Kết quả bảo quản lạnh sâu mô tinh hoàn chuột cống trắng chưa trưởng thành

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016

KẾT QUẢ BẢO QUẢN LẠNH SÂU MÔ TINH HOÀN
CHUỘT CỐNG TRẮNG CHƯA TRƯỞNG THÀNH
Nguyễn Thị Hiệp Tuyết*; Bùi Thanh Thủy*
Phạm Minh Huệ*; Nguyễn Khang Sơn**
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá khả năng bảo quản lạnh sâu mô tinh hoàn chuột cống trắng chưa trưởng
thành khi sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ theo chương trình và phương pháp thuỷ tinh hoá.
Phương pháp: bảo quản mô tinh hoàn chuột cống trắng chưa trưởng thành (5 tuần tuổi) bằng
phương pháp đông chậm theo chương trình và thủy tinh hóa trong 4 tuần. Kết quả: tỷ lệ ống
sinh tinh (OST) được bảo vệ tốt ở hai phương pháp lần lượt là 79,9% và 34,2%. Đường kính
OST giảm nhẹ ở phương pháp đông chậm và tăng lên ở phương pháp thuỷ tinh hóa. Tuyến kẽ
không bị tổn thương sau bảo quản ở hai lô thực nghiệm lần lượt là 70,5% và 28,4%. Kết luận:
mô tinh hoàn có thể được bảo quản tốt trong nitơ lỏng. Phương pháp đông chậm theo chương
trình bảo vệ mô tinh hoàn tốt hơn so với phương pháp thủy tinh hóa.
* Từ khoá: Mô tinh hoàn; Bảo quản lạnh sâu; Đông chậm theo chương trình; Thủy tinh hóa.

Result of Cryopreservation of Immature Rat Testicular Tissue
Summary
Objectives: To evaluate the ability of cryopreservation of immature rat testicular tissue when
using the controlled slow freezing and vitrification. Subjects and methods: Testicular tissue of
immature rat (5 weeks) were cryopreserved by controlled slow freezing and vitrification in 4
weeks. Results: Structure seminiferous tubules were protected well which were 79.9% and 34.2%,
respectively. Tubular diameter decreased slightly in controlled slow freezing and increased in
vitrification. Intact Leydig cell clusters were seen in 70.5% and 28.4%, respectively. Conclusion:
Testicular tissue can be cryopreserved in liquid nitrogen. Controlled slow freezing protected
testicular tissue better than vitrification.
* Key words: Testicular tissue; Cryopreservation; Controlled slow freezing; Vitrification.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, tỷ lệ trẻ trai sống lâu hơn
sau điều trị ung thư tăng cao. Tuy nhiên,
điều trị ung thư có nguy cơ làm giảm hoặc
mất khả năng sinh sản do ảnh hưởng
độc hại của trị liệu lên biểu mô tinh và
quá trình sinh tinh. Đến nay, vẫn chưa có

những liệu pháp cụ thể nào để giúp
những trẻ trai có thể phục hồi chức năng
sinh sản và nội tiết sau điều trị ung thư
[2]. Bảo quản mô tinh hoàn, ứng dụng
nuôi cấy tế bào và ghép lại mô sau bảo
quản là những phương pháp tiềm năng
lớn trong việc bảo tồn khả năng sinh sản
cho nam giới.

* Trường Đại học Y - Dược Thái nguyên
** Trường Đại học Y Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Hiệp Tuyết ()
Ngày nhận bài: 20/05/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/07/2016
Ngày bài báo được đăng: 22/07/2016

