Hiệu quả của phương pháp ly tâm phân lớp tỷ trọng phân lập tế bào gốc tủy xương sử dụng cho điều trị một số tổn thương xương và khớp

TP CH Y - DC HC QUN S S 8 - 2013

HIU QU CA PHNG PHP LY TM PHN LP T TRNG
PHN LP T BO GC TY XNG S DNG CHO IU TR
MT S TN THNG XNG V KHP
Dng Vn Ton*; Lý Tun Khi**
Tóm tắt
Nghiờn cu ny nhm ỏnh giỏ hiu qu quy trỡnh thu gom, chit tỏch khi t bo gc (TBG) t
dch ty xng bng phng phỏp ly tõm theo phõn lp t trng t bo. 126 bnh nhõn (BN) khp
gi (KG), chm lin xng (CLX) thõn xng di, BN ngn chi v mt on chi iu tr kộo di chi
theo nguyờn lý Ilizarov ht giai on cng gión, BN hoi t vụ khun chm xng ựi giai on I, II
(theo ARCO), mi BN c chc hỳt ly 250 ml dch ty xng t xng chu, tỏch ly thnh phn
t bo n nhõn bng phng phỏp ly tõm gradient t trng vi dung dch ficoll t trng 1,077 g/l.
Kt qu: th tớch khi TBG ty xng thu c l 32,19 5,62 ml, s l ng t bo cú nhõn 49,08
+
30,79 G/L, t bo n nhõn chim a s (57,38 13,86%); m t bo gc CD 34 l 16,98
+
9,89 G/L; t l gi t bo n nhõn v t bo CD 34 tng ng 34,89 12,05% v 55,96 30,46%;
+
m t bo CD 34 tng 5,67 3,15 ln; t l loi b hng cu v huyt sc t tng ng 99,60
0,48% v 99,32 0,41%.
* T khúa: T bo gc ty xng; Khp gi; Chm lin xng; Ly tõm phõn lp t trng.

EFFICACY OF GRADIENT DENSITY CENTRIFUGATION
METHOD IN ISOLATING BONE MARROW STEM CELLS
FOR TREATMENT OF CERTAIN INJURED BONES AND JOINTS
Summary
The aims of this study was to assess the efficacy of the gradient density centrifugation method in
isolating bone marrow stem cells (BMSC). 126 patients with nonunion long bones, shortened limbs,
aseptic femoral head osteonecrosis staged I, II (ARCO) were enrolled. 250 ml bone marrow fluid
was aspirated from the pelvis of every patient. Mononuclear cells were separated by the gradient

density centrifugation method using Ficoll solution 1.077. Results: Final BMSC suspension volume
was 32.19 5.62 ml, the suspension cells concentration was 49.08 30.79 G/L with 57.38 13.86%
+
+
mononuclear cells; CD 34 cell concentration was 16.98 9.89 G/L; mononuclear cells and CD 34
+
cells recovering ratio were 34.89 12.05% and 55.96 30.46%, respectively; CD 34 cell concentration
increased 5.67 3.15 times; RBC and hemoglobin removing ratio were 99.60 0.48% and 99.32
0.41%, respectively.
* Key words: Bone marrow stem cell; Nonuni on bone; Shortened limbs; Gradient density
centrifugation.
* Trng i hc Y H Ni
** Bệnh viện TWQ 108
Ng-ời phản hồi (Corresponding): Lý Tun Khi ()
Ngày nhận bài: 31/7/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/9/2013
Ngày bài báo đ-ợc đăng: 23/9/2013


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sử dụng TBG, TBG tạo máu trong điều
trị là một hướng đang được tập trung
nghiên cứu và đã thu được kết quả rất bất
ngờ không chỉ trong điều trị bệnh của tổ
chức tạo máu mà còn trong nhiều bệnh của
các cơ quan tổ chức khác với mục đích
phục hồi, tái tạo tổ chức. Các TBG tạo máu
của tủy xương cũng như của máu tuần
hoàn được nghiên cứu rất sâu và ứng dụng

