Phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị bằng kỹ thuật giải trình tự

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015

Nghiên cứu Y học

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA HBV TRÊN BỆNH NHÂN
NHIỄM HBV MẠN TÍNH CHƯA ĐIỀU TRỊ BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ
Nguyễn Thị Hải Yến*, Nguyễn Thanh Bảo**, Cao Minh Nga**

TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Các thuốc tương tự nucleos(t)ide là một trong 2 nhóm thuốc được sử dụng điều trị bệnh viêm
gan B mạn tính hiện nay (nhóm còn lại là Interferon), có tác dụng ức chế quá trình nhân lên của virus. Tuy
nhiên, khi sử dụng với thời gian kéo dài, dưới áp lực chọn lọc của thuốc dễ làm phát sinh những đột biến kháng
thuốc trên virus. Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về đột biến kháng thuốc trên người nhiễm HBV mạn
tính chưa điều trị.
Mục tiêu: Xác định đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị.
Phương pháp: Tiền cứu, mô tả cắt ngang. Từ tháng 1/2013 đến tháng 9/2014 tiến hành thu thập mẫu
huyết thanh từ bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị tại một số phòng khám chuyên khoa gan mật, tiêu
hóa tại TP Cần Thơ. Thực hiện các xét nghiệm HBeAg bằng kỹ thuật ELISA, định lượng HBV DNA bằng kỹ
thuật Realtime PCR. Các mẫu huyết thanh có kết quả định định lượng HBV DNA > 103 copies/ml được giải
trình tự xác định đột biến kháng thuốc.
Kết quả: Có 362 mẫu huyết thanh có tải lượng HBV DNA > 104 copies/ml được giải trình tự tìm đột biến
kháng thuốc. Không phát hiện được các đột biến có liên quan đến kháng các thuốc tương tự nucleos(t)ide. Có 29
mẫu có đột biến V207M ( 8% ). Số mẫu huyết thanh có HBeAg (+) là 196 mẫu (54,1%). Có 238 mẫu huyết
thanh (65,7 %) có tải lượng HBV DNA trong huyết thanh ≥ 105 copies/ml . Tỉ lệ đột biến rtV207M ở nhóm có
tải lượng HBV DNA trong huyết thanh ≥ 105 copies/ml cao hơn ở nhóm có tải lượng HBV DNA trong huyết
thanh < 105 copies/ml có ý nghĩa thống kê. Không ghi nhân mối liên quan giữa đột biến rtM207V với các yếu tố
tuổi, giới tính và tình trạng HBeAg.
Kết luận: Không phát hiện được các đột biến có liên quan đến kháng các thuốc tương tự nucleos(t)de. Tỉ lệ
đột biến rtV207M là 8%. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự phân bố của đột biến này ở 2 nhóm HBV
DNA < 105 copies/ml và ≥ 105 copies/ml.
Từ khóa: viêm gan B, đồng phân nucleos(t)ide, đột biến kháng thuốc, nhiễm HBV mạn tính, bệnh nhân

chưa điều trị.
ABSTRACT
DETECTION OF ANTIVIRAL DRUGS RESISTANTS MUTANTS OF HEPATITIS B VIRUS AMONG
TREATMENT NAÏVE CHRONIC HEPATIS B VIRUS INFECTED PATIENTS BY SEQUENSING
Nguyen Thi Hai Yen, Nguyen Thanh Bao, Cao Minh Nga
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - Supplement of No 1 - 2015: 365 - 368
Background: Nucleot(s)ide analogs group is one of two kinds of antiviral drug for treating Hepatitis B (the
other one is Interferon), which inhibits effectively the replication of virus. However, when long term using, it is
easily to emerge drug resistant mutants in virus. There have not been many studies in drug resistant mutants of
HBV among treatment naïve chronic hepatitis B virus infected patients.
Objectives: To determine the rates of drug resistant mutants in treatment naïve chronic hepatitis B virus
* Khoa Y, Đại học Cần Thơ
** Bộ môn Vi sinh, Khoa Y - Đại học Y Dược TP. HCM
Tác giả liên lạc: ThS. BS. Nguyễn Thị Hải Yến
ĐT: 0908600366
Email:

