Xây dựng hệ thống định lượng alpha fetoprotein từ kháng thể đơn dòng kháng alpha fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột lou

XÂY DỰNG HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN
TỪ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN
ĐƯỢC SẢN XUẤT TỪ TẾ BÀO LYMPHÔ B CỦA CHUỘT LOU
Phan Ngọc Tiến*

TÓMTẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein trong huyết thanh từ kháng thể
đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP).
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm.
Kết quả: Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng
kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983F,
có thể định lượng nồng độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng/ml. Nghiên cứu định lượng AFP trong 90 mẫu
huyết thanh, trong đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có
HBsAg (+), 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân
u gan. Giá trị AFP tương ứng là 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, nồng độ AFP trong huyết thanh ở bệnh
nhân u gan là > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%).
Kết luận: Hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP được sản xuất từ chuột
LOU có khả năng định lượng AFP trong huyết thanh từ 0,5-350ng/ml.

ABSTRACT
THE SYSTEM FOR ALPHA-FETOPROTEIN QUANTITATVE DETERMINATION USING ANTIALPHA-FETOPROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU RAT
Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 4 - 2007: 208 - 212
Purpose: Set up the system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using
monoclonal antibodies.
Method: Experimental research.
Results: The test ELISA for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal
antibodies of LOU rat had realized and characterized by the sensitivity of 0,5ng/ml.
In the study for determination of alpha-fetoprotein in 90 serum samples, composed of 35 serum samples
of normal donors, 14 serum samples of patients with HBsAg (+), 16 serum samples of patients with acute B
hepatitis, 25 serum samples of patients with hepatoma, have the serum concentration of AFP 2,8 ng/ml, 3,8
ng/ml, 32,1 ng/ml, and the serum concentration of AFP of patients with hepatoma > 500 ng/ml (76%), AFP

< 500 ng/ml (24%), respectively.
Conclusion: The system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal
antibodies of LOU rat can quantify from 0,5ng/ml to 350ng/ml.
nhiều lĩnh vực nhất là trong kỹ thuật nhận
ĐẶTVẤNĐỀ
diện và định lượng kháng nguyên.
Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng
được Georges Kohler và César Milstein trình
bày năm 1975(1), và từ đó cho đến nay kháng
thể đơn dòng đã được ứng dụng trong rất

Alpha-fetoprotein (AFP), một glycoprotein, có
trọng lượng phân tử khoảng 70.000 dalton, được
tổng hợp ở gan phôi thai và túi ối, vì vậy nồng độ
AFP bình thường trong dịch ối và huyết thanh

* Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TP. Hồ Chí Minh
209


bào thai người rất cao. Tuy nhiên AFP có trong
huyết thanh người sau sinh và người trưởng
thành rất thấp, chỉ khoảng 3ng/ml(7,9,11).
Trong bệnh ung thư tế bào gan nguyên
phát AFP tăng rất cao, và việc định lượng AFP
trong huyết thanh gốp phần chẩn đoán bệnh
ung thư gan nguyên phát.
Với kháng thể đơn dòng kháng AFP, được
sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã
mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983(3), chúng

tôi xây dựng hệ thống định lượng AFP trong
huyết thanh người bằng kỹ thuật ELISA(5,10).

Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng hệ thống định lượng alphafetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng
kháng alpha-fetoprotein được sản xuất từ tế
bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với
AFP và dòng tế bào IR983.

ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm.

Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu
- Kháng thể đơn dòng kháng AFP, kháng thể
đơn dòng kháng AFP có gắn men peroxidase.
- Và 90 mẫu huyết thanh, được thu thập tại
Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế
và Trung Tâm Ung Bướu TP Hồ Chí Minh.
Trong đó 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân
có siêu âm hoặc CT scan phát hiện u gan, trong
đó 20 nam và 5 nữ, 16 mẫu huyết thanh của
bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan siêu vi B
cấp HBsAg (+), trong đó 9 nam và 7 nữ, 14
mẫu huyết thanh có HBsAg (+) nhưng không
có biểu hiện lâm sàng, trong đó 10 nam – 4 nữ,
35 mẫu huyết thanh của người bình thường
khỏe mạnh, HBsAg (-).

Phương pháp thu thập số liệu

- Xác định mối quan hệ tuyến tính giữa hai
đại lượng nồng độ AFP và giá trị mật độ quang
tương ứng (DO): dùng phương pháp ELISA.

