Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sử dụng hợp lý đất phèn đồng bằng sông Cửu Long thích ứng với biến đổi khí hậu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP

LÝ NGỌC THANH XUÂN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH
VI KHUẨN LIÊN KẾT VỚI THỰC VẬT
(PLANT ASSOCIATED BACTERIA)
Ở LÚA, KHOAI TRỒNG TRÊN
ĐẤT PHÈN VÙNG ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT
Mã số: 9620103

2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP

LÝ NGỌC THANH XUÂN

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH
VI KHUẨN LIÊN KẾT VỚI THỰC VẬT
(PLANT ASSOCIATED BACTERIA)
Ở LÚA, KHOAI TRỒNG TRÊN
ĐẤT PHÈN VÙNG ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT
Mã số: 9620103

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. TRẦN VĂN DŨNG
GS.TS. NGÔ NGỌC HƯNG

2019


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn đến
Em Lâm Tiên Nga, em Nguyễn Như Thanh, em Trần Lê Kim Trí, em Lê
Thị Thúy Loan, em Nguyễn Thị Xuân Mỵ và anh Trần Văn Bé Năm đã nhiệt
tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Quí Thầy, Cô và các Anh, Chị, Em trong Bộ môn Khoa học đất - Khoa
Nông nghiệp đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm
thực tiễn hết sức quý báu và luôn quan tâm, hỗ trợ tôi trong việc hoàn thành
luận án.
Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông
nghiệp, Khoa Sau Đại học và các Phòng ban của Trường Đại học Cần Thơ đã
hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Trường.
Ban Giám hiệu Trường Đại học An Giang, Lãnh đạo Phòng Quản Trị Thiết bị, các bạn đồng nghiệp thuộc Khu Thí nghiệm - Thực hành đã hỗ trợ,
tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứ
sinh.
Đặc biệt xin gởi lời chân thành cảm ơn sâu sắc đến
GS. TS Ngô Ngọc Hưng, PGS.TS. Trần Văn Dũng, GS. TS Cao Ngọc
Điệp và PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, cung cấp
nhiều kiến thức quý báu trong suốt quá trình tôi học tập. Từ đó, giúp tôi lĩnh

hội thêm nhiều kiến thức mới trong lĩnh vực nghiên cứu, thực hiện và hoàn
thành luận án tốt nghiệp.
Em Nguyễn Quốc Khương, em Lương Thị Hoàng Dung, em Lê Văn
Dang, em Lê Phước Toàn, em Trần Ngọc Hữu và em Nguyễn Thị Xuân Đào
đã tận tình giúp đỡ, chia sẽ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thành luận án.
Cha mẹ hai bên và gia đình nhỏ của tôi luôn là nguồn động viên, là chỗ
dựa tinh thần, niềm an ủi, ủng hộ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện luận án.
Tôi bày tỏ sự biết ơn sâu sắc với tấm lòng tôn trọng và mãi luôn khắc ghi
những công ơn quý báo này.
Xin chân thành cảm ơn!
Lý Ngọc Thanh Xuân

i


TÓM TẮT
Đất phèn có pH thấp, đã dẫn đến hàm lượng dưỡng chất thấp. Đề tài
“Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật (plant
associated bacteria) ở lúa, khoai trồng trên đất phèn vùng đồng bằng sông Cửu
Long” được thực hiện nhằm mục tiêu (i) Phân lập và tuyển chọn các chủng vi
khuẩn cố định đạm, hòa tan lân hiện diện trong đất và nội sinh trong cây lúa,
khoai lang trên đất phèn (ii) Xác định ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố
định đạm, hòa tan lân đến sinh trưởng và năng suất lúa và khoai lang. Mẫu đất
phèn, khoai lang và lúa được thu thập tại bốn vùng đất phèn Tứ giác Long
Xuyên (TGLX), Đồng Tháp Mười (ĐTM), Trũng sông Hậu (TSH) và Bán đảo
cà Mau (BĐCM). Bốn trăm ba mươi mốt chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa,
trong đó có 272 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 159 chủng vi
khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được có

màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong, vàng nhạt và vàng đậm. Hình dạng
khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, hầu hết các chủng vi khuẩn có tế bào
dạng hình que, Gram âm. Bốn trăm hai mươi bốn chủng vi khuẩn liên kết với
cây khoai lang, trong đó có 271 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ
và 153 chủng vi khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn
phân lập được có màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong vàng nhạt và vàng
đậm. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, một số lượng nhỏ các
dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình cầu. Các chủng vi khuẩn có khả năng cố
định đạm và có khả năng hòa tan lân khó tan. Hai mươi chín chủng vi khuẩn
liên kết với cây lúa có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã
được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S
rDNA. Các chủng vi khuẩn này đa dạng về loài thuộc 3 nhóm vi khuẩn:
Bacilli, Gammaproteobacteria và Betaproteobacteria. Mười hai chủng vi
khuẩn liên kết với cây khoai lang mà có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan
lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải
trình tự đoạn 16S rDNA. Các dòng vi khuẩn này đa dạng về loài chỉ thuộc 2
nhóm vi khuẩn: Bacilli và Gammaproteobacteria. Kết quả thí nghiệm đồng
ruộng cho thấy nghiệm thức không bón đạm đã làm giảm năng suất lúa trên
đất phèn, Long Mỹ - Hậu Giang, Hòn Đất - Kiên Giang và Hồng Dân, Bạc
Liêu, nhưng nghiệm thức bón 60 kg N ha-1 kết hợp với vi khuẩn Burkholderia
vietnamiensis X1 đã đạt năng suất cao hơn so với đối chứng 90N-60P2O530K2O trên đất phèn Hòn Đất - Kiên Giang. Tương tự, nghiệm thức bổ sung vi
khuẩn B. vietnamiensis X3 đã làm tăng năng suất cao hơn so với đối chứng
90N-60P2O5-30K2O trên đất phèn Long Mỹ - Hậu Giang và Hồng Dân - Bạc
Liêu. Tuy nhiên, nghiệm thức không bón lân chưa thể hiện sự thiếu lân trên ba
vùng phèn trên nên chưa đưa đến sự khác biệt về năng suất của sử dụng vi
ii