rộng rãi trong lâm sàng với kết quả tốt. Đã
có một số nghiên cứu chứng minh bằng cấy
ghép TBG tủy xương tự thân có thể điều trị
thành công những trường hợp gãy xương
không liền, mất đoạn xương cũng như tái
tạo các mô xương bị hoại tử trên người.
Dịch tủy xương có chứa TBG với số lượng
hạn chế, còn lại đa số là tế bào đang
trưởng thành hoặc đã trưởng thành không
có vai trò trong tạo xương. Vì vậy, để đạt
yêu cầu điều trị, dịch tủy xương sau khi thu
gom được xử lý cô đặc để tập trung số
lượng TBG với đậm độ cần thiết cho quá
trình liền xương và loại bớt các thành phần
tế bào đã trưởng thành. Vì vậy chúng tôi
tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu: Đánh
giá hiệu quả quy trình thu gom, chiết tách
khối TBG từ dịch tủy xương bằng phương
pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào
trong điều trị một số tổn thương xương,
khớp khó hồi phục.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
126 BN KG, CLX thân xương dài, BN
ngắn chi và mất đoạn chi dưới điều trị kéo
dài chi theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn
căng giãn, BN hoại tử vô khuẩn chỏm
xương đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), BN
tuổi từ 15 - 66 được điều trị bằng ghép TBG

tủy xương tại Viện Chấn thương Chỉnh
hình, Bệnh viện TWQĐ 108 và Viện Chấn

thương Chỉnh hình - Bệnh viện Việt Đức từ
tháng 01 - 2008 đến 03 - 2011.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Thiết kế nghiên cứu: tiến cứu mô tả cắt
ngang.
* Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:
- Kỹ thuật thu gom dịch tủy xương: thu
gom dịch tủy xương bằng phương pháp
chọc hút qua da, dưới gây tê tủy sống. Tiến
hành thủ thuật tại phòng mổ trong điều kiện
vô khuẩn. Vị trí chọc hút là gai chậu sau
trên, tổng số dịch tủy xương lấy 250 ml.
- Kỹ thuật tách chiết, cô đặc TBG từ dịch
tủy xương: bằng phương pháp ly tâm theo
phân lớp tỷ trọng tế bào, pha loãng dịch tủy
xương theo tỷ lệ 6:1 với dung dịch đệm
(nước muối sinh lý hoặc dung dịch PBS,
6V dịch tủy xương + 1V dung dịch đệm).
tách thành phần tế bào đơn nhân (MNC)
dịch tủy xương (trong đó có chứa TBG)
bằng cách ly tâm theo gradient tỷ trọng sử
dụng dung dịch ficoll tỷ trọng 1,077 g/cm 3,
huyền dịch khối TBG này trong 30 ml nước
muối sinh lý.
- Kỹ thuật xác định thành phần và chất
lượng khối TBG:
+ Đếm số lượng tế bào có nhân và

thành phần tế bào bằng máy huyết học tự
động CELL-DYN 1800 (Abbott, Hoa Kỳ) kết
hợp với phương pháp tế bào học kinh điển.
+ Xác định TBG tạo máu bằng kỹ thuật
đếm số lượng tế bào CD34+ trên thiết bị
phân tích tế bào dòng chảy FACS-Calibur
(Hoa Kỳ) với phần mềm CellQuest theo quy
trình ISHAGE, sử dụng bộ sinh phẩm của
hãng Becton - Dickinson (Hoa Kỳ).
* Thu thập và xử lý số liệu: phân tích và
xử lý bằng chương trình thống kê SPSS 18.0.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013

Bảng 1: Đặc điểm BN nghiên cứu (n = 126).
Tuæi

Trung
bình ± SD

Nam (n = 95)

p

N÷ (n = 31)

37,70 ± 11,98 35,56 ± 11,97

> 0,05

36,52 ± 12,26

Bảng 2: Các chỉ số tế bào của dịch tủy
xương trước tách ở BN nghiên cứu (n = 126).
Gi¸ trÞ

Gi¸ trÞ

Gi¸ trÞ

vÞ

thÊp
nhÊt

cao
nhÊt

trung b×nh
 SD

ml

290,00

340,00

320,69 
12,49

G/L

6,10

36,60

18,53  5,65

Tỷ lệ MNC

%

27,20

54,10

39,88  5,94

Tỷ lệ GRAN

%

45,90

72,80

59,48  5,76

RBC

T/L

2,05

4,51

3,86  0,48

HGB

g/L

61,00

127,00 117,76  13,87

PLT

G/L

25,00

343,00 162,57  99,02

Thể tích dịch
tủy xương
trước tách

Số lượng tế bào
có nhân trong
dịch tủy xương

Ьn

xương ở gai chậu sau trên hai bên. Do vậy,
tư thế bệnh nhân đều đặt nằm sấp. Một số
tác giả đã ứng dụng ghép trực tiếp tủy
xương vào ổ CLX, KG thân xương chày với