350, 400, 500 ng/ml. Chúng tôi sử dụng AFP tinh
chế và chuẩn độ của Viện Pasteur Tp. HCM.
- Xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể
định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ
chuột LOU: dùng phương pháp ELISA
- Xác định mật độ quang tương ứng của các
nồng độ thấp của AFP: 0; 0,25; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2,5; 5
ng/ml. Từ đó xác định nồng độ AFP thấp nhất có
thể định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ
chuột LOU với phương pháp ELISA.
- Định lượng AFP trong các mẫu huyết
thanh bằng hệ thống định lượng sử dụng
kháng thể đơn dòng của chuột LOU: dùng
phương pháp ELISA.
Chuẩn bị 90 mẫu huyết thanh được đánh
số thứ tự từ 1 đến 90, trong đó 35 mẫu huyết
thanh của người bình thường được đánh số từ
1 đến 35, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân
có HBsAg (+) được đánh số từ số 36 đến 49, 16
mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu
vi B cấp được đánh số từ 50 đến 65, 25 mẫu
huyết thanh của bệnh nhân u gan được đánh
số từ 66 đến 90. Lần 1 mẫu huyết thanh định
lượng không pha loãng, lần 2 những mẫu
huyết thanh có nồng độ trên 350 ng/ml ở lần 1
sẽ được pha loãng với tỉ lệ 1:2. Những mẫu

huyết thanh nào tiếp tục có nồng độ trên
350ng/ml thì chúng tôi quyết định lấy kết quả
cuối cùng là trên 500 ng/ml.

Xử lý số liệu
Chương trình Point To Point, chương trình
dùng cho xử lý số liệu trong kỹ thuật Elisa để
tính kết quả định lượng nồng độ AFP. Chương
trình SPSS 11.5

KẾTQUẢ
Quan hệ tuyến tính giữa hai đại lượng nồng
độ AFP và giá trị mật độ quang tương ứng
Với kết quả thu được chúng tôi nhận thấy
khi nồng độ AFP tăng thì DO cũng tăng theo.
Nhưng đến nồng độ AFP bằng 350, 400, 500
ng/ml thì DO tăng không đáng kể.

- Xác định mật độ quang tương ứng của các
nồng độ AFP: 0, 5, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300,
210


Do vậy chúng tôi chỉ ứng dụng định lượng
nồng độ AFP trong huyết thanh đến mức cao
nhất là 350ng/ml.

+ Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng:
y = a + bx, trong đó:
Như vậy phương trình hồi qui tuyến tính

là: y = 0,599 + 0,0055x

Qua đường cong chuẩn của hệ thống định
lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng
kháng AFP của chuột LOU (đồ thị 1), chúng
tôi nhận thấy hai đại lượng DO và nồng độ
AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận.

+ P = 0,002 (< 0,01): chứng tỏ mối liên quan
tuyến tính theo chiều thuận giữa hai đại lượng
DO và nồng độ AFP là rất rõ rệt, sự tương
quan có ý nghĩa thống kê.

DO

+ r = 0,880: chứng tỏ hai đại lượng DO và
nồng độ AFP có mối liên hệ thuận rất chặt chẽ.
3,0

2,5

2,0

8

9

300

350

7

6
5

1,5
4
1,0
3
,5
2
1
0,0
0

50

100

150

200

250

400

450

500

AFP (ng/ml)

DO

Đồ thị 1: Đưông cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP với kháng thể đơn dòng từ chuột Lou
,30

,25
8
,20

7

,15
6
,10

5
1

2

3 4

,05

0,00
0

1

2

3

4

5

6

AFP (ng/ml)

Đồ thị 2: Đồ thị biểu diễn những giá trị thấp của nồng độ AFP
độ AFP giảm thì giá trị DO giảm theo, nhưng
Kết quả nồng độ AFP chuẩn thấp nhất mà hệ
khi đến nồng độ 0,5 ng/ml thì đường biểu diễn
thống định lượng AFP dựa trên kháng thể
đi ngang. Do vậy giá trị thấp nhất mà hệ thống
đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể
định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng
định lượng được (đồ thị 2)
kháng AFP của chuột LOU có thể định lượng
Qua đường biểu diễn trên ta thấy khi nồng
211


được là 0,5 ng/ml.

KẾTLUẬN

Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các
mẫu huyết thanh bằng hệ thống định lượng
AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP
của chuột LOU

Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein
bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn
dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào
lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP
và dòng tế bào IR983, có thể định lượng nồng
độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng đến
350ng/ml.

