luận văn thạc sĩ xác định hiệu suất, đặc trưng tính chất của dịch oligo carrageenan từ rong sụn kappaphycus alvarezii thủy phân bằng axit

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Hoàng

XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT, ĐẶC TRƢNG TÍNH CHẤT CỦA DỊCH
OLIGO CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS
ALVAREZII THỦY PHÂN BẰNG AXIT

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nha Trang - 2019


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Hoàng

XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT, ĐẶC TRƢNG TÍNH CHẤT CỦA DỊCH
OLIGO CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS
ALVAREZII THỦY PHÂN BẰNG AXIT

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
Hƣớng dẫn 1

Hƣớng dẫn 2

TS. Phạm Trung Sản

TS. Đào Việt Hà

Nha Trang – 2019


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2019
Tác giả luận văn

Nguyễn Hoàng

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa
học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Phạm Trung Sản và
TS. Đào Việt Hà đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành
bản luận văn này.
Tôi chân thành cảm ơn đề tài mã số: TN18/C06 thuộc chương trình
Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ cấp quốc gia đã hỗ trợ kinh phí
cho việc thực hiện Luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã giảng dạy, tạo
mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục
cần thiết.
Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của
Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các
anh chị em trong phòng Nghiên cứu ăn mòn và Công nghệ điện hóa trong quá
trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân
và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn.
Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2019
Tác giả luận văn

Nguyễn Hoàng


1

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục........................................................................................................ 1
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ......................................................... 6
Danh mục các bảng ..................................................................................... 7
Danh mục các hình vẽ, đồ thị ...................................................................... 9
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 11
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. RONG SỤN.............................................................................................. 13
1.1.1. Giới thiệu về rong sụn ....................................................................... 13
1.1.2. Thành phần hóa học của rong sụn ..................................................... 13
1.2. TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN . 14
1.2.1. Giới thiệu chung về carrageenan ....................................................... 14
1.2.2. Phân loại ............................................................................................ 15
1.2.3. Cấu trúc ............................................................................................. 16
1.2.4. Đặc trƣng hóa học của carrageenan từ rong sụn Kappaphycus
alvarezii ....................................................................................................... 17
1.2.5. Oligo Carrageenan và ứng dụng ........................................................ 18
1.2.5.1. Oligo carrageenan ...................................................................... 18
1.2.5.2. Ứng dụng của oligo carrageenan ............................................... 20
1.2.6. Các phƣơng pháp thủy phân carrageenan thành oligo carrageenan .. 23
1.2.6.1. Phương pháp hóa học ................................................................. 23


2

1.2.6.2. Phương pháp vật lý ..................................................................... 24

1.2.6.3. Phương pháp sinh học ................................................................ 25
1.2.6.4. Các phương pháp kết hợp ........................................................... 26
1.3. THỦY PHÂN CARRAGEENAN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HÓA HỌC
......................................................................................................................... 27
1.3.1. Ƣu điểm ............................................................................................. 27
1.3.2. Nhƣợc điểm ....................................................................................... 28
1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ...................................................... 29
1.4.1. Phân tích thành phần hóa học rong sụn ............................................. 29
1.4.1.1. Phân tích protein tổng số bằng phương pháp Kieldahl ............. 29
1.4.1.2. Phân tích hàm lượng lipid tổng số bằng phương pháp Folch ... 29
1.4.1.3. Phương pháp phân tích hàm lượng tro ...................................... 30
1.4.1.4. Phương pháp phân tích độ ẩm của rong biển khô ..................... 30
1.4.2. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng sau thủy phân.30
1.4.3. Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng phân tử của oligo carrageenan. 30
1.4.3.1. Bằng nhớt kế ............................................................................... 30
1.4.3.2. Sắc ký rây phân tử ...................................................................... 31
1.4.3.3. Tán xạ ánh sáng tĩnh .................................................................. 32
1.4.4. Phƣơng pháp phân tích cấu trúc oligo carrageenan .......................... 35
1.4.4.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ............................................. 35
1.4.4.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).................... 36
1.4.4.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS) ............................................ 37
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 39
2.2. HÓA CHẤT: ............................................................................................ 39


3

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 39
2.3.1. Phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học rong sụn ....................... 39