Nhiễm

365


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015

infected patients.
Methods: Retrospective, cross-sectional description method. Sera of chronic hepatitis B virus infected
patients were collected at some hepatobiliary and gastrointestinal clinics in CanTho city from January 2013 to
December 2014. HBeAg tests were done. HBV DNA quantitating were taken by Realtime PCR method. Samples

with over 103 HBV DNA copies/ml sera were detected drug resistant mutants by sequencing.
Results: 362 samples with over 103 HBV DNA copies/ml sera of treatment naïve chronic hepatitis B virus
infected patients were available for resistant mutants detecting. No resistant mutant was detected in these
samples. 29 samples (8%) with rtV207M mutant was detedcted. There were 196 samples (54.1%) with HBeAg
positive.There were 238 samples (65.7%) with 103 HBV DNA copies/ml viral load . There was a significant
association between the ratio of rtV207M mutant and viral loading. No relationship was seen between rtV297M
mutant and gender or HBeAg status.
Conclusion: No resistant mutant was detected in these samples. The mutant of rtV207M was 8%. There
was a significant association between the ratio of rtV207M mutant and viral loading
Keywords: Hepatitis B (HBV), nucleos(t)ide analogs, drugs-resistant mutation, chronic HBV infection,
treatment naïve patient.
gan mật, tiêu hóa tại TP Cần Thơ từ tháng 1/2013
ĐẶT VẤN ĐỀ
đến tháng 9/2014.
Viêm gan B (HBV) đang là một vấn đề sức
Phương pháp nghiên cứu
khỏe được quan tâm trên toàn thế giới không
Bệnh nhân được chọn vào mẫu nghiên cứu
những vì tỉ lệ người nhiễm bệnh cao mà còn do
được lấy huyết thanh làm xét nghiệm HBeAg
những biến chứng nguy hiểm của bệnh như xơ
bằng kỹ thuật ELISA tại bệnh viện Trường Đại
gan và ung thư tế bào gan. Hiện nay có 2 nhóm
học Y Dược Cần Thơ. Sau đó, các mẫu này được
thuốc được sử dụng trong điều trị HBV. Đó là các
tiến hành định lượng HBV DNA bằng kỹ thuật
thuốc tương tự nucleos(t)de và các Intreferon.
Realtime PCR phòng xét nghiệm Vi sinh Trường
Nhóm thuốc tương tự nucleos(t)de có tác dụng ức
Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh. Những mẫu có

chế quá trình nhân lên của virus, ít tác dụng phụ
tải lượng virus > 103 copies/ml được tiến hành giải
và được sử dụng chủ yếu trong điều trị HBV. Tuy
trình tự trên đoạn gen P của HBV để phát hiện đột
nhiên, khi sử dụng với thời gian kéo dài, dưới áp
biến kháng thuốc(9). Kỹ thuật giải trình tự được
lực chọn lọc của thuốc dễ làm phát sinh những đột
thực hiện tại viện Pasteur TP Hồ Chí Minh.
biến kháng thuốc trên virus, làm giảm hiệu quả
điều trị. Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về
đột biến kháng thuốc của HBV trong và sau khi
điều trị(1,6,7,8). Riêng đối với người nhiễm HBV mạn
tính chưa điều trị, tại Việt Nam chưa có nhiều
nghiên cứu về đột biến kháng thuốc.

Biến số nghiên cứu: giới, tuổi, tải lượng DNA
HBV trong huyết thanh.

ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thiết kế nghiên cứu

Trong thời gian từ tháng 1/2013 đến tháng
9/2014, chúng tôi thu thập được 362 mẫu huyết
thanh của bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa
điều trị, có tải lượng HBV DNA > 103 copies/ml để
thực hiện kỹ thuật giải trình tự phát hiện đột biến
kháng thuốc.

Tiền cứu, mô tả cắt ngang.

Đối tượng nghiên cứu
Người nhiễm HBV có HBsAg(+) trên 6 tháng
đến khám tại một số phòng khám chuyên khoa

366

Nhập và phân tích số liệu bằng phần mền
SPSS 18.0, dùng phép kiểm χ2 để so sánh các tỉ lệ
với mức có ý nghĩa thống kê p<0,05.

