NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. BIA VÀ CÁC SẢN PHẨM BIA.
1.1 Khái niệm bia:
Bia là một loại nước uống chứa cồn được sản xuất bằng quá trình lên men của
đường trong môi trường lỏng và nó không được chưng cất sau khi lên men. Nói
một cách khác, bia là loại nước giải khát có độ cồn thấp, bọt mịn xốp và có hương
vị đặc trưng của hoa houblon. Đặc biệt CO 2 hòa tan trong bia có tác dụng giải nhiệt
nhanh, hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa. Ngoài ra trong bia còn chứa một lượng
vitamin khá phong phú (chủ yếu là vitamin nhóm B như vitamin B1, B2, PP…).
Nhờ những ưu điểm này, bia được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế
giới với sản lượng ngày càng tăng. Đối với nước ta, bia đã trở thành loại đồ
uống quen thuộc với sản lượng ngày càng tăng và đã trở thành ngành công
nghiệp mũi nhọn trong ngành công nghiệp nước ta.
Quá trình sản xuất bia được gọi là nấu bia. Do các thành phần sử dụng để
sản xuất bia có khác biệt tùy theo từng khu vực, các đặc trưng của bia như
hương vị và màu sắc cũng thay đổi rất khác nhau.

[16]

1.2. Lịch sử phát triển ngành sản xuất bia:
Sản xuất bia là một ngành công nghiệp thực phẩm có bước phát triển nhanh
chóng mặc dù trải qua nhiều thăng trầm của thời gian, công nghệ - kĩ thuật và nhận
thức của cộng đồng. Xét về nguồn gốc, bia có xuất xứ từ các sản phẩm Nông
nghiệp. Các chứng cứ cho thấy rằng bia được pha chế tại xung quanh vùng Lưỡng
Hà khoảng 6000 đến 7000 năm trước. Người Ai Cập cổ đại đó ủ rượu, bia bằng các
loại ngũ cốc của họ (lúa miến), việc này cũng được thưc hiện trong những bộ lạc
người châu Phi.. Từ thế kỷ thứ 10 trong giai đoạn này việc sử dụng thảo dược rất
phổ biến và người Đức đó sử dụng Houblon trong sản xuất bia sau đó Houblon

được phổ biến toàn Châu âu. Ban đầu việc sử dụng Houblon bị chống đối kịch liệt
nhưng những lợi ích mà Houblon mang lại cho sản phẩm bia như hương thơm và
nhất là khả năng kháng khuẩn của chúng đã làm cho chúng dần dần được chấp nhận

3


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

rộng rãi. Đến khoảng thế kỉ 17 những loại bia không sử dụng Houblon hoàn toàn
biến mất thế vào đó là sự đa dạng của các sản phẩm bia, tùy thuộc vào vùng nguyên
liệu và điều kiện khí hậu mà cho ra những loại bia có nét đặc trưng riêng. Nguyên
liệu chủ yếu để sản xuất bia là lúa đại mạch tuy nhiên cũng có thế thay thế bởi
nguyên liệu khác như yến mạch, lúa mì, gạo…Trong thời gian này việc đánh thuế
của một số địa phương trên sản phẩm bia là rất cao và bia chỉ được bán trong những
quán rượu. Năm 1516 một đạo luật ra đời tại Reinheitsgebot nhằm bảo hộ cho sản
phẩm bia của Đức có tên “Luật độ thuần khiết của sản phẩm bia Đức”, các chỉ tiêu
về Đại mạch, Houblon và nước để sản xuất bia được nêu ra cụ thể. Nấm men cũng
được đưa vào danh sách khi chúng có nguồn gốc rõ ràng (định danh).
Đến thế kỉ 18 thì có những chuyển biến lớn trong ngành sản xuất bia với sự
phát triển của ngành sinh hóa và vi trùng học. Trong thời gian này bia thường được
chứa nhiều tháng trong những thùng lớn trước khi đem đi tiêu thụ. Đây là biện pháp
kéo dài thời gian ủ chín (lên men phụ) nhằm khắc phục nhược điểm của việc lên
men bằng chủng nấm men Brettanomyces là chủng tạo ra acid béo và ester ethyl với
mức độ cao vượt ngưỡng cho phép gấp 10 lần mặc dù nồng độ cồn do chủng này
tạo ra cao hơn so với các chủng khác. Bên cạnh đó việc áp dụng cơ giới hóa vào sản
xuất đó không ngừng nâng cao sản lượng bia sản xuất lên rất nhiều.
Tổng sản lượng bia toàn thế giới năm 1910 là 100 triệu hl, đến năm 1995 là
1190 triệu hl và đến năm 2003 đạt 1444 triệu hl. Nhìn chung sản lượng bia trên thế

giới tăng trưởng nhanh nhưng lại phân bố không đều giữa các châu lục, tập trung ở
Châu Âu và Châu Mỹ. Bên cạnh đó sản lượng bia ở những khu vực khác trong
những năm gần đây cũng tăng trưởng khá nhanh, đặc biệt là các nước Châu Á, đó
đứng thứ 3 trên thế giới sau Châu Âu và Châu Mỹ. Hiện nay ở Châu Á, Trung
Quốc là nước thị trường rộng lớn nhất và là thị trường đang phát triển mạnh nhất,
tiếp theo là Nhật Bản nhưng ở mức độ vừa phải từ những năm 1990 trở lại đây.
Ở Việt Nam, ngành công nghiệp sản xuất bia có lịch sử hơn 100 năm.
Xưởng sản xuất bia đầu tiên được đặt tên là xưởng sản xuất bia Chợ Lớn, do
một người Pháp tên là Victor Larue mở vào năm 1875, là tiền thân của nhà
máy bia Sài Gòn, nay là Tổng công ty Bia Rượu Nước giải khát Sài Gòn. Ở

4


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

miền Bắc, vào năm 1889, một người Pháp tên là Hommel đó mở xưởng bia ở
Làng Đại Yên, Ngọc Hà, sau trở thành nhà máy bia Hà Nội, nay là Tổng công
ty Bia Rượu Nước giải khát Hà Nội. Trong quá trình hình thành và phát triển,
ngành sản xuất bia đó đạt mức tăng trưởng cao vào những năm của thời kỳ mở
cửa. Cùng với quá trình hội nhập, ngành sản xuất bia phát triển về quy mô và
trình độ công nghệ, trở thành một ngành công nghiệp có thế mạnh khi Việt Nam
gia nhập tổ chức WTO.

Hình 2.1: Mức tiêu thụ bình quân đầu người qua các năm

Việc đầu tư xây dựng các nhà máy bia được triển khai mạnh mẽ từ
những năm 1990 trở lại đây. Số các nhà máy bia là 469 vào năm 1998 với các
quy mô khác nhau từ 100.000 lít/năm đến 100 triệu lít/năm. Mức tiêu thụ

bình quân đầu người tăng lên nhanh chóng trong vòng 10 năm qua từ mức
dưới 10 lít/người năm vào năm 1997 đó đạt mức 18 lít/người.năm vào năm
2006.
Theo số liệu thống kê của Bộ Công nghiệp (nay là Bộ Công Thương) tổng
sản lượng bia của Việt Nam qua 5 năm gần đây thể hiện trong hình 1. 2. Mặc
dù, đến năm 2005 số cơ sở sản xuất chỉ còn 329, nhưng quy mô của các doanh
nghiệp đó tăng lên. Số liệu thống kê cho thấy trong ngành sản xuất bia có 3
doanh nghiệp có sản lượng trên 100 triệu lít/năm là Sabeco (năng lực sản xuất
trên 300 triệu lít/năm), Habeco (trên 200 triệu lít/năm) và công ty liên doanh nhà
máy bia Việt Nam (trên 100 triệu lít/năm). Có 15 doanh nghiệp bia có công suất
lớn hơn 15 triệu lít và 19 doanh nghiệp có sản lượng sản xuất thực tế trên 20
triệu lít. Khoảng 268 cơ sở còn lại có năng lực sản xuất trên dưới 1 triệu lít/năm.