2.3.1.1. Phân tích protein thô .................................................................. 39
2.3.1.2. Phân tích lipid thô ...................................................................... 39
2.3.1.3. Phân tích hàm lượng tro ............................................................. 41
2.3.1.4. Phân tích độ ẩm ......................................................................... 42
2.3.2. Phƣơng pháp chiết carrageenan......................................................... 42
2.3.3. Phƣơng pháp thủy phân tạo oligo carrageenan ................................. 43
2.3.4. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng ....................... 43
2.3.5. Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp sắc
ký thẩm thấu gel (GPC) ............................................................................... 43
2.3.6. Phƣơng pháp phân tích đặc trƣng cấu trúc carrageenan bằng phổ IR
..................................................................................................................... 43
2.4. THỰC NGHIỆM ...................................................................................... 44
2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ...................................................................... 44
2.4.1.1. Thu và xử lý nguyên liệu ............................................................. 45
2.4.1.2. Chiết carrageenan ...................................................................... 45
2.4.2. Thủy phân rong sụn bằng các axít ở các điều kiện khác nhau .......... 47
2.4.2.1. So sánh hiệu suất thủy phân theo nồng độ axit .......................... 47
2.4.2.2. So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo thời gian ........... 48
2.4.2.3. So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo nhiệt độ ............ 49
2.4.3. Thu hồi oligo carrageenan ................................................................. 49
2.4.4. Phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng ............................................. 49
2.4.5. Xác định hiệu suất thủy phân và trọng lƣợng phân tử dịch thủy phân
..................................................................................................................... 50
2.4.6. Đƣa ra điều kiện thủy phân tối ƣu cho dịch chiết sau thủy phân ...... 50


4

2.4.7. Khảo sát khả năng kích thích sinh trƣởng của dịch oligo carrageenan
trên cây ngô. ................................................................................................ 50

2.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU ..................................................................................... 51
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG SỤN ............................................... 52
3.2. HIỆU SUẤT THỦY PHÂN THEO CARBOHYDRAT TỔNG ............. 53
3.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ axit ............................................................. 53
3.2.1.1. Đánh giá hiệu suất thủy phân của hai loại axit ......................... 53
3.2.1.2. Lựa chọn nồng độ axit thích hợp ................................................ 56
3.2.2. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân .................................................. 57
3.2.2.1. Đánh giá hiệu suất thủy phân của hai loại axit ......................... 57
3.2.2.2. Lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp .................................... 59
3.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ .................................................................... 60
3.2.3.1. Đánh giá hiệu suất thủy phân ..................................................... 60
3.2.3.2. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp ....................................................... 62
3.3. TỐI ƢU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN RONG SỤN
KAPPAPHYCUS ALVAREZII BẰNG AXÍT VÀ ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH
THỦY PHÂN THÍCH HỢP............................................................................ 63
3.3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân .................................................. 63
3.3.2. Đề xuất quy trình thủy phân carrageenan chiết từ rong sụn
Kappaphycus alvarezii bằng phƣơng pháp hóa học sử dụng xúc tác axit .. 70
3.4. TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ TRUNG BÌNH CỦA OLIGO
CARRAGEENAN........................................................................................... 72
3.5. ĐẶC TRƢNG CẤU TRÚC CỦA OLIGO CARRAGEENAN ............... 76
3.6. KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG CỦA DỊCH OLIGO
CARRAGEENAN TRÊN CÂY NGÔ ............................................................ 80


5

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 85

4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 85
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 87
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 94


6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

3,6 AG

3,6-AnhydroGalactose

3,6-AnhydroGalactose

GPC

Gel Permeation Chromatography

Sắc ký thẩm thấu gel

HMF

HydroxyMethylFurfural

HydroxyMethylFurfural

IR

InfraRed

Phổ hồng ngoại

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hƣởng từ hạt nhân

PGR

Plant growth regulator

SLS

Static Light Scattering

Tán xạ ánh sáng tĩnh

XRD

X-ray diffraction

Nhiễu xạ tia X

Chất

điều hòa

trƣởng thực vật

sinh


7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rong sụn .................................................. 13
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của rong Sụn – Kappaphycus alvarezii ........ 52
Bảng 3.2. Hàm lƣợng carbohydrat tổng (g/L) sau thủy phân của các loại
axit theo nồng độ khác nhau, thời gian 90 phút, nhiệt độ 90 0C, 2 %
(w/v) bột carrageenan .............................................................................. 54
Bảng 3.3. Kết quả phân tích thống kê với số liệu hiệu suất thủy phân theo
nồng độ axit ............................................................................................. 56
Bảng 3.4. Hàm lƣợng carbohydrat tổng (g/L) ) sau thủy phân của các loại
axit theo thời gian, nhiệt độ 90 0C, 2 % (w/v) bột carrageenan, nồng
độ axit 0,2 M ............................................................................................ 58
Bảng 3.5. Kết quả phân tích thống kê với số liệu hiệu suất thủy phân theo
thời gian thủy phân .................................................................................. 59
Bảng 3.6. Hàm lƣợng carbohydrat tổng (g/L) sau thủy phân của các loại
axit theo nhiệt độ thủy phân, thời gian 90 phút, 2 % (w/v) bột rong
carrageenan trong 80 mL axit 0,2 M ....................................................... 61
Bảng 3.7. Kết quả phân tích thống kê với số liệu hiệu suất thủy phân theo
nhiệt độ thủy phân ................................................................................... 62
Bảng 3.8. Giới hạn phạm vi và mức biến đổi của các yếu tố ......................... 63
Bảng 3.9. Kết quả xác định hàm mục tiêu theo phần mềm qui hoạch thực
nghiệm ..................................................................................................... 64
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phƣơng sai với hàm mục tiêu là hiệu suất
thủy phân bằng axit ascorbic ................................................................... 65

