Ức chế sự sinh trưởng và sự chết tế bào theo chương trình bởi kaempferol được điều hòa bởi sự hoạt hóa của mek - mapk ở tế bào ung thư phổi

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004

10 ỨC CHẾ SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SỰ CHẾT TẾ BÀO
THEO CHƯƠNG TRÌNH BỞI KAEMPFEROL ĐƯC ĐIỀU HÒA
BỞI SỰ HOẠT HÓA CỦA MEK-MAPK Ở TẾ BÀO UNG THƯ PHỔI A549
Nguyễn Thò Thanh Tuyền* ; Huỳnh Hùng*

TÓM TẮT
Một số lượng lớn các chất khác nhau có trong thiên nhiên cho thấy có tính đề kháng ở ung thư thực nghiệm
và nhiều bằng chứng gợi ý Kaempferol có những đặc tính ngăn ngừa hóa trò của ung thư. Tuy nhiên, các cơ
chế bảo vệ chính xác thì vẫn còn được hiểu một cách nghèo nàn. Để làm sáng tỏ các cơ chế này,chúng tôi đã
thử nghiệm tế bào ung thư phổi ở người -A549 với Kaempferol và nghiên cứu những ảnh hưởng của nó trên
những biểu đồ về sự tăng trưởng và sự dẫn truyền tín hiệu. Điều trò các tế bào A549 với Kaempferol cho kết
quả ức chế khả năng sống của tế bào va sự tổng hợp DNA phụ thuộc vào thời gian và liều lượng thuốc. Cùng
lúc đó, điều trò Kaempferol cũng làm tăng hàm lượng của những protein pro-apoptosis (Bax va Bad) và làm
giảm hàm lượng của những protein anti- apoptosis (Bcl-xL va Bcl-2). Trong khi Akt và phospho hóa Akt bò ức
chế thì MAPK lại được hoạt hóa.Sự chết tế bào do Kaempferol được kết hợp với sự tách ra (cleavage) của
Caspase-7 và PARP.Sự ức chế MEK1/2 nhưng không phải PI-3K đã ngăn chặn Kaempferol gây hoạt hóa
cleave Capsae-7, PARP và sự chết của tế bào.Những kết quả trên cho thấy rằng sự bất hoạt của Akt và sự thay
đổi các protein của gia đình Bcl-2 không đủ để Kaempferol gây ra sự chết tế bào mà sự hoạt hóa của MEKMAPK là điều kiện tất yếu để Kaempferol gây ra cơ chế chết ở tế bào A549.

ABSTRACT
KAEMPFEROL-INDUCED GROWTH INHIBITION AND APOPTOSIS IN A549 LUNG
CANCER CELLS IS MEDIATED BY ACTIVATION OF MEK-MAPK.
Nguyen Thi Thanh Tuyen, Huynh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 8 * Supplement of No 1 *
2004: 72 – 80.

A vast variety of naturally occurring substances have been shown to protect against experimental
carcinogenesis and an increasing amount of evidence suggests that kaempferol may have cancer

chemopreventative properties. However, the precise underlying protective mechanisms are poorly understood.
To elucidate these mechanisms, we challenged human lung cancer cell line A549 with kaempferol and
investigated its effects upon cellular growth and signal transduction pathways. Treatment of A549 cells with
kaempferol resulted in a dose- and time-dependent reduction in cell viability and DNA synthesis with the rate
of apoptosis equivalent to 0.9 ± 0.5, 5.2± 1.5, 16.8± 2.0, 25.4± 2.6, and 37.8 ± 4.5 % on treatment with 0, 17.5,
35.0, 52.5 and 70.0 μM kaempferol, respectively. Concomitantly, kaempferol treatments led to a 1.2-, 2.7-, 3.3and 3.4-fold increase in Bax. Similar elevations were also observed in Bad which increased 1.2-, 3.3-, 3.7- and
4.7-fold respectively as compared to control. Bcl-2 and Bcl-xL expression were inhibited in a dose-dependent
fashion. While the Akt-1 and phosphorylated Akt-1 were inhibited, the mitogen-activated protein kinase
(MAPK) was activated upon kaempferol treatment. Activation of MAPK and c-Jun was peaked at 6 h and
MAPK activity was sustained over 96 h. In addition, MEK1/2 phosphorylation was observed in concordance
with MAPK activation. Kaempferol induced apoptosis was associated with the cleavage of caspase-7 and PARP
* Laboratory of Molecular Endocrinology-National Cancer center of Singapore