Trong tổng số 126 khối TBG của BN
nghiên cứu, 95 khối TBG được tách từ BN
nam và 31 khối TBG từ BN nữ. Nghiên cứu
tiến hành ở 126 bệnh nhân có tuổi trung
bình 36,52 ± 12,26, tuổi trung bình của BN
ở hai nhóm nghiên cứu khác nhau không có
ý nghĩa thống kê (p > 0,05). BN nhỏ tuổi
nhất 15 và cao nhất 66 tuổi; bao gồm 69 BN
KG, CLX thân xương dài, 29 BN ngắn chi
và mất đoạn chi dưới điều trị kéo dài chi
theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn căng
giãn, 28 BN hoại tử vô khuẩn chỏm xương
đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), những BN
này được điều trị bằng ghép TBG tủy
xương. BN được chẩn đoán bệnh dựa trên
các tiêu chuẩn về lâm sàng và cận lâm
sàng theo từng mặt bệnh tương ứng.

ChØ sè

kim lấy tủy, tất cả 126 BN đều được lấy tủy

thể tích thay đổi khác nhau. Healey (1990)
[7] ghép trung bình 50 ml tủy xương để điều
trị BN bị CLX, KG sau lấy u xương chày.
Connolly (1991) [4] ghép từ 100 - 150 ml
tủy xương cho 20 trường hợp KG xương
chày. Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu ghép
tủy xương sau khi tách khối TBG để điều trị
CLX, KG trên lâm sàng. Hernigou (2006) [8]
lấy trung bình 306 ml tủy xương trước khi
tách. Do vậy, rất khó để chúng tôi có thể
tham khảo lấy bao nhiêu dịch tủy xương ở
người Việt Nam trưởng thành khỏe mạnh là
vừa đủ để đạt hiệu quả liền xương tối ưu.
Chúng tôi thấy thông thường một người
trưởng thành, khỏe mạnh có thể cho một
đơn vị máu (250 ml) trong khoảng thời gian
10 - 15 phút vẫn bình thường, không ảnh
hưởng đến lao động, sinh hoạt. Tương tự,
nếu một BN không có bệnh mạn tính hoặc
không bị thương tổn nặng kèm theo, khi
mất khoảng 200 - 250 ml máu cơ thể vẫn
thích nghi được và có thể bù trừ bằng dung

Lấy dịch tủy xương: qua thăm khám cho
thấy đa phần xương chậu của BN không
quá to, phần gai chậu trước trên không dày,
tiên lượng có thể gặp khó khăn khi chọc

dịch cao phân tử... mà không ảnh hưởng
đến huyết động. Hơn nữa, với một thể tích
dịch tủy xương đủ lớn, hy vọng sẽ có đủ số
lượng TBG cần thiết. Vì vậy, chúng tôi lấy
một thể tích dịch tủy xương chung cho tất
cả 101 BN là 250 ml. Mọi BN đều được
truyền dịch trong quá trình lấy tủy xương
như huyết thanh mặn 0,9% hoặc Hes 6%.
Qua theo dõi trong và sau khi lấy tủy


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013

xương, không gặp trường hợp nào bị tai

xương trước tách là 18,53  5,65 G/L, MNC

biến như sốc hay tụt huyết áp.

chiếm 39,88  5,94%, số lượng hồng cầu

Ở 126 BN trong nghiên cứu này cho

và lượng huyết sắc tố lần lượt là 3,86 

thấy số lượng tế bào có nhân trong dịch tủy

0,48 triệu/l, 117,76  13,87 g/l.

Bảng 3: Tỷ lệ và số lượng tuyệt đối tế bào CD34+ trong dịch tủy trước tách ở BN nghiên
cứu (n = 126).
ChØ sè