khuẩn B. vietnamiensis X1 và B. vietnamiensis X3. Hoạt tính cố định đạm của
vi khuẩn B. acidipaludis X5 mạnh nhất so với 2 vi khuẩn còn lại thông qua

việc gia tăng số củ và năng suất củ khoai lang. Bón 60 kg N ha-1 kết hợp với
chủng vi khuẩn B. acidipaludis X5 cho số củ, chiều dài củ, đường kính củ và
năng suất củ khoai lang tương đương với bón 90 kg N ha-1. Sử dụng chủng vi
khuẩn B. acidipaludis X5 đã tiết kiệm được khoảng 30% lượng phân đạm bón
cho khoai lang. Cần áp dụng các dòng này trong cánh tác lúa và khoai lang ở
ĐBSCL.
Từ khóa: cố định đạm, đất phèn, hòa tan lân, vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn
nội sinh.

iii


ABSTRACT
Acid sulfate soils possess low pH resulting low nuutrients for plants. The
study titled “Isolation, selection, characterization and identification of
endophytic and rhizospheric bacteria associated with rice and sweet potato
from acid sulfate soil in the Mekong delta, Vietnam” was conducted for the
following objectives (i) isolation of endophytic and rhizospheric bacterial
strains associated with sweet potato and rice for abilities of nitrogen fixing,
phosphate-solubilizing; (ii) selection of promising nitrogen fixing, phosphatesolubilizing bacterial strains for improvement of sweet potato and rice growth
and yield. The sweet potato and rice plant, and soil samples were collected
from four acid sulfate soil areas including Ca Mau Peninsula, Long Xuyen
Quadrangle, Depressed area of Hau River and Plain of Reed in the Mekong
Delta, Vietnam. A total of 431 rice endophytic bacterial strains including 272
strains isolated from rhizobacterial strains and 159 endophytic bacterial strains
were obtained. Morphological properties of colonies had colorless, opaque,
yellow and very yellow. Besides, colony morphology was mainly circular
shapes and entire margin, rod shape and Gram-negative. A total of 424 rice
endophytic bacterial strains consisting of 271 strains isolated from
rhizobacterial strains and 153 endophytic bacterial strains were obtained.

Morphological characteristics of colonies also were transparency, milk-color,
yellow and very yellow. Moreover, colony morphology was mostly circular
shapes and entire margin, rod shape and Gram-positive, but several strains had
sphere shape. The 25 selected rice endophytic bacterial strains had promised
high abilities for nitrogen fixing, phosphate-solubilizing that were identified
by 16S rDNA sequence analysis. The phylogenetic analysis is belonged to
Bacilli, Gammaproteobacteria and Betaproteobacteria groups. Similarly, The 2
selected sweet potato, yam, and cassava endophytic bacterial strains had high
promised capacities for nitrogen fixing, phosphate-solubilizing, which were
identified by 16S rDNA sequence analysis. The phylogenetic analysis is
closely classified to Bacilli and Gammaproteobacteria groups. The without
nitrogen fertilizer application decreased rice yield on acid sulfate soil in Long
My - Hau Giang, Hon Dat - Kien Giang and Hong Dan - Bac Lieu, but the
application of both 60 kg N ha-1 and Burkholderia vietnamiensis X1 resulted
in higher rice yield compared to control treatment (90N-60P2O5-30K2O) on
acid sulfate soil in Hon Dat - Kien Giang. Similarly, the applied B.
vietnamiensis X3 increased productivity in Long My - Hau Giang, and Hong
Dan - Bac Lieu. However, without phosphorus fertilizer application have not
been improved yield by application of B. vietnamiensis X1 và B. vietnamiensis
iv


X3 because there were not significant differences between phosphorus and
without phosphorus fertilization. The bacteria Burkholderia acidipaludis X5
have high nitrogen fixation capability compared to those in the 2 other bacteria
through increased number of tubers and yield of sweet potato. Applying kg N
ha-1 in combination with incubation of bacteria Burkholderia acidipaludis X5
showed that the tuber number, tuber length, tuber diameter and sweet potato
yield were equivalent with applying kg N ha-1. Incubation with bacteria
Burkholderia acidipaludis X5 could save 30% of nitrogen fertilizers for sweet

potato. The potential bacterial strains should be used in cultivating rice and
sweet potato in the Mekong delta.
Key words: acid sulfate soil, endophytic bacteria, nitrogen fixing, phosphatesolubilizing, rhizobacterial.

v


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được người khác công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Số liệu trong đề tài nghiên cứu sinh này
thuộc đề tài “Nghiên cứu sử dụng hợp lý đất phèn đồng bằng sông Cửu Long
thích ứng với biến đổi khí hậu”, với mã số BĐKH57.

Cần Thơ, ngày 04 tháng 3 năm 2019
Người hướng dẫn

Nghiên cứu sinh

Lý Ngọc Thanh Xuân

vi


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i
TÓM TẮT .......................................................................................................... ii
ABSTRACT...................................................................................................... iv
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. vi
MỤC LỤC ....................................................................................................... vii

DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................ x
DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................... xiii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... xiv
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu ....................................................................................................... 3
1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 3
1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................ 4
1.5 Những đóng góp mới của luận án ................................................................ 4
1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án ..................................... 5
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 6
2.1 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết với thực vật trong nông
nghiệp ......................................................................................................... 6
2.1.1 Khái niệm .................................................................................................. 6
2.1.2 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết thực vật ............................ 6
2.1.3 Những tiến bộ trong nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật liên kết với thực
vật ............................................................................................................. 12
2.2 Đặc điểm thổ nhưỡng các vùng sinh thái đất............................................. 16
2.2.1 Phân loại đất phèn ................................................................................... 16
2.2.2 Đặc điểm thổ nhưỡng và các trở ngại trên đất phèn ĐBSCL ................. 20
2.2.3 Đặc tính hóa học của đất phèn ĐBSCL .................................................. 27
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................. 36
3.1 Vật liệu ....................................................................................................... 36
3.1.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................. 36
3.1.2 Vật liệu .................................................................................................... 36
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu .................................................................. 37
vii