5


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Hình 2.2 : Sản lượng bia cả nước qua các năm

Theo lộ trình phát triển dự kiến đến năm 2010 cả nước sẽ sản xuất
khoảng 2,5 – 3 tỷ lít bia và mức tiêu thụ bình quân đầu người khoảng 28-30
lít/người/năm. Với tốc độ phát triển nhanh hiện nay, nhiều nhà máy bia mô lớn
đang được đầu tư và cũng kéo theo nhiều vấn đề quan trọng về sử dụng nguồn
nguyên liệu, khoa học kĩ thuật và các phuơng pháp di truyền, lai tạo giống nấm
men cho hiệu quả sản xuất cao và chất lượng bia tốt hơn. [2]

1.3. Tính chất chung của bia
Bia thông thường có những thành phần cơ bản sau đây

1.3.1 Chất hòa tan (chất trích ly)
Chiếm 3,5 ÷ 5,0% trọng lượng bia.
Chất hòa tan (chất trích ly) trong bia tuy chiếm một hàm lượng không lớn,
song do sự phong phú về thành phần hóa học mà có tính chất quyết định đến chất
lượng của bia. Cụ thể trong chất hòa tan (chất trích ly) của bia sẽ gồm có:
1.3.1.1 Hydrat cacbon : Chiếm 80 ÷ 85% chất hòa tan trong bia. Trong số
này, riêng maltose và maltotriose chiếm khoảng 60 ÷ 70%, còn lại là các đường
khác như glucose, saccarose, pentose, arabinose, xylose,…
1.3.1.2 Protein : Chiếm 6 ÷ 9% chất hòa tan trong bia (khoảng 700 mg/l các
chất chứa Nitơ). Trong đó:
- 140 mg/l protein có phân tử lượng cao.
- 120 mg/l protein có phân tử lượng trung bình.
- 440 mg/l protein có phân tử lượng thấp.
1.3.1.3 Glyceryl :

6


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Chiếm 3 ÷ 5%, là sản phẩm phụ hình thành khi lên men (khoảng 1200 ÷ 1600
mg/l).
1.3.1.4 Các chất tro:
Chiếm 3 ÷ 4% trọng lượng chất hòa tan, tức khoảng 1,4 ÷ 1,8g/l. Trong đó
30% là photphat, còn lại là clorit, silicat, các cation như K+, Na+, Ca+, Mg2+,…
1.3.1.5 Các chất đắng – tanin (chát) – màu:
- Hàm lượng chất đắng (đơn vị EBC): Khoảng 15 ÷ 20 mg/l theo izo – α –
acid và α - acid đắng.
- Khoảng 150 mg/l tanin. Trong đó 2/3 từ malt; 1/3 từ hoa houblon.

- Hàm lượng các chất màu:
+ 50 ÷ 70 mg/l antocyanuagen.
+ 10 ÷ 12 mg/l catechine.
+ 10 ÷ 40 mg/l tannoide.
1.3.1.6 Các acid hữu cơ:
Chiếm 0,7 ÷ 1,0% trọng lượng chất hòa tan của bia tức khoảng 300 ÷ 400
mg/l, trong đó:
+ 50 ÷ 70 mg/l pyruvat.
+ 170 ÷ 220 mg/l citrate
+ 30 ÷ 110 mg/l malat.
+ 30 ÷ 100 D - và L - lactate.
1.3.1.7 Các vitamin:
Tuy hàm lượng rất nhỏ song cũng khá đa dạng: B 1, B2, B6, biotin, nocotinamit,
acid pantotenoic.
Với các sản phẩm bia, vị có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng. Vị tùy thuộc
vào các nguyên liệu đầu vào như: malt, hoa houblon, nước, nấm men và các quá
trình công nghệ tạo nên malt và bia. Yếu tố O 2 gây ảnh hưởng mạnh nhất lên tính ổn
định của vị bia. Các quá trình oxy hóa sẽ làm ảnh hưởng tới các tính chất sau: độ ổn
định hóa - lý, sự nhạy cảm với nhiệt độ, màu sắc, vị đắng, độ ổn định của vị, thời
gian sử dụng. Giới hạn gây hại của O2 đối với bia như sau:
 < 0,6 mg O2/l: Đối với các loại bia nhạy cảm.

7


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

 ≥ 1,0 mg O2/l: Bắt đầu gây hại ở nhiệt độ cao.
 ≥ 2,0 mg O2/l: Gây hại rõ ràng trong thời gian ngắn.

1.3.2 Các chất dễ bay hơi
- Etanol: 3,4 ÷ 4,5% trọng lượng bia.
- Acid carbonic: 0,35 ÷ 0,55% trọng lượng bia.
- Nước: 90 ÷ 92% trọng lượng bia.[1][5][6]

1.4. Vai trò của bia:
Bia là một loại thức uống mát, bổ với vị đắng dễ chịu và hương thơm đặc
trưng, độ cồn thấp. Với bia, khi sử dụng đúng mức sẽ mang đến cho con người sự
sảng khoái, dễ chịu và tăng sức đề kháng cho cơ thể.
Hàm lượng nước: có thể chiếm 90% trong bia, với hàm lượng nước nâng cao,
bia sẽ giúp giải khát tốt cho người sử dụng, khi uống vào CO 2 trong bia sẽ thoát ra
cho ta cảm giác mát lạnh ở lưỡi.
Chất khoáng: trong bia có khoảng hơn 30 loại chất khoáng mà chủ yếu được
trích ly từ malt như: Mg, P, K…Ngoài ra bia còn chứa một lượng thấp của Na và Ca
giúp giảm nhanh cơn khát.
Vitamin: bia chứa hầu hết các vitamin nhóm B (B2, B6, PP), một ít nhóm A, D
và E, các vitamin kể trên là cần thiết đối với con người.
Polyphenol: có khoảng 150mg/l bia. Nó giúp chống lại các nguy cơ về bệnh
tim mạch và ung thư.
Cacbon dioxit (CO2): ngoài việc làm cho bia có cảm giác thơm ngon, nó còn
làm tăng khả năng bài tiết nước tiểu, tăng khả năng tiêu hóa của cơ thể.
Năng lượng: 1 lít bia khi uống sẽ cung cấp cho con người một lượng từ 500 –
600 calori.[1][5][6]

1.5 Phân loại bia:
1.5.1 Phân loại theo tính chất
Có nhiều loại bia khác nhau, mỗi loại bia được coi là thuộc về một kiểu bia cụ
thể nào đó. Yếu tố chính để xác định loại bia là men bia sử dụng trong quá trình lên
men. Phần lớn kiểu bia thuộc về một trong hai họ lớn: ale- sử dụng lên men nồi

8


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

hoặc lager- sử dụng lên men chìm. Bia có đặc trưng pha trộn của cả ale va lager
được coi là bia lai. Đồ uống chứa cồn sản xuất từ việc lên men đường thu được từ
các nguồn không phải là ngũ cốc, nói chung không được gọi là “bia”, mặc dù chúng
cũng được sản xuất bằng cùng một phản ứng sinh học gốc men bia. Mật ong lên
men được gọi la rượu mật ong, nước táo lên men được gọi là rượu táo, nước lê lên
men được gọi là rượu lê, còn nước nho lên men được gọi là rượu vang.
Ale: Ale là bất kỳ loại bia nào được sản xuất bằng lên men nổi, và nó thông
thường được lên men ở nhiệt độ cao hơn so với bia lager (15-23 0C). Các men bia ale
ở nhiệt độ này tạo ra một lượng đáng kể ester, các hương liệu thứ cấp và các sản
phẩm tạo mùi khác, và kết quả là bia tạo ra có mùi vị của hoa hay quả tương tự. Các
khác biệt về kiểu giữa các loại ale là nhiều hơn so với các loại lager, và nhiều loại
bia ale rất khó để phân loại chúng.[15]
Lager: Lager là loại bia được
tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới.
Chúng có nguồn gốc từ vùng Trung
Âu. Men bia lager là loại lên men
chìm, thông thường được lên men ở
nhiệt độ 7-120C (45-550F), và sau đó
được lên men thứ cấp lâu ở 0-40C