36


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
Đông lạnh chậm theo chương trình là
phương pháp được nhiều tác giả nghiên
cứu cho thấy khả năng bảo quản tốt đối
với mảnh mô [3, 4]. Tuy nhiên, phương

pháp này đòi hỏi cần có máy hạ nhiệt,
tiêu tốn nhiều nitơ lỏng và thời gian hạ
nhiệt. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu lại
cho thấy phương pháp đông nhanh thuỷ
tinh hoá mảnh mô cũng thu được kết quả
tốt [3]. Phương pháp đông nhanh giúp tiết
kiệm về trang thiết bị, nitơ lỏng và thời
gian thực hiện quy trình. Tuy nhiên, phương
pháp này cần nồng độ cao chất bảo vệ
lạnh, có khả năng gây độc cho tế bào.
Hiện chưa có nhiều nghiên cứu so sánh
khả năng bảo vệ mô tinh hoàn của hai
phương pháp đông lạnh trên. Chúng tôi
tiến hành nghiên cứu thực nghiệm này
nhằm: Đánh giá khả năng bảo quản lạnh
sâu mô tinh hoàn chuột cống trắng chưa
trưởng thành khi sử dụng phương pháp
hạ nhiệt độ theo chương trình và phương
pháp thuỷ tinh hoá.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng và phân lô nghiên cứu.
75 mẫu mô tinh hoàn của 15 chuột cống
trắng chưa trưởng thành (5 tuần tuổi) chia
thành 3 lô:
- Lô A1 (lô chứng): 25 mẫu tinh hoàn
tươi, không bảo quản lạnh.
- Lô A2: 25 mẫu bảo quản trong nitơ
lỏng, được đông chậm theo chương trình.
- Lô A3: 25 mẫu bảo quản trong nitơ

lỏng, được đông nhanh thủy tinh hóa.

2. Phương pháp và phương tiện
nghiên cứu.
- Phương pháp: nghiên cứu thực nghiệm
mô tả có đối chứng.
- Phương tiện: máy hạ nhiệt độ theo
chương trình Nicool 40PC; kính hiển vi
đa năng Zeiss - Axioplan 2 kết hợp với
camera và máy tính, sử dụng phần mềm
KS400 và thiết bị phục vụ làm tiêu bản
mô học.
3. Quy trình nghiên cứu.
Tinh hoàn chuột được cắt thành các
mảnh nhỏ tại vị trí sát với màng trắng:
kích thước 6 - 8 mm3 với phương pháp
đông chậm và với nhóm chứng; kích thước
3 - 4 mm3 với phương pháp đông nhanh
(tham khảo theo Baert Y, 2013) [3].
- Quy trình bảo quản lạnh mô tinh hoàn
sử dụng phương pháp đông chậm theo
chương trình và rã đông.
Mẫu mô được bảo quản và rã đông tham
khảo theo quy trình của Wyns C (2008) [3].
Các mẫu mô sau khi rửa trong HBSS, đưa
vào ống cryovial 1,8 ml (5 mẫu/ống), có
chứa 1,5 ml dung dịch chất bảo quản lạnh
(4oC) gồm: 0,7 M DMSO; 0,1 M sucrose và
10% FBS pha trong dung dịch HBSS.
Sử dụng máy Nicool 40 PC để hạ nhiệt:

để mẫu ở 4oC trong 30 phút, sau đó hạ
với tốc độ 1oC/phút đến 0oC, để trong 5 phút;
tiếp tục hạ với tốc độ -0,5oC/phút đến -8oC,
để trong 15 phút, thực hiện bước tạo tinh
thể đá nhân tạo (seeding); sau đó hạ nhiệt
với tốc độ -0,5oC/phút đến -40oC, để trong
10 phút; tiếp tục hạ nhiệt với tốc độ -7oC/phút
đến -70oC; khi mẫu đạt -70oC, chuyển mẫu
vào nitơ lỏng.
37


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
Sau 4 tuần bảo quản trong nitơ lỏng,
thực hiện rã đông theo các bước: để ống
bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
Sau đó ngâm vào cốc nước ấm 37oC cho
đến khi băng tan hết (2 phút). Cuối cùng,
rửa mẫu 3 lần qua các nồng độ sucrose
giảm dần (0,1 M; 0,05 M; 0 M) pha trong
HBSS lạnh, mỗi lần 5 phút.
- Quy trình bảo quản lạnh mô tinh hoàn
theo phương pháp thủy tinh hóa và rã đông:
Mẫu mô tinh hoàn chuột được bảo quản
và rã đông, tham khảo theo quy trình của
Baert Y (2012) [2]. Với quy trình đông lạnh,
đầu tiên các mẫu mô được ngâm trong
dung dịch DMEM có pha 1,05 M DMSO
và 1,35 M EG trong 10 phút. Sau đó ngâm
trong dung dịch DMEM có pha 2,1 M