72

Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004

Nghiên cứu Y học

(poly ADP-ribose polymerase). Inhibition of MEK1/2 but not PI-3 kinase blocked kaempferol-induced cleavage
of caspase-7, PARP cleavage, and apoptosis. The results suggest that inactivation of Akt-1 and alteration of Bcl2 family of proteins are not sufficient for kaempferol to induce apoptosis and activation of MEK-MAPK is a
requirement for kaempferol-induced cell death machinery in A549 cells.
Montesano et al., 1999). Các nghiên cứu với các ức
MỞ ĐẦU
chế phân tử nhỏ hoạt động của MEK (Dudley et al.,
Ung thư phổi là một trong các ung thư thông
1995; Favata et al., 1998) đã chứng minh vai trò của

thường nhất trên thế giới và ước tính khoảng 28% so
MEK trong việc điều hòa biểu hiện của các proteinase
với tổng số tử vong do ung thư gây ra.Khoảng 75%
trong sự xâm lấn và di căn của tế bào ung thư (Reddy
ung thư phổi là ung thư tề bào phổi không nhỏ
et al., 1999; Liu et al., 2000) và sự gián đoạn hình
(NSCLC-non-small cell lung cancer) và phần còn lại
thái học của lớp biểu mô (Lu et al., 1998; Chen et al.,
là tế bào ung thư phổi nhỏ (SCLC-small cell lung
2000). Không có các chất dưới dòng của MEK nào
cancer) (Midthun va Jett, 1997). Hiệu quả điều trò của
được xác đònh khác hơn ngoài p44/42 MAPK
ung thư phổi vẫn còn nghèo nàn. Trung bình tỉ lệ
(reviewed in Anderson et al.,1990). Điều trò các tế
sống 5 năm đối với ung thư phổi khu trú là 48% và di
bào với các yếu tố tăng trưởng hoặc tác nhân hóa trò
căn là 2.5% (Feng et al., 2001). Tỉ lệ sống 5 năm của
liệu khác nhau gây ra sự hoạt hóa của MEK1/2 và các
bệnh nhân ung thư phổi ở giai đoạn I với phẫu thuật
mục tiêu dưới dòng của nó. MAPK điều hòa sự tăng
cắt bỏ từng phần có thể đạt tới 60% (Feng et al.,
sinh,biệt hóa và sự sống của tế bào (reviewed in
2001). Đa số bệnh nhân bò ung thư phổi là bệnh
Bllaif và Blenis, 2001). Sự hoạt hóa của MAPK điều
không thể mổ được và có tiên lượng rất xấu. Chỉ có
hòa hoạt động của một số chất dưới dòng (substrates)
15% bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn sớm và
bao gồm nhân tố phiên mã (Transcription factor)
khu trú bởi vì phần lớn ung thư phổi bắt đầu tăng
p62TCF (ELK1), c-myc, ATF2, và các thành phần APtrưởng một cách yên lặng mà không kèm theo bất kì

1: c-Jun và c-Fos (Favataet al., 1998). MAPK cũng
những triệu chứng nào cho đến khi ung thư đã ở giai
liên quan trong việc vận chuyển thuộc nhân (nuclear
đoạn tiến triển (Gargiullo et al., 2002). Hiện tại chúng
transport), tập hợp các tiểu đơn vò cấu trúc nhiễm sắc
ta có những phương thức điều trò phụ và tạm thời có
chất (nucleosome assembly) và sự điều hòa bộ xương
thể chấp nhận để mà kéo dài cuộc sống của bệnh
tế bào (Lewis et al., 2000). Sự hoạt hóa MAPK có thể
nhân ung thư phổi. Do đó việc khám phá ra phương
ảnh hưởng mạnh hoặc là đề kháng lại sự chết tế bào
thức mới để chẩn đoán, phòng ngừa và điều trò ung
(reviewed in Walter, 2002) hay pro-apoptotic (Moos
thư phổi thì rất cần thiết và cấp bách.
và Fitzpatrick, 1998; Bhat và Zhang, 1999). Những
Một trong những mục tiêu dưới dòng
ảnh hưởng này phụ thuộc vào bản chất của từng loại
(downstream targets) thông thường của các tyrosine
tế bào.
kinase có hoặc không có thụ thể và các protein Ras
Điều hòa sự chết tế bào là một tiến trình phức tạp
kết nối với GTP là biểu đồ dẫn truyền tín hiệu của
và liên quan đến một số lượng lớn các gen của tế bào
MEK-MAPK (Lewis et al., 1998; Ballif và Blenis,
bao gồm Bcl-2 (Fisher et al., 1993) và các thành viên
2001). Các mức độ tăng cao hoạt hóa của MEK1 chủ
liên quan đến Bcl-2 chẳng hạn như Bcl-xL, Bcl-xS,
yếu được thấy thường xuyên ở các dòng tế bào sinh
Bad và Bax (Boise et el., 1993). Ức chế Bcl-2 làm cho
ung (Amundadottir và Leder, 1998; Hoshino et al.,