Bia đen porter Zywiec

Bia vàng Hoavener

Hình2.3 : Bia Lager

0

(30-40 F). Trong giai đoạn lên men
thứ cấp, lager được làm trong và chín. Các điều kiện lạnh cũng kiềm chế việc sản
xuất tự nhiên các ester và các phụ phẩm khác, tạo hương vị “khô và lạnh hơn” của
bia.[15]
Loại bia hỗn hợp: Kiểu bia lai hay bia hỗn hợp sử dụng các nguyên liệu và
công nghệ hiện đại hoặc bổ sung càc khía cạnh truyền thống của sản xuất bia. Mặc
dù có một số biến thái giữa các nguồn khác nhau, nhưng nói chung bia hỗn hợp có
thể là:





Bia rau quả là hỗn hợp với một số loại phụ gia từ hoa quả có thể lên men
trong quá trình lên men, tạo ra chất lượng hài hòa một cách rõ nét.
Bia thảo mộc và bia gia vị bổ sung các chất chiết ra từ rễ, hạt, lá, hoa hay
quả thảo mộc hoặc các loại cây gia vị thay vì bổ sung hoa bia.

9


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH


Các loại bia tồn trữ trong các thùng gỗ là các loại bia truyền thống hay

thực nghiệm đưởc lưu trữ trong các thùng gỗ hoặc được tiếp xúc với gỗ
trong một khoảng thời gian. Thông thường, thùng gỗ hay các miếng gô
đầu tiên được xử lý bằng một số loại rượu mạnh hay các đồ uống chứa



cồn.
Bia hun khói là bất kỳ loại bia nào mà mạch nha của nó đã được hun
khói. Thông thường các loại bia này có mùi và hương vị của khói. Điển



hình của kiểu bia truyền thống này là bia Rauchbiers.
Bia đặc biệt là cách gọi chung để chỉ các loại bia được sản xuất mà sử
dụng các nguồn đường, hạt ngũ cốc và tinh bột có thể lên men không

thông dụng.[15]
1.5.2 Phân loại theo hình thức
Trên thị trường có 3 loại bia chủ yếu: Bia tươi, bia chai/lon, bia hơi.
 Bia tươi: là sản phẩm lên men có bão hòa CO2 tự nhiên, bia tươi có qua
quá trình thanh trùng nhưng ở nhiệt độ thấp hơn so với nhiệt độ thanh
trùng và thời gian ngắn hơn so với bia chai/lon. Bia tươi có màu sắc,
hương vị nguyên thủy của sản phẩm sau lên men. Bia tươi không bảo
quản được lâu.
 Bia chai/lon: là bia có qua quá trình thanh trùng ở nhiệt độ cao và thời
gian dài, chất lượng bia tương đối do có sử dụng thế liệu nhưng không
nhiều (70% malt, 30% gạo). Bia chai/lon bảo quản được lâu.
 Bia hơi: là bia không qua quá trình thanh trùng, chất lượng bia thấp hơn
so với bia tươi và chai/lon, do sử dụng nhiều thế liệu và lượng CO 2 phải
nạp từ bên ngoài vào.

Hình 2.4 : một số loại bia lon trên thị trường

2. PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN BIA.

10


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

2.1 Làm trong bia:
Trong quá trình lên men phụ và tàng trữ, bia đã được lam trong một cách tự
nhiên nhưng chưa đạt đến mức độ cần thiết. Màu đục của bia được lý giải bằng sự
hiện diện của nấm men, của các hạt phân tán cơ học, của các hạt dạng keo, của phức
chất protein- polyphenol, của nhựa đắng và của nhiều loại hạt li ti khác. Tất cả các
cấu tử này sẽ góp phần làm giảm độ bền của bia nếu chúng cứ tồn tại trong đó. Vì
vậy muốn làm tăng độ bền của bia, với mục đích là tăng thời gian bảo quản khi
chúng lưu hành trên thị trường, cần phải lại bỏ tất cả những cấu tử gây đục cho bia,
bằng phương pháp nhân tạo. Có hai giải pháp để lam trong bia: lọc và ly tâm.
Nguyên tắc lọc bia được xây dựng trên hai quá trình:
 Giữ chặt bằng lực cơ học tất cả các hạt có kích thước lón hơn kích
thước lỗ hổng của vật liệu học.
 Hấp phụ các hạt có kích thước bé hơn, thậm chí các hạt hòa tan dạng
keo và các hạt hòa tan phân tử. Độ trong tinh thể của bia đạt được là nhờ có quá
trình thứ hai này. Hiệu quả của quá trình hấp phụ, phụ thuộc trước hết vào bản chất
của chất hấp phụ và chất bị hấp phụ, sau đó là thời điểm trong quá trình lọc.
Trong công nghiệp sản xuất bia, những loại vật liệu lọc được sử dụng rộng rãi
nhất gồm có:
 Xelluloza trộn với bột axbetit rồi ép chặt thành bánh hình tròn (hoặc

hình chữ nhật hoặc hình vuông). Vì độ dày của các bánh khá lớn, cho nên trong
thuật ngữ chuyên ngành, chúng được gọi là khối lọc.
 Sợi xelluloza dệt và ép thành tấm, khi tiến hành lọc bia phải phủ bột
diatomit. Vì độ dày của các tấm này bé, hơn nữa chúng lại bền và rất dai, cho nên
trong thuật ngữ chuyên ngành chúng được gọi là tấm lọc.
 Cả hai loại vật liệu lọc đều có thể sử dụng nhiều lần. Đối với khối lọc,
sau mỗi lần tái sử dụng, ta phải bổ sung thêm một lượng mới.Khối lọc đã qua sử
dụng, có khả năng hấp phụ mạnh hơn khối lọc mới, và xếp thứ ba là diatomit. Tuy
khả năng hấp phụ thấp hơn nhưng hiện nay, loại vật liệu trợ lọc này được dùng
nhiều hơn cả. Lý do la bia lọc bằng diatomit không hề bị thay đổi về chất lượng và
có độ bền sinh học cao.
Trong quá trình lọc có thể xảy ra hiện tượng giảm nồng độ chất hòa tan của
bia. Do một phần các hạt dạng keo bị loại ra ngoài cho nên độ nhớt của bia sau khi

11


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

lọc sẽ bị giảm và khả năng tạo bọt của nó cũng bị giảm. Vì lẽ đó, ý tưởng lọc bia hai
lần để bia đạt được độ trong tinh thể có thể thực hiện được nhưng hậu quả là làm
giảm chỉ tiêu cảm quan khác của nó.
Lọc bia luôn luôn dẫn đến sự hao phí về khối lượng và hao phí CO2, mặc dầu
quá trình đó được thực hiện trong một hệ thống hoàn toàn kín. Sự hao phí CO 2 có
thể giảm bớt được bằng cách trước lúc lọc, bia được làm lạnh đến OoC. Gỉai pháp
này có một điểm rất hay là tạo trước cho bia điều kiện gây đục ở nhiệt độ thấp, có
như vậy sau này hiện tượng sẽ không bị lặp lại.
Ly tâm là phương pháp thứ hai thường được sử dụng trong sản xuất để làm
trong bia. Việc tách các hạt phân tán ra khỏi pha lỏng, hoàn toàn mang tính chất cơ

học. Chính vì vậy mà sự thay đổi về thành phần và tính chất của bia sau khi ly tâm
là hầu như không đáng kể. Ngoài ra, giải pháp ly tâm còn có một ưu điểm nữa là sự
thuận tiện về mặt cơ khí khi làm việc. Bên cạnh những ưu điểm, giải pháp này cũng
có một số nhược điểm nhỏ ta cần phải lưu ý. Đó là, trong khi ly tâm, nhiệt độ của
bia có thể sẽ tăng lên. Theo một số ít tác giả thì bia sau khi ly tâm sẽ có tính khử
yếu hơn so với bia lọc. Vì những lý do đó, làm lạnh bia trước lúc ly tâm là công
việc bắt buộc phải làm.[3][4]

