Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin trong phytosome rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG RUTIN
TRONG PHYTOSOME RUTIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Nguyễn Tô Hiệu*; Nguyễn Văn Bạch**
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rutin trong chế phẩm phytosome
rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản
phẩm. Đối tượng và phương pháp: nguyên liệu phytosome rutin. Tiến hành định lượng rutin
bằng phương pháp HPLC với cột XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), detector PDA, bước sóng
255 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 15 μl, pha động acetonitrile-axít formic 0,1%
(24:76, tt/tt). Kết quả: phương pháp xây dựng được đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, độ
tuyến tính, khoảng xác định, độ đúng và độ chính xác. Áp dụng phương pháp để xác định hàm
lượng rutin trong nguyên liệu phytosome rutin. Kết luận: phương pháp định lượng đảm bảo các
yêu cầu và có thể áp dụng để định lượng rutin trong chế phẩm.
* Từ khoá: Định lượng rutin; Phytosome rutin; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Develop and Validate Quantificative Method for Rutin in Phytosome
Rutin by High Performance Liquid Chromatography
Summary
Objectives: To develop and validate rutin quantitative determination method in rutin phytosome
by high performance liquid chromatography (HPLC) to contribute to product standardization.
Subjects and methods: Phytosomal rutin material. Rutin quantification by HPLC with XBrigde
C18 (250 x 4.6 mm; 5 μm), PDA detector, wave length of 255 nm, flow rate of 1.0 mL/min,
injection volume of 15 μL, mobile phase acetonitrile - formic acid 0.1% (24:76, v/v). Results: The
development method had assured specificity, compatability, linearity and range, accuracy and
precision. Conclusion: Quantitative method ensures requirements and can be used to quantify
rutin in the preparations.
* Keywords: Rutin quantification; Phytosome rutin; High performance liquid chromatography.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rutin là hoạt chất thuộc nhóm flavonoid,
là sản phẩm hợp chất thiên nhiên có hoạt
tính sinh học và dược lý cao [1]. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh sản phẩm này
có khả năng chống oxy hóa, chống viêm,
chống ung thư và khối u [3]. Nhưng rutin

có nhược điểm là khó tan trong nước dẫn
đến sinh khả dụng kém. Việc nghiên cứu
đưa hoạt chất rutin vào hệ thống mang
thuốc phytosome để cải thiện hiệu quả
điều trị, đồng thời giảm liều dùng là vấn
đề có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao
[2, 4, 5].

* Bệnh viện Quân y 105 - Tổng cục Hậu cần
** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tô Hiệu ()
Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/11/2017
Ngày bài báo được đăng: 01/12/2017

12


T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017
Nghiên cứu định lượng rutin trong chế
phẩm phytosome rutin rất quan trọng, góp
phần xây dựng công thức bào chế, cũng
như tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm.
Có nhiều phương pháp định lượng rutin

như phương pháp quang phổ hấp phụ tử
ngoại khả kiến (UV-Vis) hay phương pháp
cân [2, 7]. Tuy nhiên, các phương pháp
trên có độ chính xác không cao, sai số
trong định lượng lớn. Vì vậy, chúng tôi
nghiên cứu: “Xây dựng và thẩm định phương
pháp định lượng rutin trong phytosome rutin
bằng HPLC” nhằm góp phần tiêu chuẩn
hoá chất lượng sản phẩm
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu và thiết bị.
- Phytosome rutin có các thành phần
phần dược chất là rutin và phần phospholipid
là phosphatidyl choline, bào chế bằng
phương pháp bốc hơi dung môi tại
Bộ môn Kiểm nghiệm, Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược.
- Hóa chất: acetonitril, methanol, axít
formic, nước cất đạt tiêu chuẩn cho HPLC;
chất chuẩn rutin (Viện Kiểm nghiệm Thuốc
TP. HCM, Việt Nam, 88,2%); hóa chất dung
môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
- Hệ thống HPLC Water e 2695 (Mỹ)
gồm hệ bơm 4 kênh dung môi, auto sample,
detector PDA, cột XBrigde C18 (250 x
4,6 mm; 5 μm).
+ Mẫu trắng: cân chính xác 125,0 mg
phosphatidyl cholin, hòa tan trong bình
định mức 25 ml bằng methanol. Hút chính