thúc đẩy sự chết của tế bào đáp ứng với một số chất
1999). Sự hoạt hóa MEK1 chủ yếu góp phần cho sự
kích thích bao gồm những thuốc chống ung thư
sinh trưởng của tế bào (Gupta et al, 1999; Blaif và
(Hickman., 1992; Fisher et al., 1993). Bcl-2 và BclBlenis, 2001), sự di chuyển (Krueger et al., 2001), sự
xL, góp phần chống lại sự chết tế bào. Chúng cũng
biến nạp của nguyên bào sợi và tế bào biểu mô
ngăn ngừa Bax và các protein pro-apoptotic gây ra
(Mansour et al., 1994; Greulich và Erikson, 1998;

Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004

73


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004

phóng thích của cytochrome c và sự hoạt hóa của
caspase 9. Nghiên cứu gần đây về sự chết tế bào đã
chứng minh tầm quan trọng của PI-3kinase và
protein dưới dòng của nó Akt (Franke et al., 1995;
Kulik et al., 1997). Akt đóng vai trò là chất đề kháng
sự chết tế bào bằng cách chống lại với các chất kích
thích khác nhau (Franke et al., 1995). Một sự kết nối
trực tiếp giữa PI-3 kinase và các protein điều hòa sự
chết tế bào đã được thiết lập thông qua Akt phospho
hóa Bad (Zha et al., 1996; Datta et al., 1997).
Một số các nghiên cứu về dòch tễ học đã dẫn

chứng mối quan hệ giữa chế độ ăn và ung thư và các
bằng chứng cho rằng chế độ ăn nhiều trái cây và rau
quả đưa đến nguy cơ mắc bệnh thấp ở một số loại
ung thư (Steinmetz va Potter, 1991; Block et al.,
1992). Flavonoides là thành phần polyphenolic mà nó
được phân bố một cách rộng rãi ở nhiều loại rau quả
và trái cây (Leighton et al., 1992; Messinaet al.,
1994; Stavric., 1994). Glycone flavonoids thông
thường nhất được tìm thấy trong chế độ ăn là
Quercetin, Kaempferol, Rutin và Robinin (Anton et
al., 1988). Trong số đó Quercetin đã được nghiên cứu
một cách rộng rãi (Constantinou et al., 1995; Leeet
al., 1998; Aligiannis et al., 2001. Hoạt động của
Flavonoids chẳng hạn như Kaempferol và quercetin
được điều hoà bởi sự tác động qua lại với các vò trí kết
nối với estrogen loại II đã được đề cập tới (Ranelletti
et al., 1992). Trong in vitro, Kaempferol ức chế sự
tăng trưởng của tế bào ung thư máu ở người (Dimas
et al., 2000) và tế bào NIH3T3 biên nạp với v-H-ras
(Kuo et al., 1994), nhưng lại bảo vệ tế bào PC12 và
T47D khỏi độc tố gây ra bởi β-amyloid (Roth et al.,
1999.)
Để hiểu sâu hơn về cơ chế phân tử cơ bản của
Kaempferol, trong tài liệu này chúng tôi chứng minh
rằng Kaempferol đã ức chế sự sinh trưởng và gây chết
tế bào ở tế bào ung thư phổi A549 thông qua hàng
loạt sự thay đổi ở mức độ phân tử như ức chế hoạt
hóa Akt, gia tăng các protein pro-apoptosis (Bax va
Bad), giảm sút protein anti-apoptosis (Bcl-2 va Bcl-xL)
và sự hoạt hóa và kéo dài của MAPK là chủ yếu.Mặt

khác dùng chất ức chế của MAPK –U0126 đã ngăn

74

chặn hoạt hóa của MEK-MAPK và làm mất đi độc tố
tế bào của Kaempferol. Điều này khẳng đònh thêm
MEK-MAPK đóng vai trò then chốt trong sự chết tế
bào do Kaempferol ở tế bào A549.

VẬT LIỆU VÀ
NGHIÊN CỨU

CÁC

PHƯƠNG

PHÁP

Nuôi cấy tế bào và điều trò
Các tế bào biểu mô phổi A549 được nuôi cấy
trong môi trường RPMI 1640 bổ sung với 10% FCS,
1% kháng sinh PN ở nhiệt độ 37°C và 5% CO2. Để
nghiên cứu những ảnh hưởng của Kaempferol, tế bào
A549 được nuôi cấy với những mật độ khác nhau và
để chúng qua 24 giờ. Sau đó các tế bào được điều trò
với những nồng độ gia tăng khác nhau của
Kaempferol từ 17.5 cho tới 70 μM trong môi trường
nuôi cấy không có huyết thanh (Serum free media).
Khi đạt được thời gian thích hợp, các tế bào sẽ được
thu thập và xử lí với những phương pháp khác nhau.