Chuyên Đề Nội Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015
Đặc điểm mẫu nghiên cứu
Trong số 362 bệnh nhân được lấy huyết thanh
được tiến hành giải trình tự, có211 bệnh nhân
nam (58,3%) và 151 bệnh nhân nữ (41,7%). 196
mẫu huyết thanh có HBeAg (+) (54,1%).

Đột biến phát hiện được
Chúng tôi không phát hiện được những đột
biến của HBV trên đoạn gen được giải trình tự đã
được biết có liên quan đến sự đề kháng với các
thuốc tương tự nucleos(t)de. Tuy nhiên có 29 mẫu
(8%) xuất hiện đột biến rtV207M. Đây là đột biến
cho đến nay được cho là không liên quan đến

kháng thuốc. Trong nghiên cứu của tác giả M.H
Nguyen và cs trên đối tượng viêm gan B mạn
tính chưa điều trị cũng ghi nhận sự hiễn điện của
đột biến này với tỉ lệ 16,7%(5). Tác giả R. Salpini và
cs cũng tìm thấy đột biến rtV207L/ M với tỉ lệ
0,7% trên bệnh nhân chưa điều trị. Đây là một
trong những đột biến đang được xem xét liệu có
giữ vai trò đối với kháng thuốc của HBV(10).
Đột biến kháng thuốc ở bệnh nhân chưa điều
trị có tỉ lệ thấp, ngay cả đối với những thuốc đã
được sử dụng rộng rãi trong thời gian qua như
Lamivudin(2,3,4).
Tác giả Nguyễn Hùng Cường nghiên cứu trên
đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại dâm tại
Hải Phòng ghi nhận có 3,84% đột biến kháng
Lamivudine, không thấy đột biến kháng Tenofovir
và Entercavir(2). Đặng Mai anh Tuấn nghiên cứu
trên những bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại
bệnh viện Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh ghi nhận tỉ lệ
đột biến kháng thuốc là 9,28%(1). Tuy nhiên trong
nghiên cứu này không phân biệt bệnh nhân đã
điều trị và chưa điều trị. Các nghiên cứ trên đối
tượng bệnh nhân viêm gan B đã điều trị cao hơn
nhiều so với bệnh nhân chưa điều trị(7,8).

Sự phân bố đột biến rtV207M theo giới tính

trên 2 nhóm nam và nữ không có khác biệt có ý
nghĩa thống kê (p=0,108)

Sự phân bố đột biến rtV207M theo tải lượng
HBV DNA trong huyết thanh
Bảng 2: Sự phân bố đột biến rtV207M theo tải lượng
HBV DNA trong huyết thanh (n=362)
HBV DNA (copies/ml)
5
< 10 (n=124)
5
≥ 10 (n=238)

Có đột biến
21
8

Không đột biến
190
143

Có 21 bệnh nhân nam và 8 bệnh nhân nữ có
đột biến rtV207M. Sự phân bố đột biến rtV207M

Nhiễm

Có đột biến
5
24

Không đột biến
119
214

Trong 124 mẫu huyết thanh có tải lượng virus
< 105 copies/ml có 5 mẫu mang đột biến rtV207M.
Trong 238 mẫu huyết thanh có tải lượng virus ≥
105 có 5 mẫu mang đột biến rtV207M. Có mối liên
quan giữa đột biến rtV207M và tải lượng virus
trong máu (p=0,044).

Sự phân bố đột biến rtV207M theo kháng
nguyên HBeAg
Bảng 3: Sự phân bố đột biến rtV207M theo kháng
nguyên HBeAg (n=362)
HBeAg
Có đột biến
Dương tính (n=196)
20
Âm tính (n=166)
9

Không đột biến
176
157

Trong 176 mẫu huyết thanh có HBeAg (+), có
20 mẫu có đột biến rtV207M và trong 157 mẫu
huyết thanh có HBeAg (-) có 9 mẫu có đột biến
rtV207M. Sự phân bố đột biến này trên 2 nhóm
HBeAg(+) và HBeAg (-) không có khác biệt có ý
nghĩa thống kê (p=0,095).

KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi không phát
hiện được các đột biến liên quan đến kháng thuốc.
Đột biến rtV207M xuất hiện ở 29 mẫu chiếm tỉ lệ
8%. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự
phân bố của đột biến này ở 2 nhóm HBV DNA <
105 copies/ml và ≥ 105 copies/ml.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Bảng 1: Sự phân bố đột biến theo giới tính
Giới tính
Nam (n=211)
Nữ (n=151)

Nghiên cứu Y học

2.