Tỷ lệ tế bào CD34

Ьn
vÞ

Gi¸ trÞ
thÊp nhÊt

Gi¸ trÞ
cao nhÊt

Gi¸ trÞ
trung b×nh  SD

%

0,17

1,19

0,55  0,19

+
+

Số lượng tế bào CD34 /ml dịch tủy xương

+

Số lượng tế bào CD34 trong dịch tủy xương

x10

6

0,02

0,28

0,10  0,04

x10

6

7,03

88,70

33,25  17,28

Bảng 4: Các chỉ số tế bào của khối TBG tách ở BN nghiên cứu (n = 126).
ChØ sè

Ьn vÞ

Gi¸ trÞ

Gi¸ trÞ

Gi¸ trÞ

thÊp nhÊt

cao nhÊt

trung b×nh  SD

Thể tích khối tế bào gốc

ml

21,00

55,00

32,19  5,62

Số lượng tế bào có nhân của khối TBG

G/L

10,80

225,20

49,08  30,79

Tỷ lệ MNC

%

27,00

84,60

57,38  13,86

Tỷ lệ GRAN

%

15,40

73,00

42,67  14,03

RBC

T/L

0,03

1,14

0,12  0,02

HGB

g/L

2,00

24,00

6,04  3,17

PLT

G/L

44,00

1023,00

353,48  236,58

Dịch tủy xương được tách thành phần
tế bào đơn nhân bằng cách ly tâm theo
gradient tỷ trọng sử dụng dung dịch ficoll.
Trong 32,19 ± 5,62 ml khối TBG tủy xương
sau khi tách bằng phương pháp ly tâm theo
tỷ trọng tế bào và cô đặc, số lượng tế bào
có nhân là 49,08  30,79 g/l, tế bào đơn
nhân chiếm đa số (57,38  13,86%). Kết
quả của chúng tôi tương tự nghiên cứu của

Nguyễn Mạnh Khánh [2] ở 65 BN CLX,
KG thân xương chày, sau khi tách và cô đặc
Bảng 5: Tỷ lệ và số lượng tuyệt đối tế
bào CD34 + trong khối TBG ở BN nghiên
cứu (n = 126).

khối TBG tủy xương, số lượng tế bào có
nhân trung bình 44,5 ± 26,0 g/l, số lượng tế
bào đơn nhân trong khối trung bình 25,0 ±
14,6 g/l. Nhiều tác giả khác cho rằng nên
tách và cô đặc tủy xương trước khi ghép để
loại bỏ những tế bào không cần thiết cho
quá trình liền xương cũng như làm tăng mật
độ TBG tạo xương trong dịch ghép. Kết quả
này cho thấy hiệu quả của việc tách khối
khối TBG tủy xương, đã loại được những tế
bào không cần thiết do các TBG nằm trong
khối tế bào đơn nhân này.
ChØ sè

Tỷ lệ tế bào

Ьn
vÞ

Gi¸ trÞ
thÊp
nhÊt

Gi¸ trÞ

cao
nhÊt

Gi¸ trÞ
trung b×nh
 SD

%

0,14

4,76

1,22  0,65


TP CH Y - DC HC QUN S S 8 - 2013
CD34+

T l gi CD
34+

S lng t
bo CD34+/ml
khi TBG

x106

S lng t
+

bo CD34
trong khi TBG

x106

0,06

0,54 0,30

2,03

trong 1 ml
1,98

16,96 9,89

62,85

T l t bo CD 34 + trong khi TBG tỏch
bng phng phỏp ly tõm theo t trng t
bo l 1,22 0,65%. Nghiờn cu 65 BN CLX,
KG thõn xng chy, mt s tỏc gi thy
t l t bo CD34 + trung bỡnh 1,3 0,5%
(0,3 - 3,1%). Nng t bo CD34+/ml khi
TBG ty xng l 0,5 0,2 g/l. Tng s
lng t bo CD34+ khi TBG trung bỡnh
13,8 5,3 x 106.
Bng 6: T l loi b cỏc t bo bch
cu ht (GRAN), hng cu, huyt sc t v
tiu cu BN nghiờn cu (n = 126).

Chỉ số

Tng CD 34+

ơn
vị

Giá trị

Giá trị

Giá trị

thấp

cao

trung bình

nhất

nhất

SD

T l loi
GRAN

%

38,00

97,68

80,83 13,49

T l loi hng
cu

%

95,96

99,92

99,60 0,48

T l loi huyt
sc t

%

96,31

99,83

99,32 0,41

T l loi tiu
cu

%

35,54

95,42

52,79 40,68

Khi tỏch bng phng phỏp ly tõm theo
t trng t bo, t l loi b bch cu ht
(GRAN) l 80,83 13,49%. õy l nhng
thnh phn khụng cn thit trong khi TBG.
Nh vy, t l loi b cỏc thnh phn trờn
tng i cao.
Bng 7: T l gi li t bo CD 34+ BN
nghiờn cu (n = 126).
Chỉ số