Bảng 3.11. Kết quả phân tích phƣơng sai với hàm mục tiêu là hiệu suất
thủy phân bằng axit sulfuric .................................................................... 65
Bảng 3.12. Kết quả phân tích thống kê sự phù hợp của các yếu tố ................ 66


8

Bảng 3.13. Các điều kiện ràng buộc của yếu tố ảnh hƣởng và hàm mục
tiêu ........................................................................................................... 68
Bảng 3.14. Giải pháp tối ƣu thuật toán đề nghị .............................................. 69
Bảng 3.15. Kiểm chứng kết quả theo mô hình và thực nghiệm...................... 69
Bảng 3.16. Kết quả tối ƣu hóa điều kiện thủy phân ........................................ 69
Bảng 3.17. Trọng lƣợng phân tử trung bình Mw (kDa) của
oligocarrageenan khi thủy phân bột carageenan (Mw = 454,5 kDa)
bằng axit ascorbic (C6H8O6) ở nồng độ và thời gian khác nhau, nhiệt
độ 90 OC ................................................................................................... 73
Bảng 3.18. Trọng lƣợng phân tử trung bình Mw (kDa) của
oligocarrageenan khi thủy phân bột carageenan (Mw = 454,5 kDa)
bằng axit sulfuric (H2SO4) ở nồng độ và thời gian khác nhau, nhiệt độ
90 OC ........................................................................................................ 75
Bảng 3.19. Một số dao động đặc trƣng của nhóm nguyên tử và các liên kết
trong phổ hồng ngoại của kappa carrageenan [62] .................................. 78
Bảng 3.20. Điều kiện thủy phân và tính chất của dịch oligo carrageenan ...... 80
Bảng 3.21. Chiều cao cây (cm) sau các đợt phun dịch chiết thủy phân rong
sụn Kappaphycus alvarezii từ axit ascorbic với nồng độ carbohydrat
trong dịch phun lá khác nhau ................................................................... 80
Bảng 3.22. Chiều cao cây (cm) sau các đợt phun dịch chiết thủy phân rong
sụn Kappaphycus alvarezii từ axit sulfuric với nồng độ carbohydrat
trong dịch phun lá khác nhau ................................................................... 82
Bảng 3.23. Giá trị trung bình của chiều cao cây (cm) và năng suất hạt của

bắp (tạ/ha) sau 3 đợt phun (60 ngày) với nồng độ carbohydrat trong
dịch phun lá khác nhau ............................................................................ 83


9

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của carrageenan................................................... 15
Hình 1.2. Cấu trúc của kappa carrageenan...................................................... 16
Hình 1.3. Cấu trúc của iota carrageenan ......................................................... 16
Hình 1.4. Cấu trúc của lamda carrageenan ..................................................... 16
Hình 1.5. Quá trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan............. 18
Hình 1.6. Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành
galactobiose ............................................................................................. 19
Hình 1.7. Thủy phân carrageenan bằng axit đậm đặc ..................................... 19
Hình 1.8. Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân carrageenan bằng enzyme,
trong đó các liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ. .................................... 19
Hình 1.9. Hình học tán xạ và dao động cƣờng độ tại máy dò......................... 33
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.................................................................... 44
Hình 2.2. Qui trình xử lý rong biển trƣớc khi chiết carrageenan .................... 45
Hình 2.3. Qui trình chiết carrageenan từ bột rong sụn Kappaphycus
alvarezii (Doty) Doty ............................................................................... 46
Hình 2.4. Sản phẩm bột oligo carrageenan trƣớc và sau khi thủy phân ......... 47
Hình 2.5. Qui trình thủy phân các loại axit theo nồng độ ............................... 47
Hình 2.6. Qui trình thủy phân các loại axit theo thời gian.............................. 48
Hình 2.7. Qui trình thủy phân các loại axit theo nhiệt độ ............................... 49
Hình 3.1. Hiệu suất thủy phân (%) theo carbohydrat tổng của các loại axit
theo nồng độ khác nhau, thời gian 90 phút, nhiệt độ 90 0C, 2 % (w/v)
bột carrageenan ........................................................................................ 55