xác 1,0 ml dung dịch trên cho vào bình
định mức 50 ml, thêm methanol vừa đủ
đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc
0,45 μm
- Dụng cụ: cân phân tích Mettle Toledo
(độ chính xác 0,1 mg) và các dụng cụ phân
tích đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
- Điều kiện sắc ký:
+ Cột: XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm);
detector UV tại bước sóng 255 nm; tốc độ
dòng: 1,0 ml/phút; thể tích tiêm 15 μl; pha
động; acetonitril - axít formic 0,1% (theo
gradient thể tích).
- Chuẩn bị mẫu [8, 9]:
+ Mẫu chuẩn: cân chính xác 14,0 mg
rutin chuẩn hòa tan trong bình định mức
25 ml bằng methanol. Hút chính xác 1,0 ml
dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml,
thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều.
Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
+ Mẫu thử: cân chính xác 68,0 mg chế
phẩm phytosome rutin, hòa tan trong bình
định mức 25 ml bằng methanol. Hút chính
xác 1,0 ml dung dịch trên cho vào bình định
mức 50 ml, thêm methanol vừa đủ đến
vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Dung dịch axít formic 0,1%: hút chính
xác 1,0 ml axít formic đậm đặc pha vào 1 lít
nước cất, lọc qua màng lọc 0,45 μm [7].

- Thẩm định phương pháp: với các tiêu
chí về tính đặc hiệu, tính tương thích hệ
thống, độ tuyến tính và khoảng xác định,
độ đúng và độ chính xác [10].
13


T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng.
* Khảo sát bước sóng phân tích:

Hình 1: Kết quả quét phổ hấp thụ.
Tiến hành quét phổ phân tích mẫu chuẩn trong dải bước sóng từ 200 - 500 nm.
Kết quả cho thấy tại bước sóng 255 nm, mẫu chuẩn cho độ hấp thụ lớn, đặc trưng cho
chất cần phân tích, phù hợp yêu cầu định lượng.
* Khảo sát tỷ lệ dung môi:

0.08

AU

0.06
0.04
0.02
0.00
0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50

5.00

5.50

Minutes
Hình 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn ở tỷ lệ acetonitril-axít formic 24:76.
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn trong 10 phút với gradient thể tích dung môi pha động
acetonitril-axít formic 0,1%. Tại thời điểm bắt đầu, tỷ lệ acetonitril-axít formic (10:90),
kết thúc tỷ lệ là 40:60. Từ đó, tìm ra tỷ lệ dung môi pha động đạt yêu cầu của phương
pháp định lượng.
Từ kết quả sắc ký đồ trên máy, chọn tỷ lệ dung môi acetonitrile-axít formic 24:76 để
sử dụng cho phương pháp định lượng. Ở tỷ lệ dung môi này, thời gian lưu của chất
ngắn nhất, píc cân đối, chất cần phân tích tách ra khỏi tạp.
14

T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017
* Khảo sát cột chạy sắc ký:

Hình 3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn chạy trên cột cột SunFire C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm).

0.08

AU

0.06
0.04
0.02
0.00
0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50

5.00

5.50

nutes XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm).
Hình 4: Sắc ký đồ mẫu chuẩn chạy trênMicột
Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn trên hai hệ thống cột khác nhau là cột XBrigde
C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) và cột SunFire C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm). Kết quả ghi nhận
sắc ký đồ cho thấy sắc ký đồ khi chạy cột SunFire C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), píc chất
chuẩn không tách khỏi tạp, còn khi chạy trên cột XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm),
píc tách khỏi tạp. Do vậy, nghiên cứu chọn cột XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) làm
cột chạy sắc ký cho phương pháp.
Từ các điều kiện khảo sát trên xây đựng được điều kiện hệ thống sắc ký định lượng
rutin trong chế phẩm phytosome rutin bằng HPLC như sau:
+ Cột: XBrigde C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm).
+ Detector UV tại bước sóng 255 nm.
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
+ Thể tích tiêm: 15 μl.
+ Pha động: acetonitrile-axít formic 0,1% (24:76).
15


T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017
2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng.
* Tính đặc hiệu:

Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng. Sắc ký đồ của các mẫu trên
thể hiện ở các hình 5, hình 6 và hình 7.