ơn
vị

Giá trị
thấp
nhất

Giá trị
cao
nhất

Giá trị
trung
bình SD

T l gi MNC

%

7,70

68,79

34,89
12,05

%

58,25

250,27

55,96
30,46

Ln

0,7

25,83

5,67
3,15

T l gi li t bo MNC khi tỏch TBG t
dch ty xng bng phng phỏp ly tõm
theo t trng t bo l 34,89 12,05%.
Kt qu ny phự hp vi nghiờn cu ca
Nguyn Mnh Khỏnh [2]: t l % t bo
CD34 + trong khi TBG ty xng sau
khi tỏch tng gp hn 2 ln so vi trc
khi tỏch (trc tỏch 0,6 0,2%, sau tỏch
1,3 0,5%).
Connolly (1989) [4] ỏnh giỏ hiu qu
to xng khi ghộp ty xng n thun
v ty xng cụ c ó qua ly tõm vo
khoang phỳc mc v chm lin xng.
Vi cựng mt th tớch ghộp, kt qu cho
thy quỏ trỡnh to xng c thỳc y khi
ghộp ty xng ó qua ly tõm, nhng
khụng xy ra khi ghộp ty xng cha qua
x lý. Ti cỏc khoang c ghộp ty
xng, sau ly tõm, mc canxi lng ng
nhiu hn so vi ghộp ty ton b (193%
so vi 101%). Ti góy chm lin xng,
to xng tt hn c v mt hoỏ sinh v c
hc. Trờn phim X quang 5 tun sau ghộp,
quỏ trỡnh lin xng ci thin rừ rt nhúm
c ghộp ty xng ó qua ly tõm. Theo
tỏc gi, s khỏc bit ny do sau khi ly tõm
mt TBG trong ty xng ghộp tng lờn

khin quỏ trỡnh to xng mi c ci
thin hn.
KT LUN
Qua nghiờn cu quy trỡnh thu gom, chit
tỏch khi TBG t dch ty xng bng
phng phỏp ly tõm theo t trng t bo
126 BN tn thng xng, khp khú hi
phc, chỳng tụi rỳt ra mt s kt lun sau:


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013
- Thể tích khối TBG tủy xương thu được
32,19 ± 5,62 ml, số lượng tế bào có nhân
49,08 ± 30,79 g/l, trong đó tế bào đơn nhân
chiếm đa số (57,38 ± 13,86%).

7. Healey JH, Zimmerman PA, McDonnell
JM, Lane JM. Percutaneous bone marrow
grafting of delayed union and nonunion in cancer
patients. Clin Orthop. 1990, 256, pp.280-285.

- Tỷ lệ tế bào CD 34 + của khối TBG tủy
xương là 1,22 ± 0,65%, số lượng tế bào
gốc CD 34+ là 16,98 ± 9,89 g/l.

8. Hernigou P, Mathieu G., Poignard A,
Manicom O, Beaujean F, Rourd H. Percutaneous
autologous bone-marrow grafting for nonunions.
Surgical technique. J Bone Joint Surg. 2006,
88A, Suppl 1, pp.322-327.

- Tỷ lệ giữ tế bào đơn nhân và tế bào
CD 34+ tương ứng là 34,89 ± 12,05% và
55,96 ± 30,46%; sau chiết tách, đậm độ tế
bào CD 34 + tăng 5,67 ± 3,15 lần.
- Tỷ lệ loại bỏ bạch cầu hạt, hồng cầu,
huyết sắc tố và tiểu cầu lần lượt là 80,83 
13,49%, 99,60 ± 0,48%, 99,32 ± 0,41% và
52,79  40,68%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Thị Thu Hà. TBG và khả năng sử
dụng TBG trong điều trị. Y học Việt Nam số đặc
biệt, 2004, 302 (9), tr.3-20.
2. Nguyễn Mạnh Khánh. Nghiên cứu ứng
dụng ghép TBG tủy xương tự thân điều trị CLX,
KG thân xương chày. Luận án Tiến sỹ Y học.
2010.
3. Brazelton T, Rossi FM, Keshet GI, Blau
HM. From marrow to brain: expression of
neuronal phenotypes in adult mice. Science.
2000, 290, pp.1775-1779.
4. Connolly JF, Guse R, Lippiello L, Dehne
R. Development of an osteogenic bone marrow
preparation. J Bone Joint Surg. 1989, 71A,
pp.684-691.
5. Edelberg JM, Tang L, Hattori K, Lyden D,
Rafii S. Young adult bone marrowderived
endothelial precursor cells restore agingimpaired cardiac angiogenic function. Circ Res.
2002, 90, E89-E93.
6. Grant MB, May WS, Caballero S et al.

Adult hematopoietic stem cells provide functional
hemangioblast activity during retinal neovascularization.
Nat Med. 2002, 8, pp.607-612.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013