10

Hình 3.2. Hiệu suất thủy phân theo carbohydrat tổng của các loại axit theo
thời gian, nhiệt độ ở 90 OC, 2 % (w/v) bột carrgeenan, nồng độ axit 0,2
M .............................................................................................................. 58
Hình 3.3. Hiệu suất thủy phân (%) theo carbohydrat tổng của các loại axit
theo nhiệt độ, thời gian 90 phút, 2% (w/v) bột carrageenan, nồng độ
axit 0,2M .................................................................................................. 61
Hình 3.4. So sánh giá trị từ thực nghiệm và từ mô hình dự đoán ................... 67
Hình 3.5. Đồ thị dạng 3D bề mặt đáp ứng và đƣờng đồng mức cho biết ảnh
hƣởng của hai yếu tố nồng độ axit và thời gian thủy phân đến hiệu suất
thủy phân bằng axit ascorbic (a, c) và axit sulfuric (b, d) ....................... 68
Hình 3.6. Quy trình đề xuất thủy phân carrageenan chiết từ rong sụn
Kappaphycus alvarezii bằng phƣơng pháp hóa học sử dụng xúc tác
axit ........................................................................................................... 71
Hình 3.7. Phổ GPC của mẫu carrageenan ....................................................... 73
Hình 3.8. Phổ GPC khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit
ascorbic (0,15 M, 85 phút, 90 OC) ........................................................... 74
Hình 3.9. Phổ GPC khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit
sulfuric (0,15 M, 85 phút, 90 OC) ............................................................ 74
Hình 3.10. Phổ hồng ngoại IR của mẫu carrgeenan ....................................... 76
Hình 3.11. Phổ hồng ngoại IR của mẫu oligo carrageenan khi thủy phân 2
% (w/v) bột carrageenan bằng axit ascorbic (0,15 M, 85 phút, 90 OC) .. 77
Hình 3.12. Phổ hồng ngoại IR của mẫu oligo carrageenan khi thủy phân 2
% (w/v) bột carrageenan bằng axit sulfuric (0,15 M, 85 phút, 90 OC).... 77


11

MỞ ĐẦU
Trong số các loại rong biển đƣợc nghiên cứu để phát triển thành các
dạng phân bón, rong sụn Kappaphycus alvarezii đƣợc đặc biệt quan tâm vì
thành phần dinh dƣỡng vƣợt trội cùng mức tăng trƣởng, khả năng đáp ứng tốt
của cây trồng. Hàng loạt các công bố trên thế giới đã khẳng định khả năng
kích thích sự phát triển của cây trồng, khả năng chống chịu bệnh và năng suất
tăng cao khi sử dụng phân bón từ rong sụn so với các loại rong khác và so với
đối chứng không sử dụng phân bón rong biển.
Carrageenan đƣợc chiết xuất từ rong sụn Kappaphycus alvarezii là
thành phần chủ yếu của thành tế bào rong, chiếm khoảng 40% trọng lƣợng
khô, chúng bao gồm galactose sulfate và trong một số trƣờng hợp còn có cả
anhydrogalactose. Carrageenan đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp
thực phẩm với các tính chất nhƣ tạo gel, làm dày, ổn định.
Carrageenan biến tính (trọng lƣợng phân tử thấp hay ở dạng oligo) từ
rong sụn Kappaphycus alvarezii đƣợc nghiên cứu ứng dụng trong mỹ phẩm,
dƣợc phẩm và phân bón. Oligo carrageenan với vai trò là phân bón sinh học
không chỉ bởi tác dụng của nó nhƣ một chất kích thích sinh trƣởng tự nhiên
mà còn có khả năng tăng sức đề kháng cho cây trồng chống lại sâu bệnh, sự
thay đổi của thời tiết.
Cũng nhƣ một số polysacchride khác, carrageenan có thể thủy phân hay
cắt mạch thành oligo bằng phƣơng pháp vật lý (chiếu xạ, dùng sóng siêu âm),
phƣơng pháp hóa học (tác nhân axit, bazơ, tác nhân oxy hóa...) hay phƣơng
pháp sinh học (enzyme) với những ƣu/nhƣợc điểm riêng.
Một trong những hạn chế của phƣơng pháp hóa học là thƣờng tạo ra
các sản phẩm phụ trong quá trình thủy phân. Tuy nhiên, thủy phân bằng axit
lại có một số lợi thế về tốc độ phản ứng nhanh, giá thành rẻ và nguồn hóa chất
dễ có hơn. Với mục tiêu xây dựng quy trình thủy phân phù hợp nhằm sử dụng
rong sụn làm chất kích thích sinh trƣởng trong nông nghiệp, phƣơng pháp
thủy phân bằng axit đƣợc xem là phƣơng pháp thích hợp để thủy phân rong

sụn Kappaphycus alvarezii.