3.1.4 Môi trường sử dụng ................................................................................ 37

3.1.5 Đặc tính đất thí nghiệm........................................................................... 38
3.2 Phương pháp .............................................................................................. 38
3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát và thu thập mẫu đất, thực vật trên đất phèn ở các
vùng sinh thái tại đồng bằng sông Cửu Long ........................................... 40
3.2.2 Nội dung 2: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn liên kết với thực vật có khả
năng cố định đạm, hòa tan lân .................................................................. 41
3.2.3 Nội dung 3: Tuyển chọn vi khuẩn trước khi tiến hành nhận diện .......... 46
3.2.4 Nội dung 4: Nhận diện, định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn ....... 47
3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
trên cây lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. 49
3.2.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
trên khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài
đồng. ......................................................................................................... 54
3.3 Xử lý số liệu ............................................................................................... 58
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 59
4.1 Phân lập vi khuẩn trên lúa và khoai lang ................................................... 59
4.1.1 Phân lập vi khuẩn vùng rễ cây lúa và nội sinh cây lúa ........................... 59
4.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn vùng rễ và nội sinh cây lúa ................ 59
4.1.3 Phân lập vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang ........................... 60
4.1.4 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang .... 60
4.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn tiềm năng có khả năng cố định đạm và hòa
tan lân ....................................................................................................... 61
+

4.2.1 Khảo sát khả năng tổng hợp NH4 và hòa tan lân của chủng vi khuẩn đã
phân lập trên vùng rễ lúa và nội sinh trong cây lúa.................................. 61
4.2.2 Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ và hòa tan lân của chủng vi khuẩn đã
phân lập trên vùng rễ lúa và nội sinh trong khoai lang ............................ 67
4.3 Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của một số chủng vi
khuẩn trên lúa, khoai lang có khả năng tổng hợp NH4+, hòa tan lân cao 71

4.3.1 Đối với vi khuẩn đất vùng rễ lúa ............................................................ 71
4.3.2 Đối với vi khuẩn nội sinh cây lúa........................................................... 74
4.3.3 Đối với vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang ............................ 76
4.3.4 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn cho áp dụng trong điều kiện đồng ruộng
.................................................................................................................. 80

viii


4.4 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng B. vietnamiensis X1, X2, X3
cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến sinh trưởng và năng suất lúa trồng
trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới ..................................................... 85
4.4.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn kết hợp với mức bón
đạm lên thành phần năng suất và năng suất lúa ....................................... 85
4.4.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn kết hợp với mức bón
lân lên thành phần năng suất và năng suất lúa ......................................... 87
4.5 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng E. cloacae X4, B.
acidipaludis X5, Bacillus sp. X6 cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến
sinh trưởng và năng suất khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện
nhà lưới ..................................................................................................... 89
4.6 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng B. vietnamiensis X1, X2, X3
cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến sinh trưởng và năng suất lúa trồng
trên đất phèn trong điều kiện ngoài đồng ................................................. 91
4.6.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X2, X3 kết hợp
các mức đạm lên năng suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu
Long vụ hè thu 2015 ................................................................................. 91
4.6.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X2, X3 kết hợp
các mức lân lên năng suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu
Long vụ hè thu 2015 ................................................................................. 93
4.6.3 Đánh giá hiệu quả của chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X3 lên năng

suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long vụ thu đông
2015 .......................................................................................................... 95
4.7 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng E. cloacae X4, B.
acidipaludis X5, Bacillus sp. X6 cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến
sinh trưởng và năng suất khoai trồng trên đất phèn ở điều kiện ngoài đồng
.................................................................................................................. 97
4.7.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn E. cloacae X4, B. acidipaludis X5,
Bacillus sp. X6 kết hợp với các liều lượng đạm đến năng suất khoai lang
tím nhật vào vụ xuân hè 2016 trên đất phèn ở ĐBSCL ........................... 97
4.7.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn E. cloacae X4, B. acidipaludis X5,
Bacillus sp. X6 kết hợp với các liều lượng lân đến năng suất khoai lang
tím nhật vào vụ hè thu 2016 trên đất phèn ở ĐBSCL .............................. 99
4.7.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn triển vọng đến năng suất khoai lang tím nhật vụ
hè thu 2016 ............................................................................................. 101
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................ 103
5.1 Kết luận .................................................................................................... 103
5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 104

ix


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Phân loại đất phèn theo hệ thống phân loại (USDA/Soil Taxonomy).
.................................................................................................................. 17
Bảng 2.2: Thống kê tính chất hóa học tầng A của đất phèn ở 04 vùng sinh thái
ĐBSCL (Ngô Ngọc Hưng, 2009) ............................................................. 27
Đặc tính hóa – lý đất thí nghiệm trồng lúa được trình bày ở Bảng 3.1 ........... 38
Bảng 3.1: Tính chất ban đầu của đất thí nghiệm trồng lúa .............................. 38
Đặc tính hóa – lý đất thí nghiệm trồng khoai lang được trình bày ở Bảng 3.2 38
Bảng 3.2: Tính chất ban đầu của đất thí nghiệm trồng khoai lang .................. 38

