Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả (Vibrio cholera) và độc tố tả còn hoạt tính bằng ELISA

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
KHÁNG THỂ IgY KHÁNG VI KHUẨN TẢ (Vibrio cholera) VÀ
ĐỘC TỐ TẢ CÒN HOẠT TÍNH BẰNG ELISA
Phạm Văn Hiển*; Vũ Bình Dương*; Ngô Xuân Trình*
Hồ Bá Ngọc Minh*; Ngô Thị Tuyết Mai*; Nguyễn Thị Hồng Thanh**
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng vi khuẩn (VK) tả và độc
tố tả còn hoạt tính. Đối tượng: kháng thể IgY kháng VK tả và kháng độc tố tả được sản xuất tại
Học viện Quân y. Phương pháp: thẩm định theo Hướng dẫn của ICH, Bộ Y tế Việt Nam. Kết
quả: xác định được điều kiện phân tích bằng phương pháp ELISA nhờ phản ứng tạo màu của
phức hợp kháng thể - HRP với cromogen đo ở bước sóng 450 nm. Phương pháp đã được
thẩm định, bảo đảm yêu cầu của phương pháp phân tích gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính,
độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD). Kết luận: đã xây
dựng và thẩm định được phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK tả và độc tố tả còn
hoạt tính bằng phương pháp ELISA.
* Từ khóa: Vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng độc tố tả; ELISA.

Determination of Activation of Anti-vibrio Cholera and Anti-vibrio
Cholera Toxin IgY by ELISA Method
Summary
Objectives: Establishment and validation of IgY anti-vibrio and anti-vibrio toxin by ELISA. Materials:
IgY anti-vibrio and IgY anti-vibrio toxin were prepared at Vietnam Military Medical University.
Methods: Using ELISA method based on colourimetry of complex IgY-HRP-cromogen at 450 nm.
The validation was carried out in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health guideline.
Results: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin was
established and validated completing of selectivity, linerity, presison, accuracy, LOD and LOQ.
Conclusions: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin
was validated fully in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health.
* Key words: Cholera; Anti-vibrio cholera IgY; Anti-vibriocholera toxin IgY; ELISA.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tả gây ra bởi VK tả (Vibrio cholera)
và độc tố tả (Vibrio cholera toxin), đặc biệt

đối với các nước nhiệt đới như Việt Nam,
là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe
cộng đồng. Theo báo cáo của WHO năm
2007, toàn thế giới có 177.963 trường hợp

* Học viện Quân y
** Đại học Y khoa Vinh
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương ()
Ngày nhận bài: 15/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/08/2016
Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016

110


Tạp chí y - dợc học quân sự số chuyên đề dợC-2016
mc dch t v con s t vong l 4.301
ngi [5]. Hng nm, cú trờn 100.000 ngi
mc t v 90% tp trung khu vc chõu
v chõu Phi. iu tr t, ngoi s
dng cỏc bin phỏp d phũng v iu tr
kinh in nh vc xin, bự nc in gii,
khỏng sinh, vic s dng cỏc khỏng th
khỏng VK t v c t t ng ung l
bin phỏp khỏ hu hiu [4]. Khỏng th
IgY l mt immunoglobin cú tỏc dng tt

iu tr cỏc dch bnh nhim trựng,
nhim c ng tiờu húa [6, 7, 8]. Hin
nay, Hc vin Quõn y ó ch to thnh
cụng khỏng th IgY khỏng VK t v c t
t cú ngun gc t trng g mỏi c
gõy min dch [2]. Nhm lm c s cho
ỏnh giỏ cht lng khỏng th v bo ch
ch phm dựng ng ung t ngun
nguyờn liu ny, chỳng tụi xõy dng phng
phỏp nh lng khỏng th IgY khỏng VK
t v c t t cũn hot tớnh bng phng
phỏp ELISA.
NGUYấN LIU, THIT B V
PHNG PHP NGHIấN CU
1. Nguyờn liu v thit b.
- Khỏng th chun IgY khỏng VK t
(Vibrio cholera) v IgY khỏng c t t
(chun i chiu) c Virusys Corporation
(M) cung cp (10 àg/ml; 0,1 ml).
- Khỏng th IgY khỏng VK t v IgY
khỏng c t t c B mụn Min dch,
Hc vin Quõn y cung cp.
- Khỏng nguyờn: chng VK t (Vibrio
cholerae) do Khoa Vi sinh vt, Bnh vin
Quõn y 103 cung cp, phõn lp t cỏc mu
bnh phm ca bnh nhõn mc bnh t
ti Vit Nam giai on 2010 - 2015. c
t t c Sigma (M > 98,0%) cung cp.
- Cỏc húa cht, trang thit b khỏc t
tiờu chun phõn tớch dc hc v vi sinh.