12

Các oligosaccharide của carrageenan điều chế bằng việc thủy phân axit
hoặc bẽ gãy mạch bằng enzyme là các chất sinh học kích thích sinh trƣởng,
thụ tinh, các chất này có khả năng kích thích cho sự tích lũy dinh dƣỡng và tái
tạo lại sức sản xuất, dẫn đến sự thụ phấn cho hoa và tạo quả tốt hơn. Các
oligosaccharide sulphat đã đƣợc công nhận để kích thích cho cơ chế bảo vệ
cây, do đó oligocarrageenan có thể sử dụng nhƣ một chất tăng trƣởng tự
nhiên.
Đặc trƣng chất lƣợng của dịch sau thủy phân phụ thuộc nhiều vào các
điều kiện thủy phân nhƣ nồng độ axit, nhiệt độ và thời gian. Do đó, “Xác
định hiệu suất, đặc trưng tính chất của dịch oligo carrageenan từ rong sụn
Kappaphycus alvarezii thủy phân bằng axit” đƣợc chọn là đề tài luận văn
nhằm đƣa ra quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích sử dụng sản phẩm từ
rong sụn làm chất kích thích sinh trƣởng cho cây trồng.
Mục tiêu của luận văn
Xác định hiệu suất chiết, trọng lƣợng phân tử và đặc trƣng cấu trúc của
oligo carrageenan thu đƣợc bằng phƣơng pháp thủy phân rong sụn trong axit
vô cơ (axit sulfuric) và axit hữu cơ (axit ascorbic) ở các điều kiện khác nhau
(nồng độ axit, nhiệt độ, thời gian), từ đó đƣa ra quy trình thủy phân phù hợp
cho mục đích làm chất kích thích sinh trƣởng trong nông nghiệp.
Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao
gồm:
- Khảo sát hiệu suất thủy phân ở các điều kiện thủy phân khác nhau.
- Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân với hiệu suất thủy phân tối ƣu.
- Phân tích trọng lƣợng phân tử trung bình và đặc trƣng cấu trúc của
dịch oligo carrageenan thu đƣợc sau quá trình thủy phân.

- Thử nghiệm hiệu quả kích thích sinh trƣởng của dịch chiết oligo
carrageenan trên cây ngô.


13

1CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. RONG SỤN
1.1.1. Giới thiệu về rong sụn
Rong sụn thuộc ngành Tảo hồng (Rhodophyta), phân lớp:
Rhodophyceae,
bộ:
Gigartinales,
họ:
Solieriaceae,
giống:
Kappaphycus, loài: alvarezii, trong đó loài Kappaphycus alvarezii (Doty)
Doty là loài có sản lƣợng lớn nhất [1].
Macxxell Doty là ngƣời đầu tiên tìm thấy rong sụn ở vùng biển
Philippines vào năm 1972. Ngƣời có công thu mẫu cùng với ông là Alvarezii,
do vậy Macxxell Doty đã đặt tên rong này là Euchuma alvarezii Doty. Khi
phân tích thành phần hóa học của rong này ông đã đổi tên Echuma alvarezii
Doty thành Kappaphycus alvarezii. Sau đó ông cùng với các nhà nghiên cứu
tại trƣờng đại học Hawaii bắt đầu nghiên cứu phát triển phƣơng pháp nuôi
trồng rong sụn ở Hawaii. Từ đó, rong sụn đƣợc nuôi trồng và phát triển rộng
rãi ở nhiều nƣớc nhƣ Indonesia, Malaysia, Ấn Độ, Việt Nam …
Rong sụn đƣợc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang di
nhập từ Philipines về Việt Nam vào tháng 3 năm 1993, và đƣợc nhân giống
nghiên cứu các đặc tính sinh học, giải pháp kỹ thuật và mô hình trồng rong
Sụn ở các loại thủy vực khác nhau của nƣớc ta.