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng
suất lúa thí nghiệm nhà lưới ..................................................................... 50
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng lân lên năng suất
lúa thí nghiệm nhà lưới............................................................................. 50
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng
suất lúa. ..................................................................................................... 52
Bảng 3.6: Đánh giá sự phối hợp vi khuẩn triển vọng với 3 lượng N lên năng
suất lúa ...................................................................................................... 52
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng lân lên năng suất
lúa. ............................................................................................................ 53
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng
suất khoai lang thí nghiệm nhà lưới ......................................................... 54
Bảng 3.9: Thời kỳ và lượng phân (%) bón cho thí nghiệm ............................. 55
Bảng 3.10: Mùa vụ và nội dung thí nghiệm .................................................... 56
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng
suất khoai lang .......................................................................................... 56
Bảng 3.12: Đánh giá sự phối hợp vi khuẩn triển vọng với 3 lượng N lên năng
suất khoai lang .......................................................................................... 57
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng lân lên năng
suất khoai lang. ......................................................................................... 57
Bảng 3.14: Thời kỳ và lượng phân (%) bón cho thí nghiệm ........................... 58
Bảng 4.1: Số lượng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa và nội sinh trên
các môi trường khác nhau ........................................................................ 59
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn nội sinh cây
lúa ............................................................................................................. 60
Bảng 4.3: Số lượng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ trồng khoai lang và
nội sinh trên các môi trường khác nhau ................................................... 60

x

Bảng 4.4: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn vùng rễ và nội
sinh trên khoai lang .................................................................................. 61
Bảng 4.5: Khả năng của các chủng vi khuẩn vùng rễ cố định đạm (2-8 NSU)
và hòa tan lân (5-20 NSU) được phân lập trên đất phèn trồng lúa .......... 63
Bảng 4.6: Khả năng của các chủng vi khuẩn nội sinh cố định đạm (2-8 NSU)
và hòa tan lân (5-20NSU) được phân lập trên đất phèn trồng lúa............ 66
Bảng 4.7: Khả năng của các chủng vi khuẩn vùng rễ cố định đạm (2-8 NSU)
và hòa tan lân (5-20NSU) được phân lập trên đất phèn trồng khoai lang 68
Bảng 4.8: Khả năng của các chủng vi khuẩn nội sinh cố định đạm (2-8 NSU)
và hòa tan lân (5-20NSU) được phân lập trên đất phèn trồng khoai lang 70
Bảng 4.9: Mối tương quan di truyền giứa một số chủng vi khuẩn được phân
lập với các chủng vi khuẩn có trong ngân hang gen (NCBI) dựa vào trình
tự 16S rDNA............................................................................................. 72
Bảng 4.10: Mối tương quan di truyền giứa một số chủng vi khuẩn được phân
lập với các chủng vi khuẩn có trong ngân hang gen (NCBI) dựa vào trình
tự 16S rDNA............................................................................................. 74
Bảng 4.11: Mối tương quan di truyền giứa một số chủng vi khuẩn được phân
lập với các chủng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình
tự 16S rDNA............................................................................................. 77
Bảng 4.12: Khả năng cố định đạm, hòa tan lân sắt và lân nhôm của các chủng
vi khuẩn tiềm năng từ đất trồng lúa. ......................................................... 81
Bảng 4.13: Khả năng cố định đạm, hòa tan lân sắt và lân nhôm của các chủng
vi khuẩn tiềm năng từ đất trồng khoai ...................................................... 83
Bảng 4.14: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X2, X3
cố định đạm và hòa tan lân kết hợp với mức bón đạm lên thành phần năng
suất và năng suất lúa trong điều kiện nhà lưới ......................................... 86
Bảng 4.15: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp với mức bón lân lên
thành phần năng suất và năng suất lúa trong điều kiện nhà lưới ............. 88
Bảng 4.16: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp với mức bón đạm lên

sinh trưởng, thành phần năng suất và năng suất khoai lang trong nhà lưới
.................................................................................................................. 89
Bảng 4.17: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn kết hợp các mức đạm lên năng suất
và thành phần năng suất của lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông
Cửu Long vụ hè thu 2015 ......................................................................... 92
Bảng 4.18: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn phối hợp các lượng phân lân lên
năng suất và thành phần năng suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng
sông Cửu Long vụ thu đông 2015 ............................................................ 94
Bảng 4.19: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn triển vọng B. vietnamiensis X1 và
B. vietnamiensis X3 lên thành phần năng suất và năng suất lúa trồng trên
đất phèn ở Đồng bằng sông Cửu Long vụ thu đông 2015. ...................... 96
xi


Bảng 4.20: Số củ, chiều dài, đường kính và năng suất củ khoai lang tím nhật
vụ xuân hè 2016 ....................................................................................... 98
Bảng 4.21: Số củ, chiều dài, đường kính và năng suất củ khoai lang tím nhật
vào vụ hè thu 2016 ................................................................................. 100
Bảng 4.22: Số củ, chiều dài, đường kính và năng suất khoai lang tím nhật vào
vụ hè thu 2016 ........................................................................................ 102

xii


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học (Kneip et al., 2007) ... 8
Hình 2.2: So sánh tính chất: (a) pH; (b) Al3+ trao đổi; (c) Fe2+ hoạt động và (d)
SO4 hòa tan của 4 vùng đất phèn ở ĐBSCL (Ngô Ngọc Hưng, 2009) .... 31
Hình 2.3: Tương quan giữa: (a) pH và Al trao đổi và, (b) pH và SO4 hòa tan
của đất phèn ĐBSCL (Ngô Ngọc Hưng, 2009) ....................................... 31

Hình 2.4: Tương quan giữa: (a) pH và C hữu cơ, và (b) C hữu cơ và hàm
lượng N trong đất phèn ở ĐBSCL (Ngô Ngọc Hưng, 2009). .................. 32
Hình 2.5: Hàm lượng các cation trao đổi (K+, Ca2+, Mg2+ và Na+) của đất phèn
ở bốn vùng sinh thái (Ngô Ngọc Hưng, 2009) ......................................... 33
Hình 3.1: Bản đồ khảo sát và lấy mẫu trên các vùng sinh thái đất phèn. Nguồn:
Vo Tong Xuan và Matsui (1998). ............................................................ 36
Hình 3.2: Sơ đồ tiếp cận phương pháp nghiên cứu ......................................... 40
Hình 4.1: Sơ đồ cây phả hệ cho thấy mối quan hệ di truyền về trình tự gen 16S
rDNA của 15 chủng vi khuẩn đất vùng rễ trồng cây lúa đã được tuyển
chọn. Phân tích Neighbor-Joining với bootrap 100. Thang 0.5 chỉ khoảng
5 thay đổi trong 100 nucleotic của trình tự gen 16S rDNA. .................... 73
Hình 4.2: Sơ đồ cây phả hệ cho thấy mối quan hệ di truyền về trình tự gen 16S
rDNA của 15 chủng vi khuẩn nội sinh trong cây khoai đã được tuyển
chọn. Phân tích Neighbor-Joining với bootrap 100. Thang 0.5 chỉ khoảng
5 thay đổi trong 100 nucleotic của trình tự gen 16S rDNA. .................... 75
Hình 4.3: Sơ đồ cây phả hệ cho thấy mối quan hệ di truyền về trình tự gen 16S
rDNA của 12 chủng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây khoai lang đã
được tuyển chọn. Phân tích Neighbor-Joining với bootrap 100. Thang 0.5
chỉ khoảng 5 thay đổi trong 100 nucleotic của trình tự gen 16S rDNA... 78

xiii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BĐCM: Bán đảo Cà Mau.
ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long.
ĐTM: Đồng Tháp Mười.
NSU: Ngày sau ủ.
PAB: Vi khuẩn liên kết với thực vật.
TGLX: Tứ giác Long Xuyên.