2. Phng phỏp nghiờn cu.
nh lng hot tớnh khỏng th IgY
khỏng VK t v c t t bng phng
phỏp ELISA. Thm nh phng phỏp
theo ch dn ca ICH v B Y t Vit Nam
gm: tớnh c hiu, khong tuyn tớnh,
ỳng, chớnh xỏc, gii hn nh lng
v gii hn phỏt hin [1, 3].
- Mu chun: chun b cỏc chun lm
vic cú nng 1,56 - 50 ng/ml bng pha
loóng chun gc IgY khỏng VK t v c
t t (10 àg/ml) vi dung mụi pha loóng.
- Mu th: s dng dung mụi pha
loóng khỏng th chun b mu th cú
nng khong 10 ng/ml.
- Mu trng: dung dch m pha loóng
khoỏng th IgY (Virusys Corporation, M,
IgY Sample Diluent 1x, cha 10 mM Tris,
pH 7,4 v 150 mM NaCl).
* Tin hnh: khỏng nguyờn VK t v
c t t c chun b cỏc nng
7,5 x 106 CFU/ml v 10 àg/ml. 100 àl mi
loi dung dch c gn lờn a 96 ging
trong dung dch m 0,1 M carbonatbicarbonat pH 9,6 40C v qua ờm.
Sau ú, thờm 200 àl dung dch PBS cha
0,05 Tween 20 v 1% BSA. Cỏc ging
ny sau ú vi 100 àl khỏng th IgY
khỏng c t t hoc VK t vi nng
khỏc nhau trong 2 gi nhit phũng.

Sau ú, cỏc ging vi phc hp HRP khỏng th IgG cu khỏng IgY g. gia
mi bc, ra ging vi 200 àl dung dch
PBS cha 0,05% Tween 20. Mu ca
phn ng c khai trin bng cỏch thờm
100 àl dung dch cromogen 1x (IAV_TMB cha 3,3', 5,5;-tetramethylbenzidine) tip
trong 15 phỳt trong búng ti. Dng phn
ng bng thờm 100 àl dung dch axớt HCl
1N. em c mt quang bc súng
450 nm.
111


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Tính đặc hiệu của phương pháp.
(a)

(b)

(c)

Hình 1: Kết quả quét phổ của dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng VK tả.
(a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng.
(a)

(b)

(c)

Hình 2: Kết quả quét phổ của dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng độc tố tả

(a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng.
Quét phổ để xác định cực đại hấp thụ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng.
Kết quả cho thấy phổ chuẩn và phổ thử đều xuất hiện cực đại hấp thụ ở bước sóng
450 nm. Trên mẫu trắng không có cực đại hấp thụ này, cho thấy phương pháp đảm bảo
tính đặc hiệu.
2. Khoảng tuyến tính.
Chuẩn bị dãy chuẩn từ 1,56 - 100,0 ng/ml bằng pha loãng dung dịch chuẩn gốc
với dung dịch pha loãng (chứa 10 mM Tris, pH 7,4 và 150 mM NaCl). Thực hiện
phản ứng theo như mô tả ở phương pháp nghiên cứu. Đánh giá mối tương quan
giữa nồng độ IgY và độ hấp thụ quang đo được. Kết quả trình bày như bảng 1, 2 và
hình 3, 4.
112


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016
Bảng 1: Mối tương quan giữa mật độ quang nồng độ IgY kháng VK tả.
Nồng độ IgY kháng VK tả (ng/ml)

Mật độ quang

X

SD

50

2,212

2,21

2,196

2,206

0,009

25

1,115

1,102

1,106

1,108

0,007

12,5

0,572

0,565

0,582

0,573

0,009

6,25

0,307

0,301

0,303

0,304

0,003

3,13

0,161

0,161

0,164

0,162

0,002

1,56

0,098

0,093

0,102

0,098

0,005

Độ hấp thụ

lgY kháng VK tả

Nồng độ (ng/ml)

Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và
nồng độ IgY kháng VK tả.
Bảng 2: Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ kháng thể IgY kháng độc
tố tả.
Nồng độ IgY kháng độc tố tả
(ng/ml)

Mật độ quang

X

SD

50

2,201

2,145

2,189

2,178

0,029

25

1,146

1,123

1,133

1,134

0,012

12,5

0,567

0,545

0,572

0,561

0,014

6,25

0,302

0,311

0,305

0,306

0,005

3,13

0,165

0,161

0,163

0,163

0,002

1,56

0,095

0,091

0,087

0,091

0,004

113


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016

Độ hấp thụ

lgY kháng độc tố tả

Nồng độ (ng/ml)

Hình 4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và
nồng độ IgY kháng độc tố tả.
Kết quả bảng 1, 2; hình 1 và 2 cho thấy: nồng độ IgY cũng như nồng độ kháng thể
IgY kháng độc tố tả và mật độ quang có tương quan chặt chẽ với nhau, hệ số tương
quan tuyến tính xấp xỉ bằng 1.
3. Độ lặp lại.
Tiến hành xử lý mẫu với các mẫu chuẩn kháng thể IgY kháng độc tố tả và VK tả có
nồng độ khác nhau: LQC (3,13 ng/ml), MQC (6,25 ng/ml)) và HQC (25 ng/ml). Phân
tích trong cùng 1 ngày, để bảo quản, sau đó phân tích sau 3 ngày để xác định độ lặp
lại của phương pháp phân tích.
Bảng 3: Kết quả xác định độ lặp lại trong ngày và khác ngày định lượng IgY kháng
VK tả và độc tố tả.

Loại

LQC (3,13 ng/ml)

IgY kháng
VK tả

3,08 ± 0,04

IgY kháng
độc tố tả

3,06 ± 0,05

1,29%

1,52%

a

c

c

3,06 ± 0,04
1,23%

a

MQC (6,25 ng/ml)

c

3,06 ± 0,05
1,64%

b

c

6,33 ± 0,07
1,11%

b

c

6,38 ± 0,11
1,67%

a

c

6,40 ± 0,09
1,40%

a

HQC (25 ng/ml)

c

6,41 ± 0,08
1,24%

b

c

a

24,82 ± 0,15
0,62%

b

c

0,57%
a

25,59 ± 0,27
1,05%

c

b

24,85 ± 0,14

c

b

25,67 ± 0,14
0,55%

c

(a

Độ lặp lại trong ngày được tính ± SD, n = 3; b) Độ lặp lại khác ngày (sau 3 ngày)
tính là ± SD, n = 6; c) RSD tính là SD/ × 100%.
Kết quả cho thấy, RSD ở 3 mức nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn, kể cả trong
ngày và khác ngày đều < 2,0%. Với kết quả này, phương pháp phân tích đáp ứng yêu
cầu về độ lặp lại.
4. Độ đúng.
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định độ đúng của phương pháp định lượng.
Thêm các lượng kháng thể IgY chuẩn vào mẫu thử đã biết hàm lượng. Tiến hành xử lý
mẫu theo phương pháp đã lựa chọn ở trên. Sau đó, đo mật độ quang ở bước sóng
450 nm và dựa vào đường chuẩn để ngoại suy lượng thêm vào.
114


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016
Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng định lượng IgY kháng VK tả và độc tố tả.
LQC (3,13 ng)
Loại

MQC (6,25 ng)

HQC (25 ng)

Lượng tìm
thấy (ng)

Độ thu hồi
(%)

Lượng tìm
thấy (ng)

Độ thu hồi
(%)

Lượng tìm
thấy (ng)

Độ thu hồi
(%)