Số thứ tự Số mẫu Giá trị Giá trị lớn
Giá trị
mẫu huyết huyết nhỏ nhất
nhất
trung bình
thanh
thanh
1-35
35
1,08
7,26
2,7780
36-49
14

0,91
6,08
3,7993
50-65
16
6,2
113,53
32,1806

Giá trị trung bình nồng độ AFP của những
bệnh nhân u gan (những mẫu huyết thanh từ
số 66 đến 90) đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6
mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).

BÀNLUẬN
Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein
trong huyết thanh người bằng phương pháp
Elisa sử dụng kháng thể đơn dòng được sản
xuất từ tế bào lymphô B của chuột Lou và
dòng tế bào IR983F (AFP-L) có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao vì có khả năng định lượng AFP ở
nồng độ rất thấp là 0,5ng/ml so với hệ thống
định lượng của các hãng khác là Abbott
0,4ng/ml(2) và Maxim Biotech 2ng/ml(6), và
AFP-L có thể định lượng nồng độ AFP cao
nhất là 350ng/ml so với của hãng Abbott là
350ng/ml(2) và Maxim Biotech là 300mg/ml(6).
Hệ thống AFP-L có độ đặc hiệu cao vì qua các
thử nghiệm đặc tính và định lượng không có
phản ứng chéo với các protein của huyết thanh

nhất là với albumin, protein có trọng lượng
phân tử và cấu trúc gần giống với AFP.
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong 90
mẫu huyết thanh có kết quả tương đồng với
các nghiên cứu trong và ngoài nước(2,6,8).
Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng
kháng thể đơn dòng được sản xuất từ chuột
Lou có khả năng định lượng AFP trong huyết
thanh từ 0,5-350ng/ml, và chúng tôi hy vọng
góp phần nhỏ trong việc sử dụng những hệ
thống định lượng AFP.

Mật độ quang và nồng độ AFP có mối
quan hệ tuyến tính thuận với r = 0,880, p =
0,002 (< 0,01), và y = 0,599 + 0,0055x (y: DO; x:
nồng độ AFP chuẩn).
Kết quả nồng độ AFP định lượng bằng hệ
thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn
dòng kháng AFP của chuột LOU
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những
người bình thường là 2,8 ng/ml.
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những
bệnh nhân có HBsAg(+) là 3,8 ng/ml.
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những
bệnh nhân Viêm gan siêu vi B cấp là 32,1 ng/ml.
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những
bệnh nhân u gan đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6
mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).
Cám ơn: GS.TS. Nguyễn Lê Trang, Viện Pasteur Tp. HCM,
BS. Cao Đức Trùng Dương và BS. Lưu Thị Thanh Loan, BV Từ

Dũ Tp. HCM đã giúp thực hiện nghiên cứu này.

TÀILIỆUTHAMKHẢO
1.

2.
3.
4.
5.
6.

7.

8.

Abbas AK., Lichtman AH., Jordan S.poder (1994), Cellular
snd Molecular Immunology, W.B. Sauders Company, A
division of Harcourt Brace Company, USA.
Abbott laborarories Dignostics division (1992), In tumor
marker/prenatal testing assay IM x AFP, No2257, pp.1-8.
Bazin H (1990), Rat Hybridomas and Rat Monoclonal
Antobody, CRC Press, USA.
Harrison’s (1993), Principles of internal medicine, 12th
Edition, Vol 2, pp.1381-1383.
Kemeny D.M. (1991), A practiceal guide to Elisa, Department
of Allergy Guy’s Hospital, London.
Maxim Biotech (2006), “Alpha-fetoprotein Enzyme
Immunoassay test kit”, Catalog number: DP-1001, LA,
USA.
Nguyễn Cao Cương (2000), “Tầm sóat ung thư gan

nguyên phát”, Nội khoa y học, TTĐT&BDCBYT, tập 3(4),
tr.24-28.
Nguyễn Kim Lữ Hiếu, Lê Văn Đôn (1996), “Nồng độ
Alpha-fetoprotein ở 37 bệnh nhân được chẩn đoán lâm
sàng là viêm gan B cấp tính”, Tạp chí y học thực hành, (3), tr.
1-3.

212


9.
10.
11.

Nguyễn Văn Vân (2000), “Ung thư gan”, Bách khoa thư bệnh học
tập 1, nhà xuất bản tự điển bách khoa, Hà Nội, tr. 303-306.
Tijssen P. (1985), Practice and Theory of enzyme
immunoassays, Elsevier, The Netherlands.
Trần Thị Chính, Phan Thị Phi Phi, Trương Mộng Trang
(1993), “Đánh giá khả năng chẩn đoán ung thư gan của
Alpha-fetoprotein”, Y học Việt Nam, (5), tr.31-35.

213


214