2.2 Bão hòa CO2:
Nhằm làm tăng chất lượng cảm quan, chống kết tủa và là môi trường tốt để
bảo quản bia. Bổ sung lượng CO 2 bị thất thoát trong quá trình lọc bia.Tạo mọi điều
kiện thích hợp về nhiệt độ, áp suất, để tiến hành bão hoà CO 2.
Phương pháp bão hoà CO2: Hạ nhiệt độ trong absort xuống 20C bằng cách mở van
tác nhân lạnh. Dịch bia sau khi lọc được bơm vào absort không được quá vạch vì
dịch bia sẽ bị trào ra ngoài khi áp suất cao. Mở van CO 2 từ bình chứa vào trực tiếp
và được dẫn vào trong absort xuống đáy thiết bị qua thiết bị phân tán thành những
phân tử nhỏ khuếch tán đều trong bia. Nạp CO 2 khi áp suất lên gần 5 kg/ cm 2 thì
ngưng lại.
Chú ý:

12


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Trước khi nạp CO2 vào ta phải xả áp suất trong absort gần 0 kg/ cm 2 và đóng
lại rồi mới bắt đầu nạp CO 2. Sau 30 phút mở van xả áp suất, loại bỏ bớt CO 2 do CO2
không hấp thụ hoàn toàn trong bia. Khi áp suất trong bình còn 1 – 2 kg/ cm 2 thì tiến
hành nạp CO2 lại trong thời gian nhất định, số lần nạp từ 2 đến 3 lần.[3][4]

2.3 Chiết chai:
Chiết chai là một khâu quan trọng, có thể ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng
bia. Đó cũng là một cách bảo quản, tránh tuyệt đối sự tiếp xúc giữa bia với không
khí nhằm tăng tính bền vững của bia. Chiết chai được tiến hành dưới áp suất dư của
CO2 và nhiệt độ từ 0 – 10C. Khoảng không trong thùng bock, chai hay lon trước khi
chiết cần được thông với khoảng không CO 2 trên mặt thùng chứa bia, nhờ áp suất
trong chai lúc chưa có bia đã cân bằng với áp suất CO 2 trong thùng chứa bia được
gọi là phương pháp chiết đẳng áp. Khi đó mới bắt đầu chiết bia vào, bia sẽ chiếm
chỗ của CO2 và một ít không khí trong thùng bock, chai hay lon. Lượng CO 2 và
không khí nàyse4 thoát ra và do sự chênh lệch áp suất sẽ về khoảng trống bên trên
thùng chứa bia. Với nguyên tắc chiết rót bia đẳng áp trong hệ thống hoàn toàn kín,
sẽ đảm bảo sự giảm thiểu tổn thất CO2, cũng như sự giảm thiểu O2 xâm nhập vào
trong bia, nhờ vậy giữ ổn định chất lượng bia tốt hơn.[3][4]

2.4 Thanh trùng bia:
Trong bia thành phẩm, sản xuất theo các phương pháp thông thường luôn luôn
chứa các tế bào còn sống, bao gồm nấm men thuần chủng và các vi sinh vật lạ khác.
Một số vi sinh vật ngoại lai như vi khuẩn axetic, một số nấm sợi, vi khuẩn thuộc
nhóm E.coli và nhiều loại khác không thể phát triển được ở trong bia. Nguyên nhân
là vì trong đó không có oxy, lại có hàm lượng ethanol đáng kể, các chất đắng và pH
cũng tương đối thấp. Nấm men, kể cả nấm men giống và một số loài nấm men dại,
vi khuẩn lactic thuộc nhóm Sarcina và một số khác dễ dàng phát triển trong bia.
Xử lý nhiệt là một trong những giải pháp quan trọng nhất để diệt vi sinh vật.
nội dung này được chia làm hai cấp: tiệt trùng và thanh trùng. Tiệt trùng là nâng
nhiệt độ lên đến 1000C – 1200C, còn thanh trùng chỉ ở 60 – 800C.

13

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Thời gian cần thiết để diệt các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào nhiệt độ. Khả
năng chịu nhiệt của các loài vi sinh vật khác nhau cũng khác nhau, và khả năng đó
dao động trong những khoảng khá rộng. Ngoại trừ một số, còn đa số nấm men đều
bị diệt ở nhiệt độ 620C- 630C trong vòng 2 phút, ở nhiệt độ đó, phải kéo dài tới 1520 phút nhiều loại vi khuẩn mới bị tiêu diệt. Còn vi khuẩn chịu nhiệt thì với thời
gian đó mà ở nhiệt độ 1000C chúng vẫn không chết. Bào tử của nấm men và nấm
mốc kém chịu nhiệt hơn so với bào tử của vi khuẩn. Chúng bị diệt ở 80 0C, còn bào
tử của vi khuẩn, nhiều trường hợp phải ở nhiệt độ 120 0C trong 30 phút may ra mới
diệt được chúng.
Thanh trùng bia sẽ dẫn đến sự thay đổi bất lợi cho hương, vị và màu sắc của
sản phẩm. Ngay sau khi thanh trùng, những sự thay đổi đó rất khó nhận ra, nhưng
sau một thời gian bảo quản thì chúng mới lộ rõ. Một trong những nguyên nhân dẫn
đến sự thay đổi đó là sự tạo thành melanoid.
Thanh trùng bia cũng có thể dẫn đến vẩn đục dạng keo cho sản phẩm. vấn đề
này phụ thuộc vào thành phần protein của bia, nhiệt độ và thời gian đun nóng.
Protein cao phân tử là những thủ phạm chính gây ra vẩn đục dạng keo trong giai
đoạn thanh trùng. Ở một múc độ nào đó, các hợp chất polyphenol ngưng tụ cũng
góp phần vào việc làm hỏng bia.
Để loại trừ, hoặc làm giảm bớt các hậu quả âm tính đến chất lượng sản phẩm
do quá trình thanh trùng gây ra, thì bia phải được sản xuất theo một chế độ công
nghệ đặc biệt nghiêm ngặt. Điều cần thiết trước hết là ở giai đoạn sản xuất dịch
đường, quá trình đường hóa và thủy phân phải đạt ở múc sâu và hoàn toàn. Lên men
chính, lên men phụ và tàng trữ phải tiến hành ở nhiệt độ thấp và phải kéo dài thời
gian đủ mức cần thiết. lọc bia hai lần và làm lạnh sâu đến 0 0C trước đó, tiến hành
trong hệ thống kín tránh tiếp xúc với oxy là những giải pháp bắt buộc phải thực
hiện. Ngoài những vấn đề nêu trên, bia cần phải được làm ổn định thành phần bằng
cách xử lý với các chất hấp phụ, các chất kết lắng, các chế phẩm enzym proteaza và
các chất chống oxy hóa.

Thực hiện được các giải pháp trên đây, sự thay đổi chất lượng của bia trong
giai đoạn thanh trùng sẽ giảm xuống mức thấp nhất.