DMSO, 2,7 M EG, 20% FBS và 0,5 M
sucrose trong 5 phút. Cuối cùng, chuyển
mẫu mô sang ống cryovial 1,8 ml đang ở
trong nitơ lỏng.
Các mẫu được rã đông sau bảo quản
4 tuần trong nitơ lỏng. Rã đông theo các
bước: nhỏ trực tiếp dung dịch DMEM pha
0,5 M sucrose và 20% FBS ở nhiệt độ
37oC vào ống chứa mẫu, giữ ống ở nhiệt
độ 37oC trong 2 phút. Tiếp theo, rửa mẫu
trong dung dịch DMEM pha 20% FBS ở
37oC trong 2 phút.
4. Chỉ tiêu nghiên cứu.
- Đánh giá hình thái học OST:
+ Số lượng và đường kính OST được
tổng hợp trên toàn bộ mẫu ở mỗi lô.
+ Đánh giá hình thái cấu trúc OST
(tham khảo của Keros V 2005 [5]: cấu
trúc ít biến đổi, còn nguyên vẹn: 2 điểm;
tổn thương nhẹ < 50%: 1 điểm; tổn thương
nhiều > 50%: 0 điểm. OST đạt 2 hoặc
1 điểm được coi là bảo vệ tốt.
38

+ Đánh giá tế bào của biểu mô tinh:
đánh giá tỷ lệ % OST với từng loại tế bào
có hình thái bình thường, tham khảo theo
phương pháp đánh giá của Milazzo JP
(2008) [6]. Hình thái tế bào bình thường:
nhân tế bào tròn, cân đối, chất nhiễm sắc

phân bố đều, màng nhân mịn. Bào tương
tế bào mịn, tế bào xếp sát nhau. Hình thái
bị tổn thương: nhân tế bào bị đông vón,
bào tương thoái hóa, tế bào tách rời nhau.
- Đánh giá mô kẽ: đánh giá sự tan rã
của mô kẽ. Quan sát các cụm tuyến kẽ,
đếm số lượng cụm và đánh giá có bị tổn
thương hay không dựa vào hình thái của
tế bào Leydig (giống như đánh giá tế bào
biểu mô tinh).
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Hình thái OST của mô tinh hoàn
chuột sau bảo quản lạnh sâu.
Sau bảo quản lạnh sâu, mô tinh hoàn
ở cả 2 lô chuột có nhiều OST vẫn giữ
được cấu trúc gần như bình thường (đạt
2 điểm). Bên cạnh đó, có những OST bị
tổn thương với đặc điểm: tế bào biểu mô
có nhân bị đông vón, bắt màu đậm; bào
tương thoái hóa, trong biểu mô tinh xuất
hiện các khoảng trống. Ở phương pháp
đông chậm theo chương trình: các tế bào
thoái hóa bong khỏi màng đáy và có xu
hướng co cụm lại. Với phương pháp
đông nhanh: tế bào thoái hóa trương to,
rời rạc mất liên kết, OST giãn rộng, xuất
hiện khoảng trống rộng ở vị trí lòng ống
tương lai. Các dạng tổn thương có thể ở
mức độ nhẹ (1 điểm) đến mức độ nặng
(0 điểm) (hình 1, 2, 3).

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016

2
2
1
1

1

A1

2

A3

A2

Hình 1: OST chuột chưa trưởng thành trước (A1) và sau bảo quản lạnh sâu đạt 2 điểm
(H&E x 400): A1. Trước bảo quản; A2. Sau bảo quản đông chậm;
A3. Sau bảo quản thuỷ tinh hoá; 1. OST; 2. Mô kẽ.
2

2

1

1

A3

A2

Hình 2: OST chuột chưa trưởng thành sau bảo quản lạnh sâu đạt 1 điểm
(H&E x 400): 1. OST; 2. Mô kẽ.

2
1
1
2
A2

A3

Hình 3: OST chuột chưa trưởng thành sau bảo quản lạnh sâu đạt 0 điểm
(H&E x 400): 1. OST; 2. Mô kẽ.
39


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
Bảng 1: Chất lượng OST mô tinh hoàn chuột trước và sau bảo quản lạnh sâu.
Lô nghiên cứu

2 điểm

1 điểm

0 điểm

2 điểm + 1 điểm

p

Lô A1

91,3%

6,2%

2,5%

97,5%

Lô A2

23,4%

56,5%

20,1%

79,9%

p(A1-A2) < 0,05
p(A1-A3) < 0,05
p(A2-A3) < 0,05

Lô A3

2,5%

31,7%

65,8%

34,2%

Mô tinh hoàn trước bảo quản (tươi) có tỷ lệ nhỏ số OST bị biến đổi cấu trúc ít hoặc
nhiều (loại 1 và 0 điểm). Tuy nhiên, sau bảo quản lạnh sâu, tỷ lệ này tăng khác biệt so
với trước bảo quản ở cả nhóm.
Bảng 2: Tỷ lệ OST từng loại tế bào có hình thái bình thường của mô tinh hoàn chuột
trước và sau bảo quản lạnh sâu.
Tỷ lệ OST từng tế bào có
hình thái bình thường

Tế bào
Sertoli

Tinh
nguyên bào

Tinh bào

Tổng số OST
khảo sát

Lô A1

95,7%

95,4%

97,1%

678

Lô A2

71,1%

63,9%

55,9%

696

Lô A3

25,8%

21,3%

7,6%

445

Lô nghiên cứu

p(A2-A1) < 0,05

p

p(A3-A1) < 0,05
p(A2-A3) < 0,05

Ở hai lô thực nghiệm, các tế bào đều bị tổn thương nhiều so với không bảo quản.
Phương pháp đông nhanh cho thấy tế bào bị tổn thương nhiều, trong đó tinh nguyên
bào bị tổn thương nhiều nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Bảng 3: So sánh đường kính OST trước và sau bảo quản lạnh sâu.
Lô

Tổng số OST

Lô A1

678

135,76 ± 22,72

p (A1-A2) < 0,05

Lô A2

696

132,97 ± 18,50

p (A1-A3) < 0,05

Lô A3

445

146,03 ± 21,04

Đường kính OST (µm)

± SD

p

p (A2-A3) < 0,05

Sau bảo quản lạnh, đường kính OST của lô theo phương pháp đông chậm giảm
nhẹ hơn so với lô chứng; ở lô đông nhanh, kích thước tăng lên so với lô chứng, khác
biệt có ý nghĩa thống kê.
* Đặc điểm mô kẽ:
Ở mô tinh hoàn tươi, mô kẽ nằm xen giữa các OST và giữa chúng không có khoảng
trống. Trong mô kẽ có các tuyến kẽ, tạo bởi một số tế bào kẽ (tế bào Leydig) nằm cạnh
mao mạch. Sau bảo quản lạnh sâu, một số nơi mô kẽ có hiện tượng bị tan rã: các OST
40


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
không còn nằm sát với nhau và có những cụm tuyến kẽ nằm tách rời khỏi OST (hình 4).
Tỷ lệ cụm tuyến không bị tổn thương ở mô tinh hoàn bảo quản bằng phương pháp
đông chậm theo chương trình 70,5%, phương pháp thủy tinh hóa: 28,4%.

2
2

1

1

A3

A2

Hình 4: Hình ảnh mô tinh hoàn chuột chưa trưởng thành sau bảo quản lạnh sâu ở
lô A2 và lô A3 (H&E x 150). 1. OST; 2. Tuyến kẽ.
Bảng 4: Đặc điểm hình thái tuyến kẽ mô tinh hoàn chuột sau bảo quản lạnh sâu.
Đặc điểm

Không tổn thương

Tổn thương

Tổng số cụm tuyến

Lô A2

70,5%

29,5%

413

Lô A3

28,4%

71,6%

261

Lô nghiên cứu

p

p(A2-A3) < 0,05

Phương pháp đông chậm theo chương trình tuyến kẽ được bảo vệ tốt hơn về mặt
hình thái so với phương pháp thủy tinh hóa.
BÀN LUẬN
Sau bảo quản lạnh sâu, những hình
ảnh tổn thương OST thường thấy là: vỏ
xơ và màng đáy bong khỏi biểu mô tinh;
các tế bào tổn thương thoái hóa mất liên
kết, nhân tế bào tròn nhỏ, bắt màu đậm
hơn so bình thường; biểu mô hình thành
khoảng trống nhỏ ở giữa các tế bào. Đây
là tác động không mong muốn của việc
bảo quản lạnh. Tuy nhiên, trong nghiên
cứu này, sau bảo quản lạnh sử dụng
phương pháp đông chậm theo chương

trình, phần lớn OST được bảo vệ tốt: mô
tinh hoàn chuột chưa trưởng thành có tỷ
lệ OST được bảo vệ tốt (2 điểm và 1 điểm)
đạt 79,9%. Rõ ràng, chỉ những OST được

bảo vệ tốt mới có thể đảm bảo chức năng
sau này. Nghiên cứu của chúng tôi cho
thấy mô tinh hoàn chuột được bảo vệ khá
tốt khi đông lạnh chậm theo chương trình.
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của
một số tác giả khác [1, 3, 5]. Nhận định về
tác động của phương pháp thủy tinh hóa
lên mô tinh hoàn chuột chưa trưởng thành
cho thấy phương pháp này ảnh hưởng nặng
41


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
lên cấu trúc OST. Các tổn thương ở biểu
mô tinh là: tế bào trương to, méo mó,
nhân đông vón, khoảng gian bào giãn
rộng, ranh giới giữa các tế bào rõ, xuất
hiện khoảng trống rộng ở vị trí lòng ống
trong tương lai. Kết quả: tỷ lệ OST được
bảo vệ tốt 34,2%, kết quả này thấp hơn
nhiều so với nghiên cứu của Baert (2012)
[2].
Chúng tôi thấy trong các loại tế bào
biểu mô tinh, tinh bào là tế bào bị tổn
thương nhiều nhất. Tinh bào là tế bào có
kích thước lớn (25 µm), bào tương chứa
nhiều bào quan, tích lũy nhiều chất dinh
dưỡng và đang trong giai đoạn giảm
phân, vì thế tinh bào bị tổn thương nhiều
hơn so với tế bào khác do tác động của

quá trình đông lạnh sâu.
Ở mô tinh hoàn chuột chưa trưởng
thành, OST được liên kết khá chặt chẽ
với nhau. Vì vậy, khả năng thẩm thấu của
chất bảo vệ vào tế bào biểu mô tinh sẽ
khó khăn hơn, nhất là những ống nằm ở
vị trí trung tâm của mảnh mô. Đặc biệt, ở
phương pháp đông nhanh, thời gian tiếp
xúc của mảnh mô với chất bảo vệ ngắn
hơn so với với phương pháp đông chậm.
Lòng OST của tinh hoàn chuột chưa
trưởng thành trong nghiên cứu này chưa
xuất hiện. Biểu mô tinh của tinh hoàn
chuột chưa trưởng thành chỉ bao gồm tế
bào Sertoli, tinh nguyên bào và tinh bào.
Trong đó, tinh bào chiếm số lượng lớn và
dễ bị tổn thương nhất. Do vậy, kết quả
thu được thấp khi bảo quản theo phương
pháp đông nhanh.
Đường kính OST ở phương pháp đông
chậm theo chương trình giảm nhẹ so với
ở lô chứng [7]. Đường kính giảm phù hợp
42

với sự biến đổi hình thái OST, đặc biệt
những ống tổn thương nặng (0 điểm):
nhân tế bào đông vón, bào tương tế bào
ly giải, tế bào co cụm, tách rời khỏi màng
đáy; bên cạnh đó tỷ lệ ống 0 điểm không
nhiều (20,1%). Vì vậy, đường kính OST