Đặng Mai Anh Tuấn, Võ Đức Xuyên An, Phạm Hùng Vân
(2010). Tìm hiểu đột biến kháng Adefovir và lamivudine trên
HBV tách chiết từ huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mãn
tính. Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh. Tập 14. Phụ bản số 2. Tr.:
287-293.
Ma J, Zhang Y, Chen X, Jin Y, Chen D, Wu Y, Cui J, Wang H,
L Jiu, Li N, Gao F (2013). “Association of Preexisting DrugResistance Mutationsand Treatment Failure in Hepatitis B
Patients”. PLoS ONE.8(7): e67606.

367

Nghiên cứu Y học
3.

4.

5.

6.

7.

8.

368

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 1 * 2015

Margeridon-Thermet S, Shulman NS, Ahmed A, Shahriar R,
Liu T, Wang C, Holmes SP, Babrzadeh F, Gharizadeh B,
Hanczaruk B, Simen BB, Egholm M, Shafer RW (2009). “UltraDeep Pyrosequencing of Hepatitis B Virus Quasispeciesfrom
Nucleoside and Nucleotide Reverse-Transcriptase Inhibitor
(NRTI) – Treated Patients and NRTI - Naïve Patients. J Infect
Dis. May 1; 199(9): 1275–85.
Mirandola S, Campagnolo D, Bortoletto G, et al (2011).
“Large-scale survey of naturally occurring HBV
polymerasemutations associated with anti-HBV drug
resistancein untreated patients with chronic hepatitis B”.
Journal of Viral Hepatitis. 18:e212–e216.

Nguyen MH, Garcia RT, Trinh HN, Nguyen HA, Nguyen
KK, Nguyen LH & Levitt B (2009). Prevalence of hepatitis B
virus DNA polymerase mutations intreatment-naïve patients
with chronic hepatitis. Aliment Pharmacol Ther; 30: pp. 1150–8.
Nguyễn Hùng Cường, Nguyễn Bảo Trân, Hoàng Thị
Thanh Huyền, Azumi Ishizaki, Hiroshi Ichimura, Phạm
Văn thức (2013). “Nghiên cứu tỉ lệ đột biến gen kháng
thuốc của HBV ở đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại
dâm ở Hải Phòng”. Tạp chí Y-Dược học quân sự. số 6:57-63.
Nguyễn Thị Nhã Đoan, Bùi Hữu Hoàng, Phạm Hùng Vân
(2011). “Đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân viêm gan virus B
mạn đang điều trị bằng các thuốc tương tự nucleos(t)ide”. Tạp
chí Y học TP. Hồ Chí Minh. Tập 15. Phụ bản số 2. Tr.110-116.
Nguyễn Sử Minh Tuyết, Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thanh
Bảo, Cao Minh Nga (2010). “Phát hiện đột biến rtL180M và

9.

10.

rtM204V/I kháng Lamivudine ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn
tính bằng kỹ thuật Real-time PCR”. Tạp chí Y học TP. Hồ Chí
Minh. Tập 14. Phụ bản số 1. Tr.509-512.
Rybicka M, Stalke P, Dreczewski M, Smiatacz T, Bielawski
KP. (2014). “High-Through put Matrix-Assisted Laser
Desorption Ionization–Timeof Flight Mass Spectrometry as an
Alternative Approach to Monitoring Drug Resistance of
Hepatitis B Virus.”. Journal of Clinical Microbiology. January ;
52(1): pp. 9 –14.
Salpini R, Svicher V, Cento V, Gori C, Bertoli A, Scopelliti F,

Micheli V, Cappiello T, Spanò A, Rizzardini G, De Sanctis
GM, Sarrecchia C, Angelico M, Perno CF. (2011).
“Characterization of drug-resistance mutations in HBV Dgenotype chronically infected patients, naïve to antiviral
drugs”. Antiviral Research. 92:382–5.

Ngày nhận bài báo:

27/10/2014

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

30/10/2014

Ngày bài báo được đăng:

10/01/2015

Chuyên Đề Nội Khoa