14


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Có hai phương pháp thanh trùng bia: thanh trùng cả khối và thanh trùng trong
bao bì.
Thanh trùng cả khối lại có hai phương án: chiết chai ở nhiệt độ cao và chiết
chai sau khi đã làm lạnh. Trong cả hai phương án này thì thiết bị trao đổi nhiệt
thông dụng nhất vẫn là máy tấm bản.[3][4]

3. CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN BIA
3.1 Acid carbonic bị giảm
Lượng Acid carbonic bị mất sẽ phụ thuộc vào thời gian bảo quản. Nó liên quan
đến độ kín, khít của vật liệu chứa bia. Theo viện Niitop thì dùng đệm bằng
polyphenol – etylen có thể giữ được aciad carbonic nhiều hơn 13,45% so với các
phương pháp đóng nút thông thường.

3.2 Bia bị đục
Bia hỏng chủ yếu là khi bị đục. Hiện tượng này do nhiều nguyên nhân và đặc
trưng cho độ bền vững của bia. Thời gian mà bia có khả năng giữ được vị, độ trong
suốt, độ bọt gọi là độ bền vững của bia. Bia bị đục có thể do những nguyên nhân
sau:
Vẩn đục do kết tủa nguội xảy ra khi làm lạnh bia đến nhiệt độ thấp (1 0C), nếu
ta nâng nhiệt độ lên cao hơn bia sẽ hết đục. Có hiện tượng này do có sự chuyển về
dạng không hòa tan ở nhiệt độ thấp của một số phân tử bậc cao như protein, chất

chát và nhựa hoa houblon.
Vẩn đục do kết tủa protein, dextrin: do hàm lượng protein trong đại mạch quá
cao, quá trình nấu, tàng trữ, lọc không bảo đảm kỹ thuật.
Vẩn đục do kết tủa kim loại: do bia tiếp xúc với kim loại như Pb, Fe. Cu.
Protein kết hợp với kim loại, bị biến tính gây kết tủa. Hiện tượng đục bia này gây
bất lợi về mặt cảm quan, màu bia bị xám, mùi vị có pha lẫn mùi vị kim loại.
Vẩn đục do hoạt động của vi khuẩn: xảy ra khi trong bia còn lẫn tạp trùng. Để
khắc phục còn phải chú ý đến khâu vệ sinh, sát trùng thiết bị, phân xưởng sản xuất.
Để ngăn chặn hiện tượng đục trong bia cần nghiêm chỉnh chấp hành đúng quy
chế kỹ thuật đã xác định trong toàn bộ quy trình sản xuất.

3.3 Bia bị chua
Độ acid trong bia thay đổi bình thường từ 1,8 – 5,5 ml kiềm trong 100 ml bia.
Độ acid tăng lên trong mọi nhiệt độ bảo quản, và bia có thể bị hỏng ngay cả khi đạt
tới độ acid giới hạn quy định theo tiêu chuẩn.

15


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Ngoài ra, mùi vị bia có thể thay đổi trong quá trình bảo quản: bia bị nhạt, có vị
chua và đắng, vị lên men, không còn mùi thơm. Hiện tượng thay đổi mùi vị sinh
cặn, mất acid carbonic xảy ra ở nhiệt độ cao hơn là nhiệt độ thấp.

4. NHỮNG VI SINH VẬT NHIỄM VÀO BIA TRONG QUÁ TRÌNH
SẢN XUẤT VÀ BẢO QUẢN.
4.1 Vi sinh vật gây ngộ độc:
4.1.1 Coliforms:

Coliforms và Faecal Coliforms được xem là vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh,
bởi vì số lượng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của
các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số
lượng Coliforms cao trong thực phẩm thì khả năng hiện diện các vi sinh vật khác
cũng rất lớn. Tuy vậy, mối liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây
bệnh còn đang được tranh cãi về cơ sở khoa học, cho đến nay mối liên hệ này vẫn
không được sự thống nhất trong các hội đồng khoa học.[11]
4.1.2 Escherichia coli:
Escherichia coli là một trong những vi sinh vật phổ biến nhất của môi trường.
Nhiều người không coi E. coli là vi sinh vật gây bệnh cho thực phẩm song những
nghiên cứu gần đây cho thấy một số chủng của chúng thật sự có khả năng gây bệnh
lây lan qua thực phẩm rất nghiêm trọng. Chúng là vi sinh vật hiếu khí phổ biến
trong đường tiêu hóa của người và các loài động vật máu nóng.Các dòng E. coli gây
bệnh khi chúng xâm nhiễm vào người qua con đường thực phẩm có thể gây nên các
rối loạn đường tiêu hóa, gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em và nhiễm huyết ở trẻ sơ sinh,
các biểu hiện lâm sàng biến động có thể từ nhẹ đến rât1 nặng, có thể đe dọa đến
mạng sống của con người phụ thuộc vào liều lượng, dòng gây nhiễm và khả năng
đáp ứng của từng người.[11]
4.1.3 Nấm men – nấm mốc:
Đây là nhóm vi sinh vật có nhân thật, thuộc nhóm dị dưỡng, chúng cần nguồn
carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài, chúng rất đa dạng
về chủng loài. Hầu hết nấm mốc và nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí
bắt buộc, một số khác có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Là vi sinh ưa
mát, nhiệt độ thích hợp từ 20- 28 0C, một số khác ưa lạnh hay ưa nóng. Thông

16


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

thường chỉ có nấm mốc gây ra độc tố làm trúng độc. Người ăn phải nấm mốc có thể
bị khối u trong gan, gây ra ung thư gan, tácđộng lên thận làm suy thoái thận. [11]
4.1.4 Staphylococcus aureus:
Staphylococcus aureus là VSV có khả năng sản sinh một số loại độc tố đường
ruột bền nhiệt, không bị phân huỷ khi đun ở 1000C trong khoảng 30 phút.
Staphylococcus aureus không có khả năng cạnh tranh cao so với các vi khuẩn gây
hỏng thực phẩm khác nhưng khi không có đối thủ cạnh tranh, chẳng hạn trong thực
phẩm muối hoặc chế biến, chúng có thể sinh sôi và tạo ra độc tố bền nhiệt. Khi vi
sinh vật này xâm nhiễm vào trong thực phẩm, chúng tiết độc tố vào trong sản phẩm
và gây độc. Khi con người tiêu thụ loại thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4-6 giờ ủ
bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mữa, các triệu chứng
này kéo dài từ 6-8 giờ. Các nguồn lây nhiễm vào thực phẩm chủ yêu từ các khâu
chế biến. Trong tự nhiên các vi sinh vật này thường tình thấy trên da, mũi, tóc hay
lông của các loài động vật máu nóng.[11]
4.1.5 Clostridium perfringens:
Quan niệm về sự ngộ độc thực phẩm do Clostridium perfringens gây ra đã có
những thay đổi trong những năm gần đây. Theo những quan niệm trước đây cho
rằng các dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có
thể gây ngộ độ thực phẩm. Nhưng trong những năm gây đây các dòng nhạy cảm với
nhiệt, không làm tan máu cũng được tìm thấy trong các vụ ngộ độc do vi sinh vật
này gây nên.Vì các bào tử của C. perfringens kháng nhiệt nên chúng thường sống
sót qua quá trình nấu chín. Tuy nhiên cũng phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với
nhiệt. Nếu những bào tử sống sót, khi gặp điều kiện thích hợp chúng sẽ nẩy mầm và
nhân lên. Khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn có thể làm cho các
dòng kháng nhiệt tồn tại vì thế chúng sẽ gây tái nhiễm sau khi bảo quản. Các triệu
chứng của ngộ độc do độc tố của vi sinh vật này gây ra là đau thắt vùng bụng, tiêu
chảy, đôi khi nôn mửa xuất hiện sau 8-20 giờ khi ăn một lượng lớn tế bào sống
Clostridium perfringens. Thời gian ủ bệnh là 12- 24 giờ.[11]