TSH: Trũng sông Hậu.
VK1: Burkholderia vietnamiensis X1.
VK2: Burkholderia vietnamiensis X2.
VK3: Burkholderia vietnamiensis X3.
VK4: Enterobacter cloacae X4.
VK5: Burkholderia acidipaludis X5.
VK6: Bacillus sp. X6.
VSV: Vi sinh vật.

xiv


CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Với sự đa đạng của cộng đồng vi sinh vật có ích trong đất, nhưng việc
khai thác và ứng dụng các nguồn vi sinh vật có ích vào sản xuất còn nhiều hạn
chế. Ngày nay, các nhà khoa học trên thế giới cũng như nước ta đã và đang
tăng cường nghiên cứu để ứng dụng nhiều hơn vai trò của vi sinh vật trong
nông nghiệp. Nhiều chế phẩm sinh học đã đáp ứng được nhu cầu của xã hội
trước nguy cơ ô nhiễm môi trường, biến đổi khí hậu, an toàn thực phẩm.
Vi sinh vật có cấu tạo đơn giản nhưng lại có khả năng phân chia, sinh sản
rất nhanh với hệ enzyme phong phú có khả năng phân hủy hầu như mọi dạng
vật chất trong tự nhiên. Việc tìm ra những loài vi sinh vật có ích sống trong
đất vùng rễ và nội sinh trong cây mang ý nghĩa thiết thực cho nền nông nghiệp
hiện đại. Vì vậy, việc sử dụng những loài vi sinh vật này giúp nâng cao năng
suất cây trồng một cách an toàn, bền vững và thân thiện với môi trường.
Hàm lượng đạm trong không khí tồn tại dưới hình thức N2 có thể xem
như nguồn đạm vô tận cho cây xanh đưa vào chuỗi thức ăn. Ước tính hằng
năm có khoảng 160 – 176 triệu tấn N2 khí quyển được cố định và chuyển hóa
thành các dạng đạm khác nhau nhờ vi khuẩn cố định đạm (Hardy và Holsten,

1972; Gibson, 1995). Lượng đạm này gấp đôi so với lượng phân đạm sản xuất
mỗi năm của toàn thế giới mà lại không tốn chi phí và không gây ô nhiễm môi
trường. Nhiều vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh đã được công bố là có
khả năng cố định đạm.
Sự tồn lại lân khó tiêu trong đất đa phần là do hoạt động sản xuất nông
nghiệp của con người. Hằng năm khoảng 180.000 tấn P2O5 được bón vào đất
nông nghiệp ở đồng bằng sông Cửu Long nhưng cây trồng chỉ sử dụng khoảng
1/3 (Cao Ngọc Điệp và Bùi Thị Kiều Oanh, 2006). Vì tế bào có thể hút được
nhiều loại lân nhưng hấp thụ cao nhất là ở dạng HPO42- hoặc H2PO4-. Tuy
nhiên, dạng hòa tan trong đất này thường rất thấp, ở mức 1 ppm hoặc ít hơn
(Goldstein, 1994). Dạng phổ biến của lân là không tan, thường gặp trong đá
dưới dạng apatite, hydroxyapatite, oxyapatite hay các dạng kết hợp với sắt,
nhôm, mangan. Ngoài ra, đất nông nghiệp còn có thể chứa một lượng lớn lân
nguồn gốc từ việc bón phân lân vô cơ thường xuyên mà cây trồng không hấp
thu hết, sau đó bị cố kết trong đất dưới dạng khó tan. Nhiều loài vi khuẩn cũng
đã được mô tả về khả năng chuyển hóa lân khó tan thành dạng mà cây xanh có
thể hấp thu được. Nhiều nghiên cứu cũng đã cho thấy nhiều loài vi sinh vật đất
vùng rễ và vi khuẩn nội sinh vừa có khả năng cố định đạm, vừa hòa tan được
lân khó tan, thậm chí là phân giải các hợp chất hữu cơ, các hợp chất chứa kali
1


như kaolinite, illite, montmorilonite, v.v... (Lin Qi-mei et al., 2002; Zhao et
al., 2008). Các loài vi sinh vật này có thể bổ sung nguồn dinh dưỡng cơ bản
cho cây mà lại hết sức thân thiện với môi trường.
Muốn có chế phẩm phân bón vi sinh tốt, cần phải chọn lọc được các
chủng vi sinh vật có sức cạnh tranh lớn, thích ứng rộng, có khả năng cung cấp
các dưỡng chất thiết yếu cho cây trồng; đồng thời sinh tổng hợp được các chất
tăng trưởng thực vật. Bên cạnh đó, vi sinh vật được phân lập từ cây trồng và
vùng đất bản địa sẽ đạt được trạng thái sinh trưởng tốt nhất, thân thiện với môi

trường và có hiệu quả cao nhất khi được chủng trở lại loại cây trồng và vùng
đất đó.
Đất phèn có môi trường axit cao trong đó nhôm phóng thích và các kim
loại nặng hòa tan, các cộng đồng vi khuẩn trong loại đất này có một cấu trúc
hoàn toàn khác với những vi khuẩn trong các môi trường khác. Tuy nhiên, các
hệ sinh thái vi khuẩn trong đất phèn rất ít được biết đến về mặt chức năng
hoặc cấu trúc cộng đồng. Phân lập vi sinh vật và nghiên cứu chức năng của vi
khuẩn và các động thái của cộng đồng vi khuẩn trong đất phèn sẽ thể hiện một
bước quan trọng trong việc đạt được một sự hiểu biết về sự hình thành và cải
tạo đất phèn.
Bên cạnh những trở ngại trong canh tác do khí hậu bất thường, sự gia
tăng phát thải độc chất từ đất phèn có thể đưa đến sự thay đổi hệ sinh thái đất
và giảm đa dạng sinh học trong đất. Nghiên cứu về đất phèn ở Việt Nam và
trên thế giới đều cho rằng đất phèn có hàm lượng chất hữu cơ cao và hàm
lượng đạm tổng số cao, vi sinh vật (VSV) đất có vai trò rất quan trọng trong sự
chuyển hóa các dưỡng chất này thành hữu dụng cho cây trồng. Phát triển các
mô hình canh tác thích hợp kết hợp ứng dụng công nghệ sinh học trong sử
dụng VSV bản địa có lợi sẽ khai thác được tiềm năng sử dụng đất phèn và do
đó góp phần ổn định sản xuất và đời sống kinh tế cho người nông dân trên
vùng đất phèn Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Các bất lợi môi trường
về độc chất gia tăng bất thường của phèn và mặn do biến đổi khí hậu có thể
tiêu diệt và VSV có lợi đang hiện hữu trong đất phèn ĐBSCL. Việc phân lập,
nhận diện và lưu giữ sẽ giúp bảo tồn nguồn tài nguyên sinh vật, đồng thời các
nghiên cứu ứng dụng sẽ giúp nâng cao độ phì nhiêu đất và sản xuất cây trồng
một cách có hiệu quả hơn. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Phân
lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật (plant
associated bacteria) ở lúa, khoai trồng trên đất phèn vùng đồng bằng sông
Cửu Long” được thực hiện.

2

1.2 Mục tiêu
Phân lập các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân hiện diện trong đất
và nội sinh trong cây lúa, khoai lang trên đất phèn.
Xác định và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân có
ảnh hưởng đến sinh trưởng, năng suất của lúa và khoai lang trồng trên đất
phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.
Đề xuất 2-3 chủng vi khuẩn triển vọng phục vụ cho ổn định năng suất
của lúa và khoai lang trồng trên đất phèn.
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Thu thập mẫu đất, mẫu cây của lúa và khoai lang trồng trên đất
phèn ở các vùng sinh thái tại đồng bằng sông Cửu Long.
- Nội dung 2: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn liên kết với thực vật có khả
năng cố định đạm, hòa tan lân.
Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và một số đặc điểm tế bào của các chủng vi
khuẩn được phân lập.
Xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của các chủng vi
khuẩn được phân lập.
- Nội dung 3: Nhận diện, định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Nhận diện một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp
sinh học phân tử.
- Nội dung 4: Tuyển chọn vi khuẩn trước khi tiến hành đánh giá hiệu quả vi
khuẩn.
Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn ở pH = 4.
Xác định khả năng hòa tan lân (Fe-PO4, Al-PO4) của vi khuẩn ở pH = 4.
- Nội dung 5: Xác định hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên
cây lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.
Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số nghiệm thức chủng vi
khuẩn lên năng suất lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới.

Chọn các nghiệm thức để thử nghiệm ngoài đồng.
- Nội dung 6: Xác định hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên
cây khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.
Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số nghiệm thức chủng vi
khuẩn lên năng suất khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới.
3


Chọn các nghiệm thức để thử nghiệm ngoài đồng.
1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa, khoai
lang.
* Phạm vi nghiên cứu: 4 vùng đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long.
1.5 Những đóng góp mới của luận án
Phân lập được 431 dòng vi khuẩn liên kết với cây lúa, trong đó có 272
chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 159 chủng vi khuẩn nội sinh.
Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có màu sắc khác
nhau: trắng đục, trắng trong vàng nhạt và vàng đậm. Hình dạng khuẩn lạc chủ
yếu là tròn, bìa nguyên, hầu hết các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình que,
Gram âm.
Phân lập được 424 chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai, trong đó có
271 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 153 dòng vi khuẩn nội
sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được có màu sắc
khác nhau: trắng đục, trắng trong vàng nhạt và vàng đậm. Hình dạng khuẩn lạc
chủ yếu là tròn, bìa nguyên, một số lượng nhỏ các chủng vi khuẩn có tế bào
dạng hình cầu, Gram dương.
Các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và có khả năng hòa tan lân
khó tan.
Hai mươi chín chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa mà có khả năng tổng
hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ

thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA. Các chủng vi khuẩn này đa dạng
về loài thuộc 3 nhóm vi khuẩn: Bacilli, Gammaproteobacteria và
Betaproteobacteria.
Mười hai chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai lang có khả năng tổng
hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ
thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA. Các chủng vi khuẩn này đa dạng
về loài thuộc 2 nhóm vi khuẩn: Bacilli và Gammaproteobacteria.
Không bón đạm đã làm giảm năng suất lúa trên đất phèn, Long Mỹ - Hậu
Giang, Hòn Đất - Kiên Giang và Hồng Dân, Bạc Liêu, nhưng bón 60 kg N ha-1
kết hợp với vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis X1 đã đạt năng suất cao hơn
so với đối chứng 90N-60P2O5-30K2O trên đất phèn Hòn Đất-Kiên Giang.
Tương tự, vi khuẩn B. vietnamiensis X3 đã đạt năng suất cao hơn so với đối
chứng 90N-60P2O5-30K2O trên đất phèn Long Mỹ - Hậu Giang, và Hồng Dân,
4