Kó thuật hình thái học
Để quan sát hình ảnh của các tế bào chết. Sau 24
giờ điều trò với những nồng độ khác nhau các tế bào
được cố đònh với dung môi formadehyde 4% khoảng 1
giờ, sau đó được rửa với dung dòch phosphate buffer
saline. Sự chết tế bào được phát hiện bằng xét
nghiệm với bộ kit TUNEL (terminal deoxynucleotidyl
transferase mediated dUTP nick-end labeling).
Kỉ thuật đo lường tỉ lệ tế bào sinh
trưởng và tế bào có khả năng sống
Bằng cách sủ dụng bộ kit ELISA (Enzyme Linked
ImmunoSorbent Assay) cho việc phát hiện tế bào
sinh trưởng và xét nghiệm MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide) cho các tế bào có khả năng sống.
Kỉ thuật thấm western
Dùng để quan sát ở mức độ phân tử. Các tế bào
điều trò sau 24 giờ, được thu nạp và chiết xuất phân tử
protein với dung dòch tan(lysis buffer) và sử dụng kỉ
thuật thấm western (Western Blot). Sau đó các màng
lai được ủ với những kháng thể thích hợp.

Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004

Nghiên cứu Y học

Phân tích thống kê

KẾT QUẢ
Bằng những kỉ thuật trên chúng tôi đã xác đònh
được ảnh hưởng của Kaempferol trên sự sinh trưởng
của tế bào trong in vitro.Kaempferol kiềm hãm sự
tăng sinh của tế bào phụ thuộc vào thời gian và liều
lượng.
a

a

24H
48H
b

A

b

Hình 2 Sự gây ra tế bào chết do Kaempferol bằng xét
nghiệm hình ảnh học

1
(450 nm)

The rate of BrdU Incorporation

1 .5

c

c

0 .5

d

c
d
e

0
0

1 7 .5

35

70

5 2 .5

K a e m p f e r o l ( µ M / m l)

a
24H
48H

1 .4

B

a
Absorbance ( 570 nm)

a

α-tubulin

Bax
Fold changed
(Bax)

b

1 .1
b

A
B
1

1.15

2.7

3.29

3.41

3.78

4.73

c
0 .8

c

Bad

c
d
d

0 .5
0

1 7 .5

35

5 2 .5

70

Fold changed
(Bad)

1

1.25

3.36

C

K a e m p f e r o l ( µ M /m l)

Bcl-2

Hình 1 Ảnh hưởng của Kaempferol trên sự sinh
trưởng và khả năng sống của tế bào.

Sau 48 giờ điều trò cho thấy mật độ tế bào giảm
xuống tùy thuộc vào liều lượng thuốc được quan sát
hình 1B. Hình 2 A cho thấy sự thay đổi hình thái học
của tế bào và màng tế bào bò bóng nước (blebbing) là
những đặc tính của tế bào chết. Tế bào chết được xác
đònh bằng xét nghiệm TUNEL cho thấy sự vỡ ra từng
mãnh DNA và kết tụ của nhân tế bào ở hình 2B
Do sự chết của tế bào ở những tế bào động vật có
vú cho thấy được điều hòa bởI các protein Bax, Bad,
Bcl-2 va Bcl-xL. Để thử nghiệm khả năng này chúng
tôi dùng kỉ thuật thấm western và kết quả đạt được
cho thấy Kaempferol gây gia tăng đối với biểu hiện
của những protein pro-apoptosis Bax và Bad (hình 3B
và 3C). Sự gia tăng được quan sát rỏ nhất ở nồng đồ
52.5 và 70μM.

D

1

0.52

Fold changed
(Bcl-xL)

1

0.46

0.24

0.2

0.12

Kaempferol (µM/ml)

0

17.5

35

52.5

70

Fold changed

(Bcl-2)

0.31

0.27

0.19

Bcl-xL

E

Hình 3 Ảnh hưởng của kaempferol trên biểu hiện
protein Bcl-2, Bax, Bad và Bcl-xL ở tế bào A549 bằng
kỉ thuật western blot.

Với số lần là 3.29- và 3.41- đối với Bax, 3.78- và
4.73 -lần đối với Bad khi được so sánh với chất kiểm
soát (control). Ngược lại các protein chống lại sự chết
tế bào như Bcl-2 và Bcl-xL được cho thấy giảm đi theo
nồng độ của thuốc (hình 3D và 3E).
Biểu đồ PI-3 kinase được hoạt hóa bởi một số các
chất tăng trưởng khác nhau đã được làm sáng tỏ. Các
xét nghiệm gần đây trên tín hiệu chết của tế bào đã
chứng minh sự quan trọng của PI-3 kinase và chất
dưới dòng của nó Akt.

Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004

75

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004

α-tubulin

A

PI-3K

B

Phospho-Akt
Fold changed
(pAkt)

hóa của caspase 7 được quan sát ở nồng độ thấp và
tăng dần theo với nồng độ ở hình 5B và 5C.

C
1

0.75

0.14

0.18

0.076

D

Akt
Fold changed
(Akt)

1

0.92

0.65

Kaempferol (µM/ml)

0

17.5

35

0.42

0.33

52.5

70

Hình 4 Những ảnh hưởng của Kaempferol lên các
phân tử protein p85 PI-3K và phospho Akt ở tế bào
A549 bằng kỉ thuật western blot.

Từ hình 4B và 4C kết quả cho thấy biểu hiện của
p85 PI-3 kinase và chất dưới dòng của nó Akt
giảm.Điều này chứng tỏ Kaempferol có ảnh hưởng
đến sự ức chế của những protein này.

α-tubulin

A

Cleavedcaspase 7

B

Foldchanged
(Cleavedcaspase 7)

1

1.25

2.51

3.71

5.61

CleavedPARP

89kD

Foldchanged
(CleavedPARP)

1

2.1

5.98

9.57

11.5

Kaempferol (µM/ml)

0

17.5

35

52.5

70

C

Hình 5 Những ảnh hưởng của Kaempferol lên các
phân tử protein cleavage caspase 7 và PARP ở tế bào
A549 bằng kỉ thuật western blot.

Một điều cũng được chứng minh là sự tách ra của
protein PARP (poly ADP-ribo polymerase) là sự kiện
sinh hóa xảy ra sớm trong quá trình tế bào chết. Do
bởi cleaved PARP là dấu xác nhận tiêu chuẩn
(hallmark) của sự hoạt hóa hệ caspase, chúng tôi xác
đònh xem cơ chế của tế bào chết có được hoạt hóa khi
điều trò với Kaempferol hay không,các kháng thể được
xét nghiệm sau đó và kết quả cho thấy sự tách rời của
phân tử protein 89 kDa (cleaved PARP) và sự hoạt

76

Hình 6. Ảnh hưởng của kaempferol trên các phân tử
protein phosphorylated MEK1/2, MAPK, và
phosphorylated p44/42 MAP kinase (Thr202/Tyr204)
và phospho C-Jun (Ser63) ở tế bào A549 bằng kỉ thuật
western blot.

MAPK có thể gây sự chết tế bào và dự đoán độ
nhạy hóa trò của khối u (Akata et al., 1995; Sabsbury
et al., 1997; Lieu et al., 1998; Chen et al., 1999; Koo
et al., 1999; Petrache et al., 1999; Alechman et al.,
2000). Để nghiên cứu ức chế sự tăng trưởng và tế bào
chết có phải do Kaempferol hay không,kỉ thuật thấm
western cùng với kháng thể kháng phospho-MAPK và

MAPK được thực hiện.Kết quả cho thấy điều trò tế bào
A549 với những nồng độ khác nhau của Kaempferol
sau 48 giờ dẩn đến sự phospho hóa của MAPK tùy
thuộc vào nồng độ (hình 6B). MEK1/2 cũng được
phospho hóa giống như MAPK (hình 6D). Bởi vì cJun là đích hoạt động của MAPK,nên mức độ
phospho của c-Jun cũng được xác đònh. Kết quả cho
thấy c-Jun cũng phospho giống như sự hoạt hóa của
MAPK (hình 6F), điều này cho thấy sự phospho của
MAPK do MEK1/2 làm gia tăng hoạt động của MAPK.
Do sự hoạt hóa của JNK và p38 cũng được cho là

Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004
yếu tố quyết đònh trong sự gián đọan của chu kỳ tế
bào và sự chết của tế bào (Sanchez et al., 1994;
MacKeigan et al., 2000). Kháng thể kháng phosphoJNK và p38 được thực hiện.Kết quả cho thấy mức độ
phospho hóa của chúng hơi thay đổi, nhưng chúng
không có khuynh hướng đóng vai trò quan trọng gây
ra tế bào chết ở tế bào A549. (hình 6G&H).

Nghiên cứu Y học

bào (hình 7F)..Một lần nữa các kết quả khẳng đònh
rằng hoạt hóa của MEK-MAPK đóng vai trò chủ yếu
trong việc gây te tế bào do Kaempferol và MEKMAPK họat động tren dòng (upstream) cũa caspase 7
để đưa đến tế bào chết.