1.1.2. Thành phần hóa học của rong sụn
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rong sụn [2]
Tên thành phần hóa học

% (khối lƣợng)

Protein

2,4

Cellulose

4,0

Ẩm

19,4

Tro tổng

20,0

Carrageenan

40,0

Thành phần khác

14,2

14

Khi ở dạng tƣơi, rong sụn thƣờng có màu xanh hoặc màu xanh đỏ nâu
do trong rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu
xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll. Đây là loài đơn trụ bao
gồm 2 phần:
Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn.
Xung quanh có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thƣớc lớn, hình tròn hay
hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dƣỡng (car).
Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hình
bầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố. Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa
cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lƣợng rong khô, đóng vai trò bảo vệ các
lớp bên trong.
Thành phần hóa học chính của rong sụn là carrageenan có thể chiếm
đến 40% trọng lƣợng khô. Trong đó, carrageenan tan chiếm khoảng 33%,
carrageenan không tan chiếm 7%.
1.2. TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN
1.2.1. Giới thiệu chung về carrageenan
Carrageenan là một loại colloid thuộc nhóm phycocolloid cùng với agar
và alginat. Carrageenan đƣợc chiết xuất từ rong biển đỏ có cấu trúc là một
polysaccharite. Carrageenan đã đƣợc biết đến từ rất lâu đời ở các nƣớc
phƣơng Tây. Vào những năm 1842-1862, các nhà khoa học đã phát hiện ra
carrageenan có trong một loài tảo đỏ có tên là Chondrus cripus và loài Irish
moss thuộc họ Rhodophyceae, nhƣng những khám phá của họ còn thô sơ,
chƣa xác định đƣợc những tính chất cũng nhƣ đặc điểm của nó. Mãi đến
những năm khi chiến tranh thế giới thứ nhất bùng nổ, khi mà nhu cầu chiết
xuất gelatin để phục vụ quân đội trở nên cấp thiết đòi hỏi cần phải có chất
thay thế, rất nhiều các nghiên cứu đã đƣợc tiến hành và cuối cùng carrageenan
đã đƣợc tìm ra [3].

Tên Carrageenan hay Carrageenan – irish moss là tên của một thị trấn
ven biển Irish thuộc Carrageenan. Cùng với sự tiến bộ về khoa học kỹ thuật


15

cũng nhƣ thiết bị hiện đại, ngày nay chúng ta đã khám phá ra những điều hữu
ích mà carrageenan đã mang lại. Từ những loài tảo đỏ (Rhodophyceae) ngƣời
ta đã phát hiện ra nhiều loại carrageenan khác nhau, bao gồm: kappacarrageenan, lamda-carrageenan, iota-carrageenan [4].
Carrageenan là một polysaccharide dị thể của galactose –galactan.
Ngoài mạch polysaccharide chính còn có thể có các nhóm sulfat đƣợc gắn vào
carrageenan ở những vị trí và số lƣợng khác nhau. Vì vậy, carrageenan không
chỉ là một polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc nhất định mà là các galactan
sulfat. Mỗi galactan sulfat là một dạng riêng của carrageenan và có ký hiệu
riêng. Ví dụ: λ – , κ –, ι –, ν – carrageenan [4]

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của carrageenan [5]
1.2.2. Phân loại
Phần lớn các carrageenan có phân tử lƣợng từ 500 – 1000 kDa, nhƣng
trong đó chúng có thể chứa tới 25% polysaccharide với phân tử lƣợng nhỏ
dƣới 100 kDa. Carrageenan có cấu trúc chung là một polymer mạch thẳng với
liên kết luân phiên của β-D-galactopyranora qua liên kết 1,3 và α-D
galactopyranora qua liên kết 1-4 [6]. Các công trình nghiên cứu bằng phƣơng
pháp cộng hƣởng từ hạt nhân cho thấy carrageenan có nhiều cấu trúc hóa học
khác nhau [7]. Do đó, phân loại theo cấu trúc hóa học có các loại carrageenan
sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta và xi. Các loại này chỉ khác nhau ở mức
độ sulphat hóa, vị trí sulphat hóa, mức độ dehydrat hóa của chuỗi
polysacharide. Cấu trúc của chúng đều có những thành phần về số lƣợng
sulphat của carrageenan chiếm 18 ÷ 40 % phân tử carrageenan.

16

1.2.3. Cấu trúc
Kappa-carrageenan: là một loại polymer mạch ngắn xen kẽ giữa Dgalactose-4- sulphat (Gal S) và 3,6 – Anhydro-D-galactose (GalA). Cấu trúc
phân tử kappa carrageenan là một vòng xoắn kép bậc 3

Hình 1.2. Cấu trúc của kappa carrageenan
Iota-carrageenan: cũng giống nhƣ kappa-carrageenan nhƣng gốc 3,6Anhydrogalactose lại ở vị trí cacbon thứ 2. Iota –carrageenan là carrageenan
có nhóm SO42- nhiều nhất trong mạch phân tử, cấu trúc là vòng xoắn kép bậc
2. Gel iota- carrageenan có tính đàn hồi.

