn hoặc có thể kết hợp với các thuốc trị liệu
khác như sulfonylurea, metformin hoặc insulin để điều trị bệnh ĐTĐ type 2. Khi
dùng liệu pháp một thuốc, acarbose làm giảm nồng độ trung bình của hemoglobin
glycosylate (0,6 đến 1%), giảm hemoglobin glycosylate tương quan với giảm
nguy cơ biến chứng vi mạch ở người đái tháo đường. Trái với thuốc đái tháo
đường sulfonylurea, acarbose không làm tăng tiết insulin. Acarbose cũng không
gây giảm glucose máu lúc đói khi dùng đơn trị liệu ở người. Khi dùng điều trị
phối hợp với thuốc sulfonylurea chúng sẽ có tác dụng cộng hợp do cơ chế tác
dụng của hai loại thuốc này khác nhau. Do đó, acarbose không gây tăng cân và
cũng không làm giảm tác dụng hướng đến insulin của sulfonylurea.
Hiệu quả điều trị ĐTĐ type 2 bằng acarbose đã được nhiều tác giả nghiên
cứu: Mori và cs (2011) đã đánh giá ảnh hưởng của acarbose đến sự biến động
glucose ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 bằng cách giám sát glucose liên tục (continuous
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
7
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
glucose monitoring, CGM). CGM được thực hiện trong 4 ngày, với hàm lượng
300 mg acarbose/ngày. Tổng cộng 10 bệnh nhân (5 nam và 5 nữ), với độ tuổi
trung bình 63,1±12,1 tuổi, chỉ số khối cơ thể 22,6±5,4 kg/m và glycohemoglobin
là 9,9±1,9%. Trong thời gian điều trị với acarbose, ba giá trị trung bình (hàm
lượng glucose trong máu, SD của glucose máu, biên độ đường huyết giao động
bất thường) đều giảm đáng kể sau 24 giờ ở nhóm bệnh nhân điều trị so với
nhóm không điều trị. Như vậy acarbose đã làm giảm đường huyết dao động quá
mức ở người .
Tsujino và cs (2011) đã so sánh sự biến đổi glucose ở 10 bệnh nhân ĐTĐ type
2 được điều trị với miglitol và acarbose qua giám sát glucose liên tục (CGM) trong
4 ngày nhập viện. Bệnh nhân được uống 50 mg miglitol hoặc 100 mg acarbose
trước mỗi bữa ăn trong ngày thứ 2 và ngược lại vào ngày thứ 3, theo một thử
nghiệm ngẫu nhiên. Các bệnh nhân đã có ba bữa ăn thử nghiệm giống hệt nhau
vào ngày thứ 2 và thứ 3. Các số liệu CGM đã được so sánh cho từng thông số
biến đổi đường huyết sau mỗi bữa ăn. Điều trị miglitol hoặc acarbose không có
sự khác biệt nào đáng kể liên quan đến việc tăng nồng độ đường từ mức cơ bản
đến mức cao, thời điểm lượng đường tăng cao nhất là 3 giờ sau ăn .
.1.3.2. Nghiên cứu về các tác dụng khác của acarbose
Bên cạnh việc ứng dụng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2 acarbose còn được
thử nghiệm để sản xuất nhiều loại thuốc phòng và chữa bệnh khác như: bệnh
béo phì, tăng mỡ máu, viêm dạ dày, loét tá tràng, bệnh mục xương ở người hoặc
dùng trong chăn nuôi để tăng tỷ lệ thịt và mỡ trong động vật nuôi
Acarbose có tác dụng làm giảm nguy cơ tim mạch. Một số nghiên cứu dịch tễ
học đã chỉ ra rằng tăng đường huyết sau ăn có liên quan đến tăng nguy cơ mắc
bệnh tim mạch. Các nghiên cứu này đã so sánh hiệu quả điều trị bằng acarbose
và glimepiride đối với hàm lượng lipoprotein trong huyết thanh ở 37 bệnh nhân
ĐTĐ type 2 mới được chẩn đoán. Các bệnh nhân được chỉ định ngẫu nhiên để
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
8
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
điều trị trong 12 tuần chia thành 3 nhóm: với acarbose, glimepiride, đối chứng ăn
uống bình thường. Kết quả cho thấy việc điều trị bằng acarbose đã làm giảm
nguy cơ tim mạch .
Blanch và cs (2010) đã đánh giá khả năng ức chế của acarbose đến hoạt tính
của amylase và glucosidase trong hỗn hợp lên men ở dạ cỏ đến sự trao đổi
chất trong máu và đến hệ vi khuẩn trong dạ cỏ bò sữa Holstein (với chế độ ăn
0,75 g acarbose mỗi ngày). Kết quả cho thấy, việc bổ sung chế độ ăn uống chứa
acarbose trong nuôi bò sữa cao sản xuất khẩu có hiệu quả hơn như: giảm thời
gian mà pH dạ cỏ đạt tối ưu, không có tác động tiêu cực đến quá trình lên men ở
dạ cỏ và chuyển hóa máu .