Hình 5: Sắc ký đồ mẫu trắng.
0.08

AU

0.06
0.04
0.02
0.00
0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50

5.00

4.00

4.50

5.00

5.50

Minutes

Hình 6: Sắc ký đồ mẫu thử.
0.08

AU

0.06
0.04
0.02
0.00
0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

Minutes

Hình 7: Sắc ký đồ mẫu chuẩn.
16

5.50


T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017
Kết quả sắc ký đồ cho thấy mẫu thử cho píc của rutin có thời gian tương ứng
với thời gian lưu của píc rutin trong mẫu chuẩn. Píc của rutin trong mẫu thử cân đối,
tách hoàn toàn khỏi píc tạp. Đồng thời mẫu trắng không thấy xuất hiện píc có thời gian
lưu tương ứng với thời gian lưu của rutin trong mẫu chuẩn và mẫu thử. Vì vậy,
phương pháp đảm bảo yêu cầu về tính đặc hiệu.
* Tính tương thích hệ thống:
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch rutin chuẩn có nồng độ khoảng 25 μg/ml vào
hệ thống sắc ký.
Bảng 1: Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống sắc ký.
Số thứ tự

Thời gian lƣu của píc

(phút)

Diện tích píc
(mAU.s)

Hệ số bất đối xứng

Số đĩa lý thuyết

1

4,543

596086

1,26

9538

2

4.551

596905

1,25

9417

3

4,541

596407

1,26

9481

4

4,545

598416

1,25

9370

5

4,544

597852

1,24

9471

6

4,547

559130

1,23

9465

Trung bình

4,545

590799

1,24

9488

RSD %

0,1

2,6

Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích píc của mẫu chuẩn rutin lần
lượt là 0,1% và 2,6%. Hệ số bất đối xứng của píc rutin là 1,24 (đạt yêu cầu < 2), số đĩa
lý thuyết 9.488 (đạt yêu cầu > 3.000). Như vậy, phương pháp phân tích hoàn toàn phù
hợp với hệ thống sắc ký.
* Độ tuyến tính và khoảng xác định:

Pha một dãy nồng độ dung dịch rutin chuẩn trong pha động có nồng độ từ 10 - 35 μg/ml
[3]. Tiến hành sắc ký các dung dịch theo điều kiện sắc ký đã nêu.
Bảng 2: Kết quả khảo sát tuyến tính của phương pháp định lượng rutin
Số thứ tự

Nồng độ rutin (μg/ml)

Diện tích píc (mAU.s)

1

10

424802

2

15

470666

3

20

559130

4

25

596086

5

30

638760

6

35

716597

17


T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017

Hình 8: Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc rutin.
Trong khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tính chặt giữa nồng độ rutin
và diện tích píc với hệ số tương quan R2 = 0,9865. Khoảng tuyến tính này phù hợp để
định lượng rutin trong phytosome rutin.
* Độ đúng:
Tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu được dung dịch mẫu tự do có nồng độ
20, 25, 30 μg/ml, mỗi nồng độ tiến hành trên 3 mẫu riêng biệt.
Tiến hành định lượng mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng, mỗi mẫu tiêm 1 lần.
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng rutin.
STT

Nồng độ rutin
ban đầu (μg/ml)

Diện tích píc (mAU.s)

Nồng độ rutin
thu hồi (μg/ml)