Hình 1.3. Cấu trúc của iota carrageenan
Lamda-carrageenan: trong mạch phân tử, các đơn vị monomeric đƣợc
xen kẽ với nhau: đơn vị D-galactose-2-sulphat (1,3) và D-galactose 2,6disulphat

Hình 1.4. Cấu trúc của lamda carrageenan
Các phân đoạn này đều có tính đa phân tán nhƣng chúng khác nhau về
thành phần ester sulphat và gốc quay quang. Lamda-carrageenan có khối


17

lƣợng phân tử cao và mạch dài hơn kappa-carrageenan. Thành phần của phân
đoạn này cũng phụ thuộc vào nhiệt độ chiết và loại nguyên liệu.
1.2.4. Đặc trƣng hóa học của carrageenan từ rong sụn Kappaphycus
alvarezii
Đối với carrageenan có một quá trình lƣu ý là chuyển carrageenan từ
nhóm cấu trúc không có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose thành nhóm
cấu trúc có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose [8]. Ví dụ: µ-, νcarrageenan đƣợc xem là tiền thân của κ- và ι- carrageenan, quá trình chuyển

nhóm cấu trúc này đƣợc thực hiện trong môi trƣờng kiềm mạnh. Sự hình
thành liên kết cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose trong tự nhiên đƣợc xúc
tác bởi các enzyme sulphohydrolase [9].


18

Hình 1.5. Quá trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan [8]
1.2.5. Oligo Carrageenan và ứng dụng
1.2.5.1. Oligo carrageenan
Oligo carrageenan là mạch carrageenan đã bị cắt ngắn mạch khi thủy
phân carrageenan của các cấu trúc kappa, lamda và iota. Những oligo
carrageenan này bao gồm khoảng 20 đơn vị galactose sulphat liên kết luân
phiên bởi liên kết glycoside β-1,4- và α-1,3- với nhóm sulphat ở vị trí 2, 4 và
6 của vòng galactose có hoặc không có đơn vị anhydrogalactose [10].
Carrageenan rất dễ bị axit và chất oxy hóa bẻ gãy các liên kết. Khi thủy
phân bằng axít yếu, các liên kết glycoside α-l,3- bị phá vỡ, tạo thành các
mảnh carrabiose. Mảnh carrabiose chính là galactose nên gọi là galactobiose
(Hình 1.6).


19

Hình 1.6. Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành
galactobiose
Trong trƣờng hợp thuỷ phân bằng axít đậm đặc, lực ion lớn không
những liên kết glycoside α- l,3- bị phá vỡ mà cả liên kết glycoside β-1,4- cũng
bị phá vỡ.

Hình 1.7. Thủy phân carrageenan bằng axit đậm đặc [11]

Khi thuỷ phân bằng enzyme, liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ, sản
phẩm đƣợc tạo thành là neocarrabiose (Hình 1.8). Khi thủy phân bằng
enzyme, do có tính lựa chọn cao nên cần phải lựa chọn các enzyme cho phù
hợp.

Hình 1.8. Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân carrageenan bằng enzyme,
trong đó các liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ.


20

1.2.5.2. Ứng dụng của oligo carrageenan
 Ứng dụng trong thực phẩm và y học
Carrageenan đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc
sống, nhƣ là tác nhân kháng ung thƣ, sản phẩm nhiên liệu sinh học, phụ gia
tẩy rửa, trong ngành công nghiệp dệt và trong nhiều lĩnh vực khác; tuy nhiên
sản phẩm sau thủy phân carrageenan là oligo carrageenan có những ứng dụng
giới hạn và đang đƣợc các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc nghiên cứu. Một
số công trình nghiên cứu về ứng dụng của oligo carrageenan đã đƣợc giới
thiệu và công bố, theo kết quả nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ, Bùi Huy
Chích [5] sử dụng enzym Alpha-amylase Novo (hay còn gọi là Termamyl Te) cho quá trình thủy phân carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii
(Doty) Doty với các điều kiện thủy phân [Te]=0,2 %; [carrageenan]=0,75 %;
pH=6,5; t0=80 0C; [Ca2+]=40 ppm; thời gian= 9 giờ. Sản phẩm sau thủy phân
là oligo carrageenan có khối lƣợng phân tử trung bình là 51.885 Da và đƣợc
ứng dụng để sản xuất nƣớc uống trà hòa tan. Theo bảng đánh giá thị hiếu
trong kết quả nghiên cứu của luận văn cho thấy “sản phẩm được người tiêu
dùng hài lòng và ưa thích so với sản phẩm trà hòa tan Atiso Vĩnh Tiến Đà Lạt
trên thị trường qua phép thử thị hiếu cho điểm”.
Một nghiên cứu về ứng dụng của oligo carrageenan là có thể dùng làm
các chất phụ gia chế biến và bảo quản thực phẩm có hiệu quả để thay thế hàn