IgY kháng VK tả

3,10 ± 0,09

98,9 ± 2,7

6,26 ± 0,05

100,2 ± 0,8

25,22 ± 0,38

100,9 ± 1,5

IgY kháng độc tố tả

3,13 ± 0,08

100,1 ± 2,6

6,32 ± 0,05

101,2 ± 0,7

25,66 ± 0,20

102,6 ± 0,8

Ở 3 mức thêm chuẩn, độ thu hồi của mẫu đều đạt ≥ 98%. Như vậy, phương pháp
định lượng đáp ứng yêu cầu về độ đúng.
5. Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện.
Có nhiều phương pháp để xác định giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện của
phương pháp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp ngoại suy từ độ
dốc đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của mẫu trắng để xác định LOD và LOQ, trong
đó LOD = 3,3 × SD/δ và LOQ = 10 × SD/δ; với SD là độ lệch chuẩn của mẫu trắng và
δ là độ dốc đường tuyến tính. Kết quả nghiên cứu đã xác định được LOD và LOQ của
IgY kháng VK tả và IgY kháng độc tố tả đều lần lượt là 0,04 ng/ml và 0,13 ng/ml.
* Áp dụng đánh giá một số mẫu kháng thể IgY:
Chúng tôi áp dụng phương pháp định lượng trên để xác định lượng kháng thể IgY

còn hoạt tính trong một số mẫu sản xuất ở Học viện Quân y.
Bảng 5: Kết quả xác định lượng IgY kháng VK tả và độc tố tả ở một số mẫu.
Mẫu

% IgY kháng VK tả còn hoạt tính

% IgY kháng độc tố tả còn hoạt tính

1

67,6 ± 5,3%

-

2

80,5 ± 7,3%

-

3

96,1 ± 5,3%

-

4

-

88,5 ± 4,2%

5

-

56,7 ± 8,3%

6

-

94,5 ± 5,3%

Như vậy, lượng IgY còn hoạt tính ở một số mẫu sản xuất được tại Học viện Quân y
dao động ở mức khoảng ≥ 60%. Điều này có thể do các mẫu này lấy ở phân đoạn với
phương pháp tách chiết và tinh chế khác nhau.
KẾT LUẬN
Đã xây dựng được phương pháp định
lượng IgY còn hoạt tính kháng VK tả
và độc tố tả bằng phương pháp ELISA.
Phương pháp được thẩm định theo quy

định chung của ICH và Bộ Y tế Việt Nam,
đảm bảo các yêu cầu về tính đặc hiệu, độ
đúng (98,9 - 102,6%), độ chính xác (RSD
< 2%), độ lặp lại, giới hạn định lượng và
giới hạn phát hiện. Xác định lượng IgY
kháng VK tả và độc tố tả ở một số mẫu
115

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016
cho thấy lượng kháng thể còn hoạt tính
của IgY kháng VK tả từ 67,6 - 96,1%,
của IgY kháng độc tố tả từ 56,7 - 94,5%,
tùy thuộc vào phương pháp tinh chế, tách
chiết khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Cục Quản lý Dược - Bộ Y tế. Sổ tay
Hướng dẫn tạm thời đăng ký thuốc. Ban hành
kèm theo quyết định số 229/QĐ-QLD ngày 12
tháng 08 năm 2010. 2010.
2. Hoàng Trung Kiên và CS. Nghiên cứu
quy trình gây miễn dịch tạo kháng thể IgY
kháng VK tả (Vibrio cholerae) trên gà mái.
2013, số 1.
3. ICH. Validation of analytical procedures:
text and methodology. Q2R1. 2005.
4. Kazuyuki Hirai et al. Passive oral
immunization by egg yolk immunoglobulin
(IgY) to Vibrio cholerae effectively prevents

116

cholera. Acta Med Okayama. 2010, 64 (3),
pp. 163-170.
5. World Health Organization., Cholera 2007.
Wkly Epidemiol Rec Geneva. 2008, 83, pp.269283.
6. Xiao-Yu Li et al. Chitosan-alginate

microcapsules for oral delivery of egg yolk
immunoglobulin (IgY): in vivo evaluation in a
pig model of enteric colibacillosis. Veterinary
Immunology and Immunopathology. 2009,
129 (1), pp.132-136.
7. Xiao-Yu Li et al. Chitosan-alginate
microcapsules for oral delivery of egg yolk
immunoglobulin (IgY). Journal of Agricultural
and Food Chemistry. 2007, 55 (8), pp.29112917.
8. Yoshinori Mine, Jennifer Kovacs-Nolan.
Chicken egg yolk antibodies as therapeutics
in enteric infectious disease: a review. Journal
of Medicinal Food. 2002, 5 (3), pp.159-169.