giảm ở hai lô sau bảo quản đông chậm là
không nhiều. Đối với phương pháp thủy
tinh hóa, đường kính OST tăng hơn so
với lô chứng [8]. Chúng tôi nhận thấy,
đường kính OST tăng phụ thuộc vào tỷ lệ
OST bị tổn thương nặng (0 điểm) chiếm
số lượng nhiều (65,8%).
Cùng với việc bảo tồn chức năng sinh
sản, duy trì nội tiết cũng là mối quan tâm
của các nhà nghiên cứu [3, 5, 7, 9]. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi chỉ thực hiện
đánh giá chất lượng tuyến kẽ dựa vào
đặc điểm hình thái của tế bào Leydig, độ
tập trung của tế bào quanh mạch máu.
Kết quả cho thấy, về mặt hình thái, sau
bảo quản lạnh sâu, tuyến kẽ được bảo vệ
khá tốt ở phương pháp đông chậm. Đây
là nghiên cứu bước đầu về bảo quản mô
tinh hoàn, nên chúng tôi chỉ dừng lại ở
mặt đánh giá hình thái. Chúng tôi định sẽ
nghiên cứu tiếp để đánh giá chức năng
nội tiết của tế bào Leydig sau bảo quản.
KẾT LUẬN
- Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy:
mô tinh hoàn chuột cống trắng chưa trưởng
thành có thể được bảo quản tốt trong nitơ
lỏng.
- Tỷ lệ OST được bảo vệ tốt ở phương
pháp đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh
thuỷ tinh hoá lần lượt là 79,9% và 34,2%.

Đường kính OST giảm nhẹ ở phương pháp
đông chậm và tăng lên ở phương pháp


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016
thuỷ tinh hóa. Tuyến kẽ không bị tổn thương
sau bảo quản ở 2 lô thực nghiệm lần lượt
là 70,5% và 28,4%.
- Phương pháp đông lạnh chậm theo
chương trình có xu hướng tốt hơn trong
bảo quản lạnh sâu mô tinh hoàn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Thị Thu Hiền. Nghiên cứu trữ lạnh
tinh trùng từ mào tinh và mô tinh hoàn để hỗ
trợ sinh sản. Luận văn Thạc sĩ Y học. Học
viện Quân Y. Hà Nội. 2011.
2. Baert Y, Ellen Goossens, Dorien Van
Saen et al. Orthotopic grafting of cryopreserved
prepubertal testicular tissue: in search of a
simple yet effective cryopreservation protocol,
Fertility and Sterility. 2012, 97 (5), pp.1152-1157.
3. Baert Y, Van Saen D, Haentjens P et al.
What is the best cryopreservation protocol for
human testicular tissue banking?. Hum Reprod.
2013, 28 (7), pp.1816-1826.
4. Wyns C, Van Langendonckt A, Wese FX
et al. Long-term spermatogonial survival in
cryopreserved and xenografted immature

human testicular tissue. Hum Reprod. 2008,

23 (11), pp.2402-2414.
5. Keros V, Rosenlund B, Hultenby K et al.
Optimizing cryopreservation of human
testicular tissue-comparison of protocols with
glycerol, propanediol and dimethyl sulphoxide
as cryoprotectants. Hum Reprod. 2005, 20,
pp.1676-1687.
6. Milazzo JP, Vaudreuil L, Cauliez B et al.
Comparison of conditions for cryopreservation
of testicular tissue from immature mice. Hum
Reprod. 2008, 23, pp.17-28.
7. Kvist K, Thorup J, Byskov AG et al.
Cryopreservation of intact testicular tissue
from boys with cryptorchidism. Hum Reprod.
2006, 21, pp.484-491.
8. Mara C, Magali V, Christiani AA et al.
Cryopreservation of prepubertal mouse testicular
tissue by vitrification. Fertility and Sterility.
2011, 95 (4), pp.1229-1234.
9. Cengiz Y, Brendan M, Keith J et al.
Effect of different cryoprotectant agents on
spermatogenesis efficiency in cryopreserved
and grafted neonatal mouse testicular tissue
Cryobiology. 2013, 67 (1), pp.70-75.

43