α-tubulin

A

Phospho-MAPK

B

MAPK

C

Phospho c-Jun

D
20 kD

Cleaved Caspase 7

E

19 kD
Cleaved PARP

89 kD

Kaempferol (70 µM/ml)

_

_

_

U0126 (10 µM)

_

+

LY294002 (10 µM)

_

_

+

_

+
_

+

+
_

+

_

_

+

F

Hinh 8 Ảnh hưởng của Kaempferol và chất ức Chế
MEK1/2 -U0126 và PI-3 kinase LY294002 lên các
phân tử protein gây nên phospho hóa MAPK, c-Jun,
và cleavage của caspase 7 và PARP ở tế bào A549
bằng kỉ thuật Western blot.

BÀN LUẬN
Hình 7 Ảnh hưởng của chất ức chế MEK1/2 -U0126
và PI-3 kinase -LY294002 lên sự chết của tế bào A549
do Kaempferol bằng các xét nghiệm hình thái học.

Từ các kết quả trên cho thấy hoạt hóa MEKMAPK có thể dẫn đến sự chết tế bào. Để làm sáng
tỏ,chất ức chế của MEK1/2 được dùng để thử nghiệm
xem chất này có ức chế sự hoạt hóa của MEK-MAPK
hay không,U0126-là chất ức chế của MEK1/2 được sử
dụng kết hợp với chất ức chế PI-3kinase -LY294002.
Kết quả cho thấy khi kết hợp điều trò hai chất
Kaempferol và chất ức chế U0126 đã ngăn chặn được
bào tương co rút và màng tế bào bò bong nước qua xét
nghiệm hình ảnh học (hình 7E). Và bằng kỉ thuật
thấm western cho thấy sự kết hợp hai chất đã ngăn
ngừa Kaempferol phospho của MAPK(hình 8B), c-Jun
(hình 8D), cleave capase 7 (hình 8E), và PARP (hình

8F). Cùng lúc đó,Kaempferol kết hợp với chất ức chế
PI-3kinase đã không ngăn chận được sự chết của tế

Mối quan hệ giữa chế độ ăn và ung thư đã được
đề cập trong nhiều nghiên cứu về dòch tể học (Block
et al.,1992). Xuất độ mắc bệnh ung thư giảm đáng kể
ở nhóm người có chế độ ăn bao gồm một số lượng lớn
rau quả và trái cây hơn là nhóm người có chế độ ăn
phần lớn là thực phẩm của động vật (Steinmetz and
potter et al., 1991; Block et al., 1992). Nhiều kết quả
cho thấy rau quả và trái cây có chứa những thành
phần có những đặc tính chống lại sự sinh trưởng và
sự hình thành khối u (Leighton et al., 1992; Messina
et al., 1994; Stavric et al., 1994). Kaempferol là
thành phần trong thiên nhiên có ở trong nhiều loại
trái cây và rau quả khác nhau và cho thấy có những
ảnh hưởng chống lại sự sinh trưởng cuả tế bào.
Trong nghiên cứu này,chúng tôi đã chứng minh
Kaempferol ức chế sinh trưởng và sự chết ở tế bào
ung thư phổi A549. Về phương diện hình ảnh học, tế

Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004

77


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004

bào A549 biểu hiện với hình ảnh xếp nếp (ruffling),
bóng nước (blebbing), kết tụ bào tương và màng của
nhân (condensation of cytoplasm and nuclear
membranes), sự tập hợp nhiểm sắc chất của nhân
(aggregation of nuclear chromatin),và sự vở ra từng
mảnh của DNA.
Về khía cạnh mức độ phân tử, những thay đổi
của gia đình Bcl-2 và sự bất hoạt của phospho Akt,
kết hợp với sự họat hoá cuả MEK-MAPK được đòi hỏi
cho Kaempferol gây tế bào chết. Bên cạnh đó,
Kaempferol gây ra hoạt hoá của MEK-MAPK phụ
thuộc vào thời gian và liều lượng. Hoạt động gia tăng
của MAPK góp phần gây tế bào chết được chứng
minh bằng cách quan sát chất ức chế U0126 làm
giảm đi sự chết tế bào khi kết hợp với Kaempferol
thông qua cleaved capase –7 va PARP đã bò ngăn
chặn. Kết quả chứng minh chức năng của MEKMAPK trên dòng của sự hoạt hoá caspase để gây nên
tín hiệu chết của tế bào.
Có hai biểu đồ chính gây nên sự chết tế bào khác
nhau được mô tả ở tế bào của động vật có vú. Biểu đồ
thứ nhât liên quan đến caspase 8. Biểu đồ thứ hai liên
quan đến một lọat các phần tử protein sau đây. Tế
bào A549 trò liệu với Kaempferol đưa đến gia tăng
biểu hiện của những protein pro-apoptosis như Bax
và Bad, song song với làm giảm biểu hiện của protein
anti-apoptosis như Bcl-2 và Bcl-xL, đưa đến sự mất
cân bằng giữa số lượng protein pro-apoptosis và antiapoptosis. Hậu quả này gây sự mở ra các lổ chuyển
tiếp có thể thấm được ở thể hạt, gây ra hàng lọat sự
hoạt hóa của các phân tử protein và cuối cùng dẫn
đến tế bào chết.