4.2 Vi sinh vật gây hư hỏng bia:
4.2.1 Pectinatus cerevisiiphilus - Pectinatus frisingensis:
Pectinatus cerevisiiphilus thường được nói đến như là loại vi khuẩn làm hư
bia. Loại vi khuẩn kị khí hình chiếc lá này lần đầu tiên được mô tả bởi Lee năm

17


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

1978 trong chai bia được trữ ở 300C. Và từ đó nó thường được phát hiện trong các
mẫu bia bị mất hương vị. Tuy nhiên, theo nghiên cứu phân loại mới đây thì có loại:
vi khuẩn kị khí, gram âm, hình que xuất hiện ở các nhà máy bia và đó là 1 chủng
mới của Pectinatus, Pectinatus frisingensis.Một chủng mới cần môi trường phát
triển khác và có khả năng bài tiết nhiều hơn trong quá trình lên men. Khi phát triển
trong dịch bia thì hai chủng này bài tiết ra một lượng đáng kể các acid béo dễ bay
hơi, chủ yếu là propionate và acetace, kết quả là làm hư hương vị. [14]
4.2.2 Lactobacillus brevis:
Lactobacillus brevis là loại vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn lên men axit lactic,
gram dương, không sinh bào tử. Nó có thể được tìm thấy trong nhiều mơi trường
khác nhau và trong thực phẩm lên men như dưa chua, rượu vang..Nó cũng là một
trong những nguyên nhân phổ biến gây hư hỏng cho bia. L. brevis là một loại
Lactobacillus đặc biệt, nó được coi là loài chuyên sản xuất polysaccharide thực vật.
Quá trình trao đổi chất của L. brevis tạo ra axit lactic và ethanol.
4.2.3 Megasphaera cerevisiae:
Megasphaera cerevisiae là vi khuẩn gram âm, kị khí bắt buộc, gây đục và làm
mất hương vị trong cà phê và bia. Có bảy chủng M. cerevisiae đã được phân lập. M.
cerevisia thường nhạy cảm với pH thấp (≤4,1) và bị ức chế trong môi trường có độ
cồn trên 2,8% (w/v). Tuy nhiên, theo quan sát cho thấy thì nó có thể phát triển trong

bia với độ cồn lên tới 3,8% (w/v) (Haikara and Lounatmaa, 1987; Lawrence, 1988) .
[13]

18


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. NGUYÊN VẬT LIỆU
1.1 Dụng cụ


Erlen 50 ml, 100 ml



Đèn cồn



Ống đong



Bình định mức 50 ml, 100 ml



Gòn không thấm



Gòn thấm nước



Bình xịt cồn 70o



Bình nước cất



Pipette thuỷ tinh 1 ml, 5 ml, 10 ml



Micropipette 1000 µm



Đầu tip 100 – 1000 µl



Petri thuỷ tinh



Ống nghiệm



Một số vật dụng khác

1.2 Thiết bị
 Autolave ( TOMY SS – 352)
 Cân điện tử (ADAM AQT – 200)
 Máy ảnh (CANON IXUS 8515)
 Máy đo pH( HANNA – HI 8424)
 Kính hiển vi quang học( OLYMPUS CH30)
 Tủ sấy dụng cụ (MEMMERT)

19


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

 Tủ hút ( ASTEC MONNAIR)
 Tủ lạnh ( LG GR - T582GV)
 Tủ ấm ( SHEL LAT)

1.3 Sử lý dụng cụ
Dụng cụ thuỷ tinh: được rửa bằng nước javel sau khi sử dụng, ngâm cồn 70 o
khoảng 6 – 8 giờ. Vô trùng bằng cách hấp khử trùng hơi nước với Autolave ( 121 o ở
1 atm trong 30 phút). Bao gói cẩn thận và sấy khô ở 110o trong 15 phút, bảo quản

trong tủ chứa dụng cụ.
Dụng cụ nhựa: được sử lý bằng nước javel, rửa sạch và ngâm trong cồn 70 o
khoảng 6 – 8 giờ. Vô trùng băng phương pháp đun sôi Pasteur, để khô tụ nhiên, bao
gói cẩn thận và bảo quản.

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu bia tươi có mặt trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh : Hoàng
Long, New, Lager, Viễn Đông

Hình 3.1 : Các loại bia khảo sát

2.2 Phương pháp chọn mẫu
Thời gian: 4 -5 giờ chiều
Địa điểm: mẫu bia được thu thập từ các điểm bán lẻ trong quận Tân Bình
 Khu công nghiệp Tân Bình
 Đường Lũy Bán Bích
 Đường Phạm Văn Bạch
 Đường Cách mạng tháng tám

20


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

2.3 Phương pháp bảo quản mẫu và giữ mẫu
 Mẫu bia được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-4 oC tước khi đưa vào kiểm
nghiệm.
 Đưa mẫu về 20oC trước khi lấy mẫu phân tích.

 Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy khuấy đồng nhất.

2.4 Số lượng mẫu: 40 mẫu ( mỗi loại 10 mẫu)
2.5 Nội dung nghiên cứu
2.5.1 Mục tiêu tổng quát
Khảo sát khả năng bị nhiễm vi sinh vật của bia tươi trên thị trường Thành phố
Hồ Chí Minh, từ đó có nhận định chung về độ an toàn của các sản phẩm bia tươi
này.
2.5.2 Các chỉ tiêu khảo sát
 Định lượng vi sinh vật trong mẫu bằng phương pháp nuôi cấy
 Xác định vi khuẩn E. coli bằng các phản ứng sinh hóa cơ bản.
 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí
2.5.3 Các phương pháp phân tích
2.5.3.1 Kĩ thuật định lượng vi sinh vật
Tất cả các phương pháp định lượng vi khuẩn trong mẫu bằng phương pháp
nuôi cấy đều yêu cầu các tế bào phải được tách rời nhau, qua quá trình nuôi cấy các
tế bào này phát triển thành các dòng riêng biệt. Tất các qui trình định lượng bằng
phương pháp nuôi cấy nhằm chọn lọc một hay nhiều nhóm vi khuẩn nhất định nào
đó, mức độ chọn lọc phụ thuộc và từng qui trình qui trình cụ thể.
Để xác định tổng số vi sinh vật trong mẫu phải chọn qui trình giảm tối thiểu
khả năng chọn lọc. Nhưng dù mức độ chọn lọc ở mức tối thiểu cũng chỉ định lượng
được số lượng vi sinh vật có thể nuôi cấy. Còn một số lượng lớn vi sinh vật khác
không thể phát triển được trong quá trình nuôi cấy thì không thể định lượng được
bằng phương pháp này.
a. Phương pháp đếm khuẩn lạc

21


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI

TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa được sử dụng rộng rãi để định lượng vi
sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn, nhưng pháp này có những khuyết điểm và đã có
những cách nhìn nhậnkhác nhau về mặt khoa học. Khuyết điểm của phương pháp
này nằm trong sự lạm dụng để biểu đạt sai các kết quả. Tất cả mọi người đều mắc
sai lầm khi nhận ra rằng phương pháp này không thể dùng để thu được kết quả tổng
số vi sinh vật.
Phương pháp đếm khuẩn lạc sử dụng nhiều loại môi trường và các điều kiện
nuôi cấy khác nhau. Agar là chất thường được dùng để làm đặc các môi trường nuôi
cấy vì hầu hếr các vi sinh vật đều mất các gen tổng hợp enzym phân giải agar. Các
mẫu đã được pha loãng để trãi lên bề mặt môi trường agar (phương pháp trãi) hay
khuyết tán vào trong nôi trường trước khi làm đặc (phương pháp đổ đĩa). Một vấn
đề cần phải cân nhắc là các vi sinh vật cần xác định có thể tồn tại và phát triển trong
môi trường agar hay không. Một số vi sinh vật có thể bị chết khi trãi trên bề mặt
môi trường trong qui trình cấy trải bề mặt. Một số loài vi khuẩn khác không thể
sống trong điều kiện nhiệt độ duy trì trạng thái lỏng của agar trong qui trình đổ đĩa.
Bởi vì agar chỉ là tác nhân làm rắn môi trường nuôi cấy trong qui trình định lượng
vi sinh vật vì thế trong một số trường hợp agar có thể được thay thế bằng các tác
nhân làm rắn khác. Trong một số trường hợp các vi sinh vật có các nhu cầu dinh
dưỡng đặc biệt khác, các chất như silicagel có thể được thay thế để làm rắn môi
trường. Như ng vì chuẩn bị môi trường silicagel khó khăn hơn chuẩn bị môi trường
agar nên chỉ dùng môi trường silicagel khi không thể thay thế được môi trường
agar.
Phương pháp ống cuộn được dùng để định lượng các vi sinh vật kỵ khí bắt
buộc. Đây là một phương pháp cải biên của phương pháp đổ đĩa. Các đĩa hay các
ống sau khi cấy vi khuẩn được ủ trong điều kiện nhiệt độ đặc biệt trong một thới
gian nhất định để cho sinh vật phát triển thành các khuẩn lạc có thể nhìn thấy bằng
mắt trường, số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sẽđược đếm. Số lượng khuẩn lạc
sẽ được gán cho số tế bào đơn lẻ trong mẫu ban đầu. Để số lượng khuẩn lạc phản

ánh được số lượng tế bào vi khuẩn, mẫu phải được phân tán đều vào trong môi
trường hay trên bề mặt môi trtường rắn. Những đĩa có quá nhiều khuẩn lạc xuất

22


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

hiện thì không thể cho số lượng đếm chính xác bởi vì chúng có thể chồng lấp lên
nhau. Những đĩa có quá ít khuẩn lạc cũng phải bỏ đi vì theo nguyên tắc của xác
suất.
Những vấn đề chính yếu cần xem xét trong qui trình đếm khuẩn lạc là thành
phần môi trường, điều kiện và thời gian nuôi ủ. Môi trường để định lượng các vi
sinh vật dị dưỡng không thể cố định nitơ phải chứa các nguồn nitơ, carbon,
phosphate dễ sử dụng và các cation, anion cần thiết như sắt, mangie, calci, natri, clo
và sulphate. Thành phần của các hàm lượng không nhất định, chúng đặt thù cho
từng loại môi trường và từng loại mẫu nhất định để có thể nhận được số lượng vi
sinh vật mục tiêu cao nhất. Như vậy môi trường nuôi cấy phải có các thành phần
dinh dưỡng phù hợp với từng yêu cầu của loài vi sinh vật, bao gồm cả các nhân tố
cần thiết khác cho sự phát triển của một hệ vi sinh vật nhất định. Mục đích chung
của môi trường là hàm lượng dinh dưỡng phải cao hơn các thành phần có trong các
mẫu đang phân tích. Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại môi trường đếm tổng số
vi sinh vật phải đủ cao, và độc tính của môi trường đối với sinh vật ở mức thấp
nhất.
Để nâng cao hiệu quả của qui trình định lượng vi sinh vật bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc, các điều kiện cần phải điều chỉnh sao cho chỉ có các thành viên vi
sinh vật cần phát hiện theo định nghĩa được đếm. Các môi trường đếm đĩa được
chọn lọc hay phân biệt với các thành viên vi sinh vật khác. Qui trình đếm đĩa chọn
lọc được thiết kế cho thích hợp với sự phát triển của vi sinh vật mong muốn. Sự

phát triển của các nhóm vi sinh vật khác được loại bỏ bởi các thành phần của môi
trường hay điều kiện nuôi ủ. Môi trường phân biệt là môi trường không loại bỏ các
nhóm vi sinh vật không mong muốn mà ngược lại cho phép chúng phát triển cũng
trên môi trường đó nhưng có thể biệt phân biệt các nhóm vi sinh vật mong muốn
với các nhóm khác bằng các đặc điểm nhận dạng.
Môi trường cũng có thể được thiết lập để chọn lọc các loài nấm mốc. Mặt dù kỹ
thuật đếm khuẩn lạc không phải là phương pháp được chọn cho việc xác định số
lượng nấm mốc trong các mẫu thực phẩm và trong môi trường. Bởi vì kỹ thuật này
chỉ thích hợp cho việc định lượng các loài vi sinh vật không có sợi hay bào tử. Dĩ

23


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

nhiên phương pháp đếm khuẩn lạc cũng thích hợp cho việc định lựơng các loài nấm
men. Vì số lượng của vi khuẩn luôn nhiều hơn số lượng của nấm mốc nên để ngăn
cản sự phát triển của vi khuẩn trong các khuẩn lạc của nấm mốc, các tác nhân ức
chế vi khuẩn được thêm vào trong các môi trường nuôi cấy. Các thuốc nhuộm
bengal rose và các kháng sinh như streptomycine, neomycine thường được sử dụng
là những tác nhân ức chế vi khuẩn. Một biện pháp đơn giản để ức chế sự phát triển
của vi khuẩn là hạ thấp pH của môi trường nuôi cấy xuống khoảng 4,5 - 5,5. Hầu
hết các nấm mốc đều không bị tác động khi phát triển trong khoảng pH này nhưng
khi đó vi khuẩn bị ức chế.
Môi trường chọn được xác lập công thức để ức chế sự phát triển của nhóm vi
sinh vật và cho phép một nhóm vi sinh vật khác phát triển. Ví dụ môi trường
Saubouraud Dextrose Agar được dùng để định lượng nấm mốc dựa trên nguyên tắc
pH thấp và nguồn carbohydrate. Bổ sung vào môi trường các chất kháng sinh khác
như peniciline hay methyl blue là những tác nhân ức chế vi khuần gram âm. Các vi

sinh vật kháng kháng sinh cũng có thể được định lượng trên môi trường bằng cách
thêm vào đó một liều lượng kháng sinh.
Môi trường phân biệt được thiết lập dựa trên nhiều cách. Các thuốc thử được
thêm vào trong môi trường để cho phép nhận ra các sự khác biệt của những vi sinh
vật mong muốn. Có thể thêm thuốc thử vào môi trường sau khi nuôi cấy để nhận ra
các loài vi sinh vật đặc trưng cần tìm. Chìa khoá nâng cao khả năng phân biệt của
môi trường là qui trình nuôi cấy để cho phép môi trường phân biệt một cách tốt nhất
với vi sinh vật cần định lượng và các vi sinh vật khác có trong mẫu.
Môi trường Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là những môi
trường được sử dụng rộng rãi trong việc phân tích vi sinh vật trong nước. Những
môi trường này bao gồm tính chọn lọc và tính phân biệt. Chúng chọn lọc cho sự
phát triển của các vi khuẩn gram âm bởi trong đó có thêm vào các tác nhân ức chế
các vi khuẩn gram dương. Môi trường này có thể phân biệt các vi khuẩn có thể sử
dụng lactose bởi sự hình thành các khuẩn lạc có thể phân biệt bằng màu sắc. Trên
môi trường EMB, vi khuẩn thuộc nhóm coliforms là nhóm gram âm tạo nên những
khuẩn lạc có màu tím ánh kim. Định lượng số lượng coliform bằng cách đếm số

24


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

lượng khuẩn lạc có các đặc điểm này. Cách này thường xuyên được sử dụng trong
việc phân biệt các vi sinh vật chỉ thị trong nước và trong thực phẩm.
Với kỹ thuật đến khuẩn lạc, các mẫu cần phân tích phải được pha loãng thành
chuổi pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để
cấy vào các môi trường đã chọn phù hợp với các đối tượng cần xác định. Mổi khuẩn
lạc được hình thành được gán cho một đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu-colony
forming units). Kỹ thuật thường qua các bước như sau:

Dung dịch pha loãng: một số dung dịch dùng để pha loãng có thể làm chết tế
bào như: nước muối, nước cất. Các dung dịch pha loãng không được dùng ngay khi
lấy ra từ tủ lạnh có thể gây sốc và làm cho vi sinh vật không thể phát triển được.
Dung dịch pepton water là dung dịch pha loãng được sử dụng nhiều nhất và được
xem là dung dịch pha loãng cho tất cả các loại mẫu. Nếu trong mẫu còn có một ít
các chất khử trùng thì phải thêm vào dung dịch pha loãng tác nhân giảm thiểu khả
năng khử trùng của chúng, ví dụ: nếu trong mẫu còn dư lượng của các hợp chất
amonium (NH4-) thì có thể thêm vào đó Tween 80 hay lecithin. Ngược lại nếu trong
mẫu có chứa các hợp chất chlorin hay iodin thì cần thêm vào đó các muối như
sodium thiosulphate.
Chuẩn bị các chuổi pha loãng mẫu
Bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào trong ống nghiệm có nắp đậy.
Nếu sử dụng các ống nghiệm có nắp không đóng chặt được thì phải khử trùng ống
nghiệm, sau đó bơm dung dịch pha loãng vào, các thao tác này phải được thực hiện
một cách vô trùng. Phân phối dung dịch pha loãng vào các ống sau khi khử trùng
còn có ý nghĩa đảm bảo thể tích dung dịch pha loãng không bị mất do quá trình khử
trùng. Các thao tác pha loãng tuỳ thuộc vào từng loại mẫu.
Cụ thể như sau:
- Nếu pha loãng các mẫu là chất lỏng, trước khi pha loãng mẫu phải được lắc
kỹ, cắm đầu pippette sâu vào trong mẫu khoảng 1 phút hút ra 1ml, cho vào trong
ống chứa dung dịch pha loãng đầu tiên, lắc kỹ ống nghiệm chứa mẫu, bỏ pippette
vừa sử dụng, dùng một pippette mới thực hiện lại thao tác như trên với các độ pha
loãng tiếp theo. Cứ tiếp tục như vậy cho đến khi đạt được độ pha loãng mong muốn.

25


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

Mỗi độ pha loãng chỉ được phép sử dụng 1 pippette. Các ống nghiệm chứa các độ
pha loãng khác nhau phải được đánh dấu để tránh nhầm lẫn.
- Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng, các thao tác được tiến hành như sau: cân
10 g mẫu vào trong các bao dập mẫu hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml dung
dịch pha loãng và đồng nhất mẫu, phải đảm bảo sao cho vi khuẩn phân tán đều vào
trong dung dịch. Sau khi mẫu và dung dịch pha loãng được đồng nhất ta được dung
dịch pha loãng 1/10. Các độ pha loãng sau được tiến hành tương tự như phần pha
loãng mẫu lỏng. Các ống nghiệm chứa các độ pha loãng khác nhau phải được đánh
dấu để tránh nhầm lẫn.
Cấy mẫu bằng phương pháp đổ đĩa
Các môi trường agar được đun chảy trong các chai hay trong các ống nghiệm
có thể tích phù hợp. Được làm mát trong các bể điều nhiệt ở 45 0C. Hút 1ml mỗi
dung dịch pha loãng cho vào trong đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng thường
được cấy vào hai đĩa petri hay nhiều hơn. Cũng sữ dụng các pippette sạch cho mỗi
độ pha loãng. Chỉ chọn cấy vào đĩa petri những độ pha loãng có mật độ vi sinh vật
phù hợp, thường trong khoảng 25-300 tế bào/ml. Đỗ vào mỗi đĩa đã cấy 10-15ml
môi trường đã được đun chảy và làm nguội, lắc đĩa theo chiều và ngược chiều kim
đồng hồ khoảng 5-6 lần, đặc đĩa lên mặt phẳng ngang và đợi cho đến khi môi
trường trong đĩa đông đặc. Lật ngược đĩa và ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
xác định.[10]
b. Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh bằng kỹ thuật MPN (Most
Probable Number):
Phương pháp MPN là phương pháp có thể thay thế phương pháp đếm khuẩn
lạc để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu, phương pháp này được dựa trên
nguyên tắc xác suất thống kê sự phân phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng
khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần trong các môi
trường lỏng đã được chọn, thông thường phải cấy lặp lại từ 3-10 lần tại mỗi nồng độ
pha loãng. Các độ pha loãng được tiến hành sao cho trong các lần lặp lại có một số
lần cho dầu hiệu dương tính và một số lần cho dấu hiệu âm tính. Số lần lặp lại cho
dấu hiệu dương tính và âm tính được ghi nhận để đối chiếu với bảng thống kê sẽ

26


NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI VỚI SẢN PHẨM BIA TƯƠI
TRÊN THỊ TRƯỜNG TP. HỒ CHÍ MINH

được giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu. Qui trình MPN cho giá trị số
lượng vi sinh vật trong mẫu có ý nghĩa thống kê theo xác suất phân bố vi sinh vật
trong mẫu khi sử dụng một số lần lặp lại, vì thế khoảng tin cậy là rất lớn. Phương
pháp MPN để định lượng vi sinh vật cho đến nay đã có nhiều cải tiến cho phép tiến
hành qui trình dễ dàng và tốn ít sức lao động hơn và cho giá trị chính xác cao hơn.
Chọn nồng độ pha loãng sao cho trong các lần lặp lại có một số lần cho kết quả
dương tính và một số lần cho kết quả âm tính , sự lựa chọn này rất quan trọng.
Trong nhiều trường hợp qui trình MPN được thiết lập sao cho gia tăng số lượng lần
lặp cho kết quả dương tính bằng tín hiệu phát triển của vi sinh vật. Trong một số
trường hợp khác, qui trình được thiết lập có nhiều thử nghiệm khẳng định sau khi
các lần lặp lại ở các độ pha loãng cho tín hiệu phát triển của vi sinh vật như phát
hiện protein hay một emzym nào đó. Các thử nghiệm sau này cho kết quả dương
tính thì các lần lặp lại ban đầu mới được khẳng định là dương tính. Cũng giống như
qui trình đếm khuẩn lạc, qui trình MPN cũng được sử dụng các môi trường chọn
lọc, không chọn lọc hay môi trường phân biệt.
Phương pháp MPN cũng được dùng để định lượng virus đường ruột. Trong
phương pháp này, một chuỗi pha loãng của mẫu cần kiểm tra được cho vào trong
các ống nghiệm chứa tế bào chủ thích hợp được nuôi cấy. Sau khi ủ, các ống
nghiệm được kiểm tra hiệu ứng cytopathic (CPE), đó là các biểu hiện làm chết tế
bào bị xâm nhiễm. Số lượng virus trong mẫu cũng nhận được từ bảng MPN bằng sự
tham chiếu số lượng các ông nuôi cấy cho hiệu ứng CPE dương tính.
Số lượng của virus cũng có thể được định lượng bằng chỉ số TCID 50 (Tissue
culture infectious dose 50%). Nồng độ pha loãng thấp nhất có sự hiện diện của virus

đó là nộng độ có tỉ số CPE là 50% trong các ống nghiệm.
Cũng giống như qui trình đếm đĩa, trong phương pháp MPN, môi trường và
nồng độ nuôi cấy cũng được điều chỉnh để chọn lọc cho một nhóm vi sinh vật hay
phân biệt các nhóm vi sinh vật này với các nhóm vi sinh vật khác với các đặc điểm
mong muốn, rỏ ràng rằng sự kết hợp giữa điều kiện nuôi cấy và môi trường cũng có
thể định lượng những nhóm vi sinh vật đặc biệt nào đó theo định nghĩa cụ thể. Mỗi

27