Bạc Liêu. Tuy nhiên, không bón lân chưa thể hiện sự thiếu lân trên ba vùng
phèn trên nên chưa đưa đến sự khác biệt về năng suất của sử dụng vi khuẩn B.
vietnamiensis X1 và B. vietnamiensis X3.
Khả năng cố định đạm của vi khuẩn Burkholderia acidipaludis X5 mạnh
nhất so với 2 vi khuẩn còn lại thông qua việc gia tăng số củ và năng suất củ
khoai lang. Bón 60 kg N ha-1 kết hợp với chủng vi khuẩn B. acidipaludis X5
cho số củ, chiều dài củ, đường kính củ và năng suất củ khoai lang tương
đương với bón 90 kg N ha-1. Sử dụng chủng vi khuẩn B. acidipaludis X5 đã
tiết kiệm được khoảng 30% lượng phân đạm bón cho khoai lang.
1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án
* Ý nghĩa khoa học
- Việc phân lập các dòng vi khuẩn tiềm năng không chỉ góp phần bảo
tồn nguồn gene của các cộng đồng vi khuẩn có lợi trong đất phèn, mà còn xác
định sự da đạng về loài thông qua phương pháp sinh học phân tử như 16S

rDNA.
- Kết quả cũng góp phần minh chứng giữa lý thuyết về sự tương tác giữa
vi sinh vật đất đến động thái dinh dưỡng đất - cây trồng thông qua năng suất
lúa và khoai lang sau khi thực hiện thí nghiệm.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể là tài liệu tham khảo và là cơ sở
khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo, cũng như bổ sung giáo trình giảng dạy.
* Ý nghĩa thực tiễn
- Cung cấp nguồn vi khuẩn tốt có khả năng cố định đạm và các chủng
vi khuẩn có khả năng hòa tan phân lân khó tan thành lân dễ tan cung cấp
cho cây lúa, khoai l a n g để ứng dụng cho việc nghiên cứu và sản xuất trên
đất phèn đồng bằng sông Cửu Long.
- Việc áp dụng các dòng vi khuẩn góp phần giảm lượng đạm để đạt
được mục tiêu canh tác bền vững trong điều kiện biến đổi khí hậu.

5


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết với thực vật trong nông
nghiệp
2.1.1 Khái niệm
2.1.1.1 Vi khuẩn liên kết với thực vật
Vi khuẩn là nhóm phong phú nhất trong vùng rễ. Do đó, ảnh hưởng lớn
đến sinh lý học thực vật và có khả năng cạnh tranh cao trong tiến trình dòng
hóa rễ (Saharan and Nehra, 2011). Sau khi tập trung ở vùng rễ (rhizophere), vi
khuẩn di chuyển đến bề mặt rễ (rhizoplane) và tại đó, thể hiện các lợi ích đối
với cây chủ. Một số chủng, loài còn có khả năng xâm nhập vào rễ
(endorhizophere), thậm chí là vào các bộ phận khác của cây (Compant et al.,
2010). Như vậy, ở khía cạnh nguồn gốc, các vi khuẩn nội sinh xâm nhập thực
vật từ vùng rễ có thể xem như các vi khuẩn vùng rễ (rhizobacteria). Ngoài ra,

người ta cũng đã phát hiện những cửa ngõ xâm nhập khác của vi khuẩn nội
sinh thực vật. Jha et al., (2013) xếp vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh vào
chung nhóm vi khuẩn liên hiệp với thực vật - PAB. Chiến lược xâm lược cây
chủ của PAB bao gồm các bước: nhận diện, bám dính, xâm nhập (chỉ vi sinh
vật nội sinh và vi sinh vật gây bệnh) và phát triển, cùng một số cách thức để
thiết lập sự tương tác (Hartmann et al., 2009).
2.1.1.2 Vùng rễ và vi sinh vật vùng rễ kích thích sự tăng trưởng của
thực vật
Vùng rễ hay hệ rễ (rhizosphere) được biết đến như là một lớp đất mỏng
bao quanh rễ cây; đó là một khu vực cực kỳ quan trọng và tích cực cho hoạt
động của rễ và sự trao đổi chất (Cao Ngọc Điệp, 2016).
2.1.1.3 Vi khuẩn nội sinh thực vật
Vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria) là vi khuẩn sống trong
mô thực vật, trải qua vòng đời phần lớn ở trong cây, vi khuẩn từ vùng rễ xâm
nhập vào rễ, thân và lá, sống bên trong các mô thực vật chủ và giữa các dòng
hình thành các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hổ, cộng sinh dinh
dưỡng và hội sinh và vi khuẩn thuộc nhóm này thúc đẩy sự phát triển của cây
chủ (Schulz và Boyle, 2005).
2.1.2 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết thực vật
2.1.2.1 Cố định đạm
Đạm giữ vai trò quan trọng đối với sinh vật. Đạm là nguyên tố tham gia
cấu tạo của protein, acid nucleic và các thành phần cấu tạo của tế bào. Nguồn
6


dự trữ đạm trong tự nhiên là rất lớn. Chỉ tính riêng trong không khí, N2 chiếm
khoảng 78,16% thể tích. Người ta ước tính trong bầu không khí bao trùm lên
một ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn khí nitơ, lượng nitơ này có thể cung cấp
dinh dưỡng cho cây trồng trong 80 triệu năm. Tuy nhiên, trong thực tế cây
trồng không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn nitơ này bởi vì giữa hai

nguyên tử nitơ có liên kết ba tạo nên tính trơ của phân tử. Nguồn đạm mà cây
trồng sử dụng được phải ở dạng NH4+ hoặc NO3-. Các vi sinh vật cố định đạm
có khả năng hút đạm (N2) trong không khí và biến đạm từ dạng cây trồng
không hấp thụ được thành dạng đạm mà cây trồng hấp thụ được nhờ sự xúc
tác của enzyme nitrogenase (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2007).
Theo Kneip et al., (2007), trong suốt quá trình cố định đạm sinh học N2
giảm trong hệ thống vận chuyển điện tử kết quả tạo NH3 và phóng thích H2.
NH3 sau đó được sử dụng để tổng hợp các chất khác (Hình 2.1). Quá trình
chuyển N2 thành NH3 được xúc tác bởi phức hệ enzyme nitrogenase với sự
tham gia của năng lượng ATP. Enzyme dinitrogenase reductase và
dinitrogenase có các tiểu đơn vị nif (γ2 homodimeric azoferredoxin) và
NifD/K (α2ß2 heterotetrameric molybdoferredoxin). Điện tử chuyển
ferredoxin (hoặc flavodoxin) đến dinitrogenase reductase và chuyển đến
dinitrogenase, cung cấp điện tử dưới dạng H2 đến các N2 tạo thành NH3.
Mỗi mol N2 được cố định cần có 16 ATP và có sự tham gia của protein nifH.
Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase tổng hợp N2
thành NH3 theo sơ đồ sau:
Nitrogenase
N2 + 6H+ + 6e-

2NH3

Ammonia được tạo ra trong chu trình tiếp tục kết hợp với chuỗi carbon để
đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng.