Chức năng chống lại tế bào chết của PI-3kinase
là do sự hoạt hóa của protein kinase Akt. Kaempferol
được chứng minh ức chế hoạt hóa của protein này.
Chứng tỏ Kaempferol gây tế bào chết thông qua
nhiều cơ chế.
Biểu đồ của JNK và p38 cũng kết hợp làm tăng
thêm tế bào chết. (Sanchez et al., 1994; Amato et al.,
1998; Lee at al., 1998a; Jujiri et al., 1998;
Mackeigan et al., 2000) ngược lại MAPK cho thấy ức

78

chế tế bào chết (Xia et al.,1995). Kết quả nghiên cứu
cho thấy JNK và p38 không có khuynh hướng dự
phần và gây tế bào chết của Kaempferol ở tế bào
A549. Sự khác nhau trong điều hòa của hai protein
này có thể do sự khác nhau giữa cac loại tế bào hoặc
là do sự kích thích môi trường bên ngoài tế bào khác
nhau. Trái ngược lại,điều trò Kaempferol dẫn đến sự
gia tăng và kéo dài hoạt hóa của MEK-MAPK. Dùng
chất ức chế U0126 để điều hòa hoạt động của MEKMAPK, lại càng chứng minh thêm hoạt hóa của
MEK-MAPK đóng vai trò quan trọng trong tế bào chết
ở A549. Kết quả của chúng tôi được hổ trợ với một vài
kết quả nghiên cứu của họat động MEK-MAPK mà có
thể gây sự chết tế bào và dự đóan độ nhạy của hóa trò
(Sakata et al., 1995; Sansbury et al., 199; Lieu et al.,
1998; Chen et al., 1999; Koo et al., 1999; Petrache
et al., 1999; Kalechman et al., 2000).

GLOSSARY

Apoptosis: The term 'apoptosis' describes the
molecular and morphological processes leading to
fragmentated of nuclear DNA. Frequently, the terms
'apoptosis' and 'programmed cell death' are used as
synonyms.This process triggered by pathological
conditions such as inflammation, cancer, viral
infections, or exposure to a wide variety of chemical
and physical stimuli.
Adjuvant
chemotherapy:
Chemotherapy
designed to eradicate microscopic foci of metastatic
disease following local control with surgery or
radiotherapy or both.
Caspases: Cystein Aspartate-specific Proteases:
Caspases form a proteolytic network that is of
central importance in the initiation and execution of
the apoptotic program
Chemoprevention: Chemoprevention is the use
of pharmacologic or natural agents that inhibit the
development of invasive cancer either by blocking
the DNA damage that initiates carcinogenesis or by
arresting or reversing the progression of
premalignant cells in which such damage has
already occurred (for Review see Hong and Sporn,

Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004

1997, Science, 278: 1073).
Downstream: Sequences that are located futher
in the direction of expression.
Inhibitors: A chemical substance that retards or
stops enzyme activity.
MAP kinase (mitogen-activated protein
kinase, MAPK): A protein kinase that performs a
crucial step in relaying signal from the plasma
membrane to the nucleus.Turned on by the wide
range of proliferation – or differentiation –inducing
signals.
Phosphorylation: A reaction in which a
phosphate group is attached to a protein.
Phosphorylation is a common way of regulating the
activity of protein which play major role in signal
transduction.
Signal transduction: The mechanism through
which message are sent from one cell to
another,passing through the target cell wall and into
the nucleus,where the signal molecule activates
various cellular events.
Target: A molecule (often a protein).
Trancription: The normal cellular process of
turning a DNA gene copy into messenger RNA
(mRNA).
Transcriptional factors Any protein required to
initiate or regulate transcription in eukaryotes.
Western blotting: This technique is designed to
detect specific protein.After separation of the
proteins by gel eletrophoresis,proteins are blotted to

a filter paper and specific ones detected by labeled
antibodies.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Midthun DE et al,.(1997) Postgrad. Med 101: 187-194
Feng G et al., (2001) Cancer Res. 61: 7999-8004
Gargiullo P et al., (2002) MMWR 51: 49-53
Steinmetz KA et al., (1991) Cancer Causes Control 2:
325-357
Block G et al., (1992) Nutr. Cancer 18: 1-29
Leighton T et al., (1992) (Washington: American
Chemical Society) pp. 229-238
Messina MJ et al., (1994) Nutr. Cancer 21: 113-131
Stavric B (1994) Clin. Biochem. 27: 245-248
Anton R (1988) (eds.) (New York: Alan R. Liss, Inc.)
volume 280 pp. 423-439

10.
11.
12.