the đƣợc Vũ Ngọc Ban và cộng sự [12] công bố, điều kiện cho quá trình thủy
phân carrageenan ở pH ban đầu = 1,0 – 1,5 với axit HC1 1N, nhiệt độ 60 °C
với thời gian thủy phân là 120 phút. Với việc sử dụng phƣơng pháp đo độ
nhớt, khối lƣợng phân tử trung bình của carrageenan đƣợc xác định là 27,7
kDa. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng khi sử dụng oligo carrageenan với hàm
lƣợng 0,3 % cho kết quả tƣơng đƣơng với hàn the hàm lƣợng 0,5 %.
Trong luận án tiến sĩ vào năm 2017, Bùi Huy Chích [13] đã khảo sát và
nghiên cứu ứng dụng oligo carrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng sử
dụng enzyme polysaccharase để thủy phân carrageenan thành oligo
carrageenan: nồng độ carrageenan 1 %, nồng độ enzyme Termamyl 120 L 0,5
%, nhiệt độ 85 0C, pH = 6,5 và thủy phân trong 16 giờ. Sản phẩm oligo


21

carrageenan thu đƣợc có từ 2 đến 10 monose và có khối lƣợng phân tử trung
bình nhỏ hơn carrageenan khoảng 132 lần. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi
bổ sung oligo carrageenan 0,2 % vào surimi cá đổng có thể làm tăng chất
lƣợng, tăng tính ổn định, hạn chế biến đổi chất lƣợng của surimi trong quá
trình bảo quản đông.
Một nghiên cứu khác trong lĩnh vực y học của Haijn và cộng sự (2003)
[14] cho thấy carrageenan oligosacarit có trọng lƣợng phân tử 1.726 Da, khi
dùng đƣờng uống với liều 100 mg/kg ở chuột thì sự hình thành khối u bị ức
chế rõ rệt. Tuy nhiên, hoạt tính chống khối u của carrageenan có sulfonated
cao ít hơn nhiều so với chế phẩm không sulfonated hoặc sulfonated nhẹ. Hoạt
tính của các superoxide dismutase và catalase đƣợc tăng cƣờng đáng kể, điều
này cho thấy carrageenan oligosacarit có hiệu quả trong việc thúc đẩy khả
năng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do.
 Phân bón từ oligo carrageenan có trọng lượng phân tử thấp
Rong biển chứa rất nhiều chất dinh dƣỡng cần thiết cho cây trồng.

Trong quá trình canh tác nông nghiệp trƣớc kia rong biển thƣờng đƣợc sử
dụng dƣới dạng bột nghiền, nhƣng hiệu quả sử dụng không cao do vậy ít đƣợc
chú ý. Khi khoa học phát triển, kỹ thuật tách chiết các chất dinh duỡng trong
rong biển phát triển, việc sử dụng rong biển làm chất dinh dƣỡng cho cây
trồng tăng lên nhiều. Tuy vậy, do các thành phần dinh dƣỡng chính nhƣ N, P
và K không nhiều, đặc biệt là các vi lƣợng kim loại không đủ do vậy khi sản
xuất phân bón cho cây trồng ngƣời ta thƣờng sử dụng thêm vi lƣợng kim loại
và sử dụng đồng thời với các chất dinh dƣỡng chiết xuất bằng phƣơng pháp
thủy phân các chất giàu protein và khoáng chất, vitamin khác nhƣ cá biển,
cám, đỗ tƣơng. Các sản phẩm phân bón sử dụng dung dịch chiết xuất từ rong
biển làm 1 trong các nguyên liệu chính thƣờng đƣợc sản xuất ra dƣới dạng
khô bao gồm dạng bột và hạt nhƣng phần lớn ở dạng lỏng và dùng chính để
phun qua lá. Trên thị trƣờng phân bón thế giới đã xuất hiện phân bón lỏng
hữu cơ sản xuất từ các nguyên liệu chính là rong biển, cá biển và nhiều loại đã
đƣợc cấp chứng chỉ để sử dụng làm phân bón trong nông nghiệp hữu cơ.