.1.4. Vai trò Actinoplanes trong sinh tổng hợp acarbose
.1.4.1. Đại cương về Actinoplanes
Chi Actinoplanes được công bố đầu tiên bởi Couch năm 1950 với loài chuẩn là
Actinoplanes philippinensis . Chúng sống chủ yếu trong đất và trong nước, phát
triển dưới dạng sợi, phân nhánh, không đứt đoạn, gram dương, rất ít sợi khí sinh
hoặc không có, tạo nhiều loại sắc tố có khả năng khuếch tán. Bào tử chứa trong
túi bào tử, sinh trên cuống bào tử hoặc không có, rất ít khi trong thạch. Bào tử
hình cầu hoặc que ngắn, sắp xếp theo nhiều cách khác nhau bên trong túi bào tử,
bào tử có thể di động khi túi bào tử nứt ra . Thành tế bào có chứa meso2,6
diaminopimelic acid, LL2,6diaminopimelic acid, hydroxydiaminopimelic acid và
glycine . Thành phần đường có chứa Dxylose và Larabinose. Thành phần
phospholipid chính là phosphatidylethanolamin. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72
73% . Actinoplanes là những sinh vật hiếu khí, hóa dị dưỡng, ưa ẩm, ưa nhiệt
vừa phải, phát triển trong điều kiện 15 đến 37oC, thích hợp từ 2528oC. Chúng ăn
các sinh vật hoại sinh, hạt phấn và các vật liệu sinh học chứa chitin, sử dụng tốt
các thành phần trong tế bào thực vật như xylose và arabinose. Chúng sống thành
các tập đoàn và có hình dạng xác định, ở giữa phồng lên phát triển bào tử nang.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
9
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Tập đoàn có màu cam hoặc vàng tùy thuộc vào thành phần chất màu trong nguyên
sinh chất của tế bào .
Actinoplanes có vai trò quan trọng trong công nghiệp và dược phẩm như sản
xuất kháng sinh, amino acid, bổ sung vào thực phẩm và làm thuốc chữa bệnh... .
Tính đến tháng 10 năm 2011 có tới 11% các dự án về genome liên quan đến
Actinomycetes mà chủ yếu liên quan đến chi Actinoplanes. Đã phân lập được hơn
200 loài xạ khuẩn hiếm trong đó có hơn 45 loài có vai trò quan trọng, có hơn 120
loại kháng sinh đã được công bố sản xuất từ các loài này với thành phần là
peptide và depsipeptide, đặc biệt là glycopeptide teicoplanin được sản xuất bởi A.
teichomyceticus điều trị bệnh nhiễm trùng gây ra bởi các vi khuẩn gram dương
đặc biệt là Staphylococcus aureus . Sản xuất nhiều loại kháng sinh được quan
tâm khác như lipiarmicyn từ A. deccanensis , ramoplanin từ Actinoplanes sp.
ATCC 33076 .
.1.4.2. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 còn gọi là chủng Actinoplanes sp.
SE50/110 (ATCC 31043, CBS 67473) được phân lập năm 1969 trên vùng đất
trồng cà phê ở Kenya, châu Phi .
Vị trí phân loại theo khóa phân loại của Bergey, xạ khuẩn Actinoplanes sp.
KCTC 9161 thuộc :
Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria
Lớp: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Họ: Micromonosporaceae
Chi: Actinoplanes
Loài: Actinoplanes sp.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
10
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Đặc điểm hình thái: Actinoplanes sp. KCTC 9161 gram dương có cấu tạo
dạng sợi, các sợi liên kết chặt chẽ với nhau tạo thành các khuẩn lạc riêng rẽ,
màu vàng cam, ở giữa khuẩn lạc phồng lên phát triển các túi bào tử chứa nhiều
bào tử. Bào tử có thể di động. Toàn bộ hệ sợi của xạ khuẩn chỉ là một tế bào có
nhiều nhân, không có vách ngăn ngang, nhân đơn giản, không có màng nhân .
Thành tế bào có chứa meso2,6diaminopimelic acid, LL2,6diaminopimelic acid,
hydroxydiaminopimelic acid và glycine, tỷ lệ GC trong ADN là 71,32%.
Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử, phát triển mạnh trong điều kiện
2528oC, phát triển dưới dạng sợi, phân nhánh, ưa ẩm.
Đặc điểm nuôi cấy: Điều kiện phát triển nuôi cấy là môi trường hiếu khí,
nhiệt độ nuôi cấy tối ưu là 25oC, pH thích hợp trong nuôi cấy với pH 68. Trên
môi trường thạch đĩa, khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 có dạng
hình tròn, bề mặt nhẵn, có tâm phồng lên, phát triển chậm. Khuẩn lạc có màu
cam đường kính 12 mm. Sau 710 ngày bề mặt nhăn lan rộng (Hình 1.3). Trên
môi trường thạch nghiêng, chủng mọc dày tạo thành vệt, màu cam đậm, rìa gợn
sóng. Trên môi trường lỏng, chủng phát triển tốt, hình thành các hạt pellet hình
tròn, không tan khi lắc lên, màu vàng cam, một số sắc tố màu cam tiết ra môi
trường tạo môi trường có màu cam.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013
11