13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.

43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.

Nghiên cứu Y học

Aligiannis N et al., (2001) Planta Med. 67: 468-470
Constantinou A et al., (1995J Nat. Prod. 58: 217-225
Lee SC et al., (1998) Anticancer Res. 18: 1117-1121
Bokkenheuser VD et al., (1988) (New York: Alan R.
Liss, Inc.)
Whitten P et al., (1991 (New York: Raven Press)
Kostrzewska A et al., (1993) Eur. J Pharmacol. 233:
127-134
Oliveira EJ et al., (2000) FEBS Lett. 471: 1-6

Ferrell JE Jr et al., (1979) Mol. Pharmacol. 16: 556-568
Landolfi R et al., (1984) Biochem. Pharmacol. 33: 15251530
Rogers JC et al., (1989) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 164: 419-425
Dimas K et al., (2000) Pharmacol. Res. 41: 85-88
Kuo ML et al., (1994) Cancer Lett. 87: 91-97
Roth A et al., (1999) J. Neurosci. Res. 57: 399-404
Ranelletti FO et al., (1992) Int. J. Cancer 50: 486-492
McCawley LJ et al., (1999) J Biol. Chem. 274: 43474353
Foey AD et al., (1998) J Immunol. 160: 920-928
Moos PJ et al., (1998) Cell Growth Differ. 9: 687-697
Warne PH et al., (1993) Nature 364: 352-355
Crews CM et al., (1992) Science 258: 478-480
Her JH et al., (1993) Biochem. J 296: 25-31
Anderson NG et al., (1990) Nature 343: 651-653
Marais R et al., (1993) Cell 73: 381-393
Bueno OF et al., (2000) EMBO J 19: 6341-6350
Remacle-Bonnet MM et al., (2000) Cancer Res. 60: 20072017
Bhat NR et al., (1999) J Neurochem. 72: 112-119
Kulik G et al., (1997) Mol. Cell Biol. 17: 1595-1606
Franke TF et al., (1995) Cell 81: 727-736
Page C et al., (2000) Anticancer Res. 20: 407-416
Datta SR et al., (1997) Cell 91: 231-41
Zha J et al., (1996) Cell 87: 619-628
Fisher TC et al., (1993) Cancer Res. 53: 3321-3326
Boise LH et al., (1993) Cell 74: 597-608
Hockenbery D et al., (1990) Nature 348: 334-336
Hickman JA (1992) Cancer Metastasis Rev. 11: 121-139
Lim IJ et al., (2001) Plast. Reconstr. Surg. 107: 797-808
Huynh H et al., (2002) Cell Growth Differ. 13: 115-122

Cai J et al., (1998) Acta 1366: 139-149
Zou H et al., (1999) J Biol. Chem. 274: 11549-11556
Germain M et al., (1999) J Biol. Chem. 274: 2837928384
Lotem J et al., (1995) Cell Growth Differ. 6: 647-653
Downward J (1999) Nat. Cell Biol. 1: E33-E35
He H et al., (1999) Cell Growth Differ. 10: 307-315
Guyton KZ et al., (1996) J Biol. Chem. 271: 4138-4142
Aikawa R et al., (1997) J Clin. Invest 100: 1813-1821
Favata MF et al., (1998) J Biol. Chem. 273: 1862318632
Sanchez I et al., (1994) Nature 372: 794-798
MacKeigan JP et al., (2000) J Biol. Chem. 275: 3895338956
Amato SF et al., (1998) Cancer Res. 58: 241-247
Wei H et al., (1990) Cancer Res. 50: 499-502
Zhou JR et al., (1998) Cancer Res. 58: 5231-5238
Shao ZM et al., (1998) Cancer Res. 58: 4851-4857

Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004

79


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004

61. Muzio M et al., (1998) J Biol. Chem. 273: 2926-2930
62. Vander Heiden MG et al., (1999) Nat. Cell Biol. 1:
E209-E216
63. Chao DT et al., (1998) 16: 395-419
64. Reed JC (1998) Oncogene 17: 3225-3236

65. Khwaja A (1999) Nature 401: 33-34

80

66. Wang CY et al., (1999) Mol. Cell Biol. 19: 5923-5929
67. Lee LF et al., (1998) J Biol. Chem. 273: 28253-28260
68. Yujiri T et al., (1998) Science 282: 1911-1914
69. Lieu CH et al., (1998) Cell Growth Differ. 9: 767-776
70. Kalechman Y et al.,(2000) Int J Cancer 86: 281-288
71. Qiao, L et al., (2002) In press

Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004