Tỷ lệ thu hồi

1

20,03

539446

20,03

100,00

2

20,45

544247

20,45

100,00

3

20,18

541160

20,18

100,00

4

25,35

600254

25,34

99,96

5

25,44

601282

25,43

99,96

6

25,28

599453

25,27

99,96

7

30,15

655118

30,14

99,97

8

30,47

658775

30,46

99,97

9

30,05

653975

30,04

99,97

Trung bình

99,98

RSD (%)

0,018

Phương pháp có độ thu hồi từ 99,96 - 100,0%. Do đó, phương pháp đạt yêu cầu về
độ đúng.
18


T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017
* Độ chính xác:
Độ chính xác của phương pháp định
lượng được xác định khi định lượng mẫu
thử ở điều kiện sắc ký như trên, 6 lần của
một ngày và 6 ngày khác nhau.

Bảng 4: Kết quả đánh giá độ lặp lại của
phương pháp định lượng rutin (n = 6).
Mẫu

Diện tích
píc (mAU.s)

Ngày

Diện tích
píc (mAU.s)

1

592731

1

598301

2

596086

2

600652

3

601324

3

601982

4

602982

4

603721

5

608451

5

596523

6

603791

6

604865

X

600894

X

598301

RSD (%)

0,94

RSD (%)

0,53

Phương pháp có độ lặp lại cao với giá
trị độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0.94
và 0,53 (đạt yêu cầu < 2%).
KẾT LUẬN
- Nghiên cứu đã xây dựng được phương
pháp định lượng rutin bằng HPLC với
điều kiện sắc ký: cột XBrigde C18 (250 x
4,6 mm; 5 μm), detector UV tại bước sóng
255 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích
tiêm 15 μl, pha động; acetonitrile-axít
formic 0,1% (24:76).

2. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam IV. NXB
Y học. 2009.

3. Devendra S, M.S.M Rawat, Ajay S,
Mona S. Rutin-phospholipid complex: an
innovative technique in novel drug delivery
system - NDDS. Current Drug Delivery. 2012,
pp.305-314.
4. Anupama S, Vikas A. S, Manjeet S et al.
Phytosome: drug delivery system for polyphenolic
phytoconstituents. Iranian Journal of Pharmaceutical
Sciences. 2011, 7 (4), pp.209-219.
5. Patel A, Tanwar Y.S, Suman R et al.
Phytosome: phytolipid drug dilivery system
for improving bioavailability of herbal drug.
Journal of Pharmaceutical Science and
Bioscientific Research. 2013, 2, pp.51-57.
6. Ayşegül K, Fatih T. Phyto-phospholipid
complexes as drug delivery system for herbal
extracts/molecules. Turk J Pharm Sci. 2015,
12 (1), pp.93-102.
7. V. Dighe, D. Mestry. Simultaneous
quantification of rutin and isoquercitrin from
Jasminum Sambac AIT, by high performance
thin layer chromatography. Internation Journal
of Pharmaceutical Siences and Research.
2012, pp.2086-2092.
8. Yu Guo, Li-xian Shen1, Yan-feng Lu,
Hai-yanLi, Ke Min, Lan-fang Li, Cui-yun Yu,
Xing Zheng. Preparation of rutin-liposome
drug delivery systems and evaluation on their
in vitro antioxidant activity. Chinese Herbal
Medicines. 2016, pp.371-375.

- Đã thẩm định được phương pháp có
tính tương thích, độ đặc hiệu, độ tuyến
tính và khoảng xác định, độ đúng và độ
chính xác cao.

9. Yao Huang, Fang Feng, Jie Jiang, Ying
Qiao, Tao Wu, Josef Voglmeir, ZhiGang Chen.
Green and efficient extraction of rutin from
tartary buckwheat hull by sing natural deep
eutectic solvents. Food Chemistry. 2016, pp.1-24.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

10. US Department of Health and Human
Services. Food and drug evaluation and
reseach. Guidance for Industry - bioanalytical
method validation. 2001.

1. Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược
Hà Nội. Bài giảng Dược liệu. NXB Y học.
Hà Nội. 2004, tr.279-293.

19