7


Hình 2.1: Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học (Kneip et al., 2007)
Nitrogenase là một phức hệ enzyme, enzyme này được điều khiển bởi

hệ thống gen nif có trong bộ genome của tế bào vi khuẩn. Enzyme
nitrogenase không chỉ xúc tác cho quá trình tổng hợp N2 thành NH3, mà còn
có thể xúc tác khử các chất CH3CN, HCN, NH3, N2O, C2H2, ... thành các
sản phẩm tương ứng như C3H6, CH4, H2, N2, C2H4.
Có thể chia vi khuẩn cố định đạm thành 2 nhóm chính: các vi khuẩn
cộng sinh bắt buộc ở cây họ Đậu (như các rhizobium) và cây không thuộc họ
Đậu (như Frankia); các vi khuẩn không cộng sinh (sống tự do, liên hiệp với
cây hoặc nội sinh), gồm có vi khuẩn lam, Azospirillum, Azotobacter,
Acetobacter diazotrophicus, Azoarcus, Pseudomonas, Burkholderia, Klebsiella,
Enterobacter, Bacillus … (Saharan and Nehra, 2011).
Cố định đạm bởi vi khuẩn cộng sinh
Hai nhóm vi khuẩn cố định đạm đã được nghiên cứu rộng rãi gồm các
rhizobium và Frankia. Frankia tạo nốt rễ trên hơn 280 loài cây thân gỗ thuộc
8 họ khác nhau. Tuy nhiên, người ta chưa hiểu rõ hết các mối quan hệ cộng
sinh này. Frankia cộng sinh có hiệu quả với các loài Alnus và Casuarina. Một
sự gia tăng mật số các vi khuẩn vùng rễ sau khi luân canh với cây không thuộc
họ Đậu dẫn đến các lợi ích phong phú ở các vụ tiếp theo đã được báo cáo. Các
Frankia có thể cải thiện dinh dưỡng cây trồng bằng cách sinh ra các

8


phytohormone, siderophore và hydrogen cyanide cho cây hoặc có thể làm tăng
phosphate hữu dụng trong đất (Saharan and Nehra, 2011).
Các rhizobium gồm 36 loài và phân bố trong bảy chi: Allorhizobium,
Azorhizobium,
Bradyrhizobium,
Mesorhizobium,
Methylobacterium,
Rhizobium và Sinorhizobium (Sahgal and Johri, 2003 trích dẫn của Saharan

and Nehra, 2011). Việc chủng Rhizobium sp. giúp gia tăng đáng kể số lượng
nốt rễ cũng như năng suất so với đối chứng trong điều kiện ngoài đồng. Thử
nghiệm được tiến hành ở Ấn Độ cho thấy tùy thuộc vào cây họ Đậu, điều kiện
đất đai và khí hậu, thông qua việc chủng các rhizobium, có thể bổ sung
khoảng 50% nhu cầu về đạm, dẫn đến sự gia tăng năng suất đáng kể (Saharan
and Nehra, 2011). Ngoài hoạt động cố định N2, các rhizobium có thể cải thiện
tình trạng dinh dưỡng lân của cây trồng bằng cách huy động lân vô cơ và hữu
cơ. Alikhani et al., (2006) đã phân lập được từ đất trồng ở Iran các chủng
Rhizobium có khả năng hòa tan Ca3(PO4)2 và inositol hexaphosphate. Tương
phản với các loài Rhizobium được coi là rhizobium phát triển nhanh, các
Bradyrhizobium là loài phát triển chậm. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng đồng
cấy Bradyrhizobium và một số PGPR nhất định có thể ảnh hưởng tích cực đến
cố định đạm cộng sinh bằng cách tăng cường cả về số lượng và trọng lượng
khô của nốt rễ, thành phần năng suất, sản lượng ngũ cốc, hàm lượng dinh
dưỡng đất và tăng hoạt động nitrogenase ở các cây họ Đậu cũng như làm tăng
nốt rễ và sự cố định đạm ở Đậu nành tại những vùng có nhiệt độ vùng rễ thấp
(Polenko et al., 1987; Yahalom et al., 1987; Zhang et al., 1996; Dashti et al.,
1998 trích dẫn của Saharan and Nehra, 2011).
Cố định đạm bởi vi khuẩn cộng sinh với cây không họ đậu
Các nghiên cứu về hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn ảnh hưởng đến sự
phát triển của cây trồng cho thấy, hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: Chủng vi sinh vật, loài cây, loại đất, mật số
vi sinh vật, điều kiện môi trường... (Bashan and Levanony, 1988). Đối với cây
lúa cũng có khá nhiều các loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm được công
bố: Loài Burkholderia vietnamiensis được tìm thấy ở rễ cây lúa trồng miền
nam Việt Nam (Gillis et al., 1995; Van et al., 2000; Ngô Thanh Phong và Cao
Ngọc Điệp, 2013); Loài Pseudomonas stutzeri A15 sống nội sinh trong rễ lúa
(You et al., 1995); Stenotrophomonas maltophilia là loài có khả năng cố định
đạm, sản xuất chất điều hòa sinh trưởng kích thích sự phát triển của các loài
cây trồng trong đó có lúa, đồng thời giúp vi khuẩn chống lại các độc tố do ô

nhiễm môi trường (Ryan et al., 2009); Loài Klebsiella pneumoniae được phân
lập từ lúa và một số cây trồng khác, có khả năng cố định đạm cho cây không
thuộc họ đậu (Ladha et al., 1983); vi khuẩn Azospirillum là chi vi khuẩn được
9