NGUYỄN THỊ AN xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH các THUỐC KHÁNG HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG dược BẰNG LC MSMS và TLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐỨC MƯỜ

NGUYỄN THỊ AN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH CÁC THUỐC KHÁNG
HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG
CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LCMS/MS VÀ TLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ AN
Mã sinh viên : 1401004

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH CÁC THUỐC KHÁNG
HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG
CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LCMS/MS VÀ TLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

2. Dược sĩ Phạm Thị Thanh Tuyền
Nơi thực hiện:
1. Viện Khoa học hình sự - Bộ Công An
2. Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã
nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị cán bộ, sự ủng hộ của
gia đình và bạn bè.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS.
Nguyễn Thị Kiều Anh và Dược sĩ Phạm Thị Thanh Tuyền, là những người trực tiếp
hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin được cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Xuân Trường và các anh chị cán bộ Trung
tâm giám định ma túy – Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã hỗ trợ cho tôi về thiết
bị LC-MS/MS để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Công ty Cổ phần Traphaco đã giúp đỡ tôi trong
quá trình tạo nền mẫu nghiên cứu, xin được cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị cán
bộ Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện về trang thiết bị, máy móc để
hỗ trợ tôi suốt trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo đại
học cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy
dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm
và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.

Hà Nội, ngày 11 tháng 06 năm 2019

Nguyễn Thị An


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...............................................3
1.1.1. Nhóm thuốc đối kháng thụ thể Histamin H1 .................................................3
1.1.2. Dược liệu và chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng ............5
1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI
PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC .............................................................. 6
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................................9
1.3.1. Phương pháp LC-MS/MS ..............................................................................9
1.3.2. Phương pháp TLC .......................................................................................12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 14
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ................................................................ 14
2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn..................................................................................14
2.1.2. Máy móc – trang thiết bị .............................................................................14
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................14
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................16
2.2.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ....................................................................16
2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích ............................................................... 16
2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích .............................................................. 17
2.2.4. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu được ..............................................18

2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ..................................................................18


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .....................................................................19
3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp LC-MS/MS ............................................19
3.1.1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS ........................................................... 19
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ....................................................................21
3.1.3. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS .........................................................22
3.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp TLC ........................................................28
3.2.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ....................................................................28
3.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích ............................................................... 29
3.2.3. Thẩm định phương pháp TLC .....................................................................30
3.3. Ứng dụng phân tích trên mẫu thưc .....................................................................33
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................................ 37
4.1. Tạo nền mẫu .......................................................................................................37
4.2. Xây dựng phương pháp phân tích ......................................................................37
4.2.1. Lựa chọn phương pháp phân tích ................................................................ 37
4.2.2. Xây dựng phương pháp ...............................................................................38
4.2.3. Xử lý mẫu ....................................................................................................39
4.3. Thẩm định phương pháp .....................................................................................39
4.3.1. Thẩm định phương pháp..............................................................................39
4.3.2. Thẩm định phương pháp LC-MS/MS .........................................................40
4.4. Ứng dụng ............................................................................................................41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
1. Phụ lục 1: Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của các chất phân tích
2. Phụ lục 2: Kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu
3. Phụ lục 3: Chế tạo nền mẫu và hình ảnh các nền mẫu
4. Phụ lục 4: Danh mục các chế phẩm đông dược được phân tích

5. Phụ lục 5: Sắc ký đồ khảo sát mẫu thực bằng TLC
6. Phụ lục 6: Sắc ký đồ, kết quả định danh và hình ảnh mẫu dương tính bằng LCMS/MS
7. Phụ lục 7: Bài báo được đăng


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
AOAC
AR
Chuẩn
DĐVN
Chuẩn PTN
CLO
CYP

Tiếng anh hoặc tên khoa học
Association of Official
Analytical Chemists
Analytical Reagent

Chuẩn Dược điển Việt Nam
Chuẩn phòng thí nghiệm

Chlorpheniramin maleat
Cyproheptadin hydroclorid
High Performance Liquid
HPLC
Chromatography

High Performance Thin Layer
HPTLC
Chromatography
International Conference on
ICH
Harmonisation
Liquid Chromatography – Mass
LC – MS/MS Spectrometry/ Mass
Spectrometry
LOD
Limit of Detection
LOQ
Limit of Quantitation
LOR
Loratadin
m/z
MeOH
Methanol
PA
Pure Analysis
RSD
Relative Standard Deviation
S/N
Signal/Noise
TLC
Thin Layer Chromatography
TOF
Time Of Flight
UHPLC

Tiếng việt
Hiệp hội các nhà hóa phân tích
chính thống
Thuốc thử phân tích

Ultra High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Hội nghị hòa hợp quốc tế
Sắc ký lỏng hai lần khối phổ
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Khối lượng/ điện tích
Methanol
Tinh khiết phân tích
Độ lệch chuẩn tương đối
Tín hiệu/Nhiễu
Sắc ký lớp mỏng
Thời gian bay
Sắc ký lỏng hiệu suất siêu cao


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng .........5
Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu phân tích các thuốc kháng histamin trộn trái phép trong
chế phẩm đông dược ........................................................................................................7
Bảng 2. 1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ................................................14
Bảng 3. 1. Các thông số máy khối phổ ..........................................................................19

Bảng 3. 2. Điều kiện khối phổ của các chất phân tích ..................................................19
Bảng 3. 3.Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient .......................................20
Bảng 3. 4.Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6) .....................22
Bảng 3. 5.Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất nghiên cứu
.......................................................................................................................................24
Bảng 3. 6. Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày trên 3 nền mẫu (n=7) ............26
Bảng 3. 7. Kết quả độ đúng và độ chính xác khác ngày trên 3 nền mẫu (n=7).............26
Bảng 3. 8. Kết quả LOD và LOQ trên 3 nền mẫu .........................................................28
Bảng 3. 9. Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động TLC .............................................29
Bảng 3. 10. Kết quả định tính trên mẫu thực bằng LC-MS/MS và TLC ......................34
Bảng 3. 11.Kết quả đánh đánh giá các mẫu thực dương tính bằng LC-MS/MS ...........35


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1. 1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS ..........................................................................10
Hình 1. 2. Sơ đồ sự tạo thành ion dương trong ESI ......................................................10
Hình 1. 3. Bộ phân tích tứ cực .......................................................................................11
Hình 1. 4. Mô hình bộ phân tích tứ cực chập ba ........................................................... 11
Hình 3. 1. Sắc ký đồ khảo sát điều kiện khối phổ và sắc ký LC-MS/MS .....................21
Hình 3. 2.Quy trình xử lý mẫu ......................................................................................22
Hình 3. 3. Sắc ký đồ độ đặc hiệu trên nền N1 ............................................................... 24
Hình 3. 4. Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD trên nền N3 .......................... 27
Hình 3. 5. Kết quả khảo sát tối ưu hệ 1 .........................................................................30
Hình 3. 6. Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp TLC ............................... 31
Hình 3. 7. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của betamethason và dexamethason lên việc
phát hiện CLO, CYP, LOR............................................................................................ 32
Hình 3. 8. Sắc ký đồ xác định giới hạn phát hiện của phương pháp TLC ....................33
Hình 3. 9. Kết quả phân tích mẫu thực bằng TLC ........................................................34

ĐẶT VẤN ĐỀ
Dị ứng ngày nay được coi là bệnh của cuộc sống hiện đại, đặc biệt trong bối cảnh
ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng. Tỉ lệ mắc bệnh dị ứng và hen suyễn đang gia
tăng trên toàn thế giới, đặc biệt là là các nước có thu nhập bình quân đầu người thấp và
trung bình [28]. Hơn nữa, sự phức tạp và mức độ nghiêm trọng của các bệnh dị ứng, bao
gồm hen suyễn, tiếp tục gia tăng đặc biệt là ở trẻ em và thanh niên [28]. Hiện trên thế
giới có khoảng một tỉ người mắc dị ứng [32], trong đó có 300 triệu người bị hen suyễn,
400 triệu người viêm mũi dị ứng [28]. Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc dị ứng là khoảng 20% dân
số cả nước [33]. Nhóm thuốc được sử dụng phổ biến để điều trị dị ứng là nhóm kháng
histamin. Nhóm thuốc này có thể gây ra các tác dụng không mong muốn nghiêm trọng
như: buồn ngủ, khô mắt, dị ứng, lệ thuộc thuốc [3]. Đặc biệt khi được trộn lẫn vào các
chế phẩm đông dược và dùng trong thời gian dài thì sẽ càng làm trầm trọng hơn các tác
dụng không mong muốn. Trong nhóm thuốc kháng histamin, thì các thuốc thuộc thế hệ
1 bên cạnh tác dụng điều trị dị ứng còn có tác dụng an thần, giúp người bệnh dễ chịu và
ngủ ngon, do đó có nguy cơ trộn cao hơn thế hệ 2. Chlorpheniramin, cyproheptadin, và
loratadin là 3 thuốc kháng histamin thế hệ 1 có liều dùng thấp, rẻ tiền, dễ mua, là lựa
chọn đầu tay khi điều trị dị ứng nên có khả năng bị trộn trái phép cao trong chế phẩm
đông dược.
Sử dụng thuốc và thực phẩm chức năng (TPCN) có nguồn gốc từ đông dược thay
thế cho các chế phẩm có nguồn gốc tổng hợp hóa dược đang là một xu thế phổ biến ở
Việt Nam và trên thế giới. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% người dân
ở các nước đang phát triển sử dụng thường xuyên các thuốc cổ truyền trong chăm sóc
sức khỏe [20]. Nhiều chế phẩm đông dược đã được đưa vào thị trường để đáp ứng nhu
cầu chăm sóc sức khỏe của người dân, tuy nhiên, trong đó vẫn tồn tại nhiều chế phẩm
pha trộn với tân dược [15], [20]. Các tân dược được tìm thấy điển hình là thuốc điều trị
đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc
chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng,
glucocorticoid… [14], [21], [24], [30]. Trong đó, đã có một số công bố về các thuốc
chống dị ứng bao gồm nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 như chlorpheniramin,
cetirizin, diphenylhydramin, loratadin… [21], [26], [29]

1


Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện tân dược trộn lẫn trong đông dược,
chủ yếu thuộc các nhóm giảm đau chống viêm không steroid, hạ huyết áp, hạ đường
máu, glucocorticoid [7], [8], [10], [11], nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu nào về việc
trộn lẫn các tân dược chống dị ứng nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 trong chế phẩm
đông dược được công bố.
Các phương pháp hay được sử dụng trong phát hiện tân dược trộn trái phép trong
chế phẩm đông dược bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC), sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC). TLC có thể phân tích nhiều mẫu
cùng một lúc, quy trình xử lý mẫu đơn giản, thường dùng trong giai đoạn sàng lọc. Tuy
nhiên những phương pháp trên vẫn còn hạn chế như có thể cho kết quả âm tính giả hoặc
dương tính giả. Hiện nay, phương pháp phân tích sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LCMS/MS) là một phương pháp phân tích hiện đại ở Việt Nam, đang từng bước được ứng
dụng rộng rãi trong phân tích và kiểm nghiệm thuốc. Tập hợp khả năng phân tách chất
của sắc ký lỏng (LC) và khả năng phát hiện, định lượng của khối phổ (MS), phương
pháp cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp trong phân tích trên nền mẫu phức tạp
như chế phẩm đông dược.
Với mục đích góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn
trong chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Xây dựng phương
pháp xác định các thuốc kháng histamin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng
LC-MS/MS và TLC”. Với mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời chlorpheniramin maleat,
cyproheptadin hydroclorid, loratadin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng
rắn bằng LC-MS/MS và TLC.
2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định các dược chất trên trộn trái
phép trong một số chế phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường.

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1. Nhóm thuốc đối kháng thụ thể Histamin H1
Trên lâm sàng thuốc kháng histamin H1 dùng để ngăn ngừa các biểu hiện dị ứng,
ngăn ngừa chứng say tàu xe. Vài thuốc kháng histamin H1 khác còn có thể dùng để điều
trị ốm nghén, chúng có tác dụng chống nôn và chống dị ứng.
Thuốc kháng histamin H1 có 2 thế hệ . Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1 như:
chlorpheniramin, diphenhydramin... thường có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương
gây an thần, tuy nhiên mức độ tác dụng không giống nhau giữa các thuốc và các cá thể.
Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 2 như: loratadin, cyproheptadin... hầu như không có
tác dụng này.
Tác dụng không mong muốn:
Thay đổi tuỳ theo từng cá thể, thường biểu hiện ức chế thần kinh (ngủ gà, khó chịu,
giảm phản xạ, mệt), chóng mặt, thường gặp ở các thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1.
Tác dụng an thần trên gây nguy hiểm cho người sử dụng thuốc khi lái tàu, xe, làm việc
trên cao, công việc cần sự tỉnh táo.
Các kháng histamin H1 làm tăng tác dụng của rượu và các thuốc ức chế thần kinh
trung ương, gây chóng mặt, mệt mỏi, mất sự phối hợp nhịp nhàng, ù tai, bồn chồn, tăng
co giật (động kinh) ở trẻ em. Ở cùng liều điều trị, các thuốc thế hệ 2 ít gây tác dụng
không mong muốn hơn.
Các kháng histamin H1 thế hệ 1 còn có tác dụng kháng cholinergic nên gây khô
miệng, họng và mũi. Ngoài ra còn gây căng ngực, đau đầu. Trên tiêu hóa, gây ăn kém
ngon, nôn, buồn nôn, tiêu chảy….
1.1.1.1. Chlorpheniramin maleat
- Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C16H19ClN2.C4H4O4 (M=390,9).

3


- Tên khoa học: (RS) -3-(4 clorophenyl) - 3 - (2-pyridyl) propyldimethylamin hydrogen
maleat.
- Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, không mùi. Dễ tan trong nước,
tan trong ethanol 96 %, cloroform; ít tan trong ether và benzen [6].
- Liều dùng: Người lớn: 4 mg cách 4 - 6 giờ/lần. Tối đa: 24mg/ngày (người cao tuổi tối
đa 12mg/ngày) [5].
1.1.1.2. Cyproheptadin hydroclorid
- Công thức cấu tạo:

.

.

- Công thức phân tử: C21H21N.HCl.3/2H2O (M= 350.9).
-

Tên

khoa

học:

4-(5H-dibenzo[a,d]

cyclohepten-5-yliden)-1-methylpiperidin

hydroclorid.

- Tính chất vật lý: Bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng. Tương đốì
bển với ánh sáng, không khí và hơi ẩm ở nhiệt độ phòng. Chảy ở khoảng 162°C, dạng
khan ỏ 250°C. Ít tan trong nước, tan trong ethanol, không tan trong ether [6].
- Liều dùng: Người lớn: 4 mg/lần x 3-4 lần/ngày. Tối đa 0,5 mg/kg/24 giờ [4].
1.1.1.3. Loratadin
- Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C22H23ClN2O2 (M=382.9)
- Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, có tính chất đa hình. Thực tế
không tan trong nước, dễ tan trong aceton và methanol [6].
4


- Liều dùng : Người lớn và trẻ em từ 12 tuổi trở lên : dùng 1 lần trong ngày, liều 10 mg
[5].
1.1.2. Dược liệu và chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng
Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều các chế phẩm đông dược có số đăng ký có
tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa. Chúng đa dạng về thành
phần các loại dược liệu cũng như dạng bào chế (viên hoàn, thuốc bột, viên nang, cốm
tan). Một số vị dược liệu và chế phẩm đông dược có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị
dị ứng, mề đay, mẩn ngứa theo ‘Thông tư danh mục thuốc cổ truyền được Bộ Y tế ban
hành’ do bộ trưởng Bộ y tế ban hành ngày 31/10/2016 được minh họa trong bảng dưới
đây :
Bảng 1. 1. Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng
STT Dược liệu

Tên khoa học

Bộ phận dùng

1

Kim ngân hoa Flos Lonicerae

Hoa

2

Liên kiều

Fructus Forsythiae

Quả chín

3

Bồ công anh

Herba Taraxaci

Toàn cây

4

Thổ phục linh Smilax glabra

Thân rễ

5

Phòng phong

Radix Saposhnikoviae divaricatae

Rễ

6

Kinh giới

Spica Elsholtziae

Phần trên mặt đất

7

Cúc hoa

Flos Chrysanthemi

Hoa

8

Ngưu bàng tử

Fuctus Arctii

Quả chín

9

Bạc hà

Herba Menthae

Toàn cây

10

Ké đầu ngựa

Fructus Xanthii strumarii

Quả

11

Đạm đậu xị

Semen Sojae praeparata

Hạt

12

Đơn lá đỏ

Folium Excoecariae

Lá

13

Hoàng bá

Cortex Phellodendri

Vỏ thân

14

Xuyên khung

Rhizoma Ligustici wallichii

Thân rễ

15

Thuyền thoái

Periostracum Cicadae

Xác của con ve sầu

16

Sài đất

Herba Wedeliae

Toàn cây

5


1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN
TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC
Sử dụng thuốc và thực phẩm chức năng (TPCN) có nguồn gốc từ đông dược thay
thế cho các chế phẩm có nguồn gốc tổng hợp hóa dược đang là một xu thế phổ biến ở
Việt Nam và trên thế giới. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% người dân
ở các nước đang phát triển sử dụng thường xuyên các thuốc cổ truyền trong chăm sóc
sức khỏe [20]. Tuy nhiên sự pha trộn tân dược vào trong các bài thuốc cổ truyền đang
là thách thức lớn cho các cơ quan quản lý thuốc khi có nhiều báo cáo về các rủi ro ảnh
hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe do các chế phẩm từ đông dược được khẳng định là
hoàn toàn tự nhiên gây ra. Các tân dược được tìm thấy điển hình là thuốc điều trị đái
tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống
cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng,
glucocorticoid… [14], [21], [24], [30].
Nhóm thuốc kháng histamin H1 cũng được cho thấy là hay bị trộn vào các chế
phẩm đông dược vì tác dụng chống dị ứng và tác dụng an thần của nó. . Một nghiên cứu
ở Mỹ chỉ ra rằng trong số 243/260 loại thuốc đông dược ở châu Á đã được thu thập từ
các cửa hàng thảo dược bán lẻ ở California, có 17 loại (7%) chứa tân dược không được
khai báo. Trong đó, chlorpheniramin là 1 trong 4 loại tân dược không khai báo phổ biến
nhất [27]. Ở Trung Quốc, YE Lin-hu và cộng sự sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo
sát 7 antihistamin bao gồm loratadin, diphenhydramin hydrochlorid, cyproheptadin
hydrochlorid, cetirizin hydrochlorid, promethazin hydrochlorid, mizolastin, and
chlorpheniramin maleat trên 9 loại chế phẩm thảo dược, kết quả đã xác định 4 mẫu chế
phẩm đã bị lẫn với các antihistamin trên [29]. Ở Hàn Quốc, Jung Yeon Kim và cộng sự

sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát trên 117 mẫu chế phẩm chăm sóc sức khỏe
và đã phát hiện 1 mẫu chứa diphenhydramin [26].
Các phương pháp phổ biến xác định các thuốc kháng histamin trộn trong chế
phẩm đông dược đã tham khảo được tổng hợp trong bảng sau:

6


Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu phân tích các thuốc kháng histamin trộn trái phép trong
chế phẩm đông dược
Nền mẫu
Trà

Hoạt chất

thảo Chlorpheniramin

dược

Phương pháp phân
tích
UHPLC – MS/MS

Xử lý mẫu

Tài
liệu

Chiết mẫu bằng [31]

Cột XBridge BEH C18 acetonitril, tinh
(100 mm x 2,1 mm; chế theo quy
trình
3,5 μm)
Pha động: acetonitril QuEChERS
/0,1% acid

formic

(tt/tt)
Viên nang, Diphenhydramin
viên nén,
chất lỏng,
bột
thảo
dược

LC-ESI-MS/MS

Chiết mẫu bằng [26]
Cột Acquity UPLC methanol, siêu
BEH C18 ( 100 x 2,1 âm 10 phút
mm; 1,7 µm)
Pha động: 0,1% acid
formic trong nước và
0,1% acid formic trong
acetonitril

Detector:

ESI-MS.
Viên nén, Loratadin,
thuốc mỡ, Diphenhydramin
kem
hydrochlorid,
Cyproheptadin
hydrochlorid,
Cetirizin

Chiết mẫu bằng [29]
Cột Agilent Eclipse methanol 80%,
Plus C18 (2,1 mm × 50 siêu âm 30
phút, ly tâm.
mm; 3,5 μm）
Tốc độ
ml/phút

dòng:

0,4

hydrochlorid,
Promethazin
hydrochlorid,
Mizolastin,

Pha động: 0,1% acid
formic trong nước và
0,1% acid formic trong
acetonitril

Chlorpheniramin
maleat

Detector: ESI-MS.

Viên nang, Chlorpheniramin
viên nén, maleat
bột, dung
dịch

LC-MS/MS

LC-MS/MS

Chiết mẫu
[14]
bằng dung môi:
Cột: Superspher 100
RP-18 (125 × 3 mm; 4 MeOH hoặc
isopropanol :
µm), cột bảo vệ:
7


Superspher 100 RP-18 dichlormethan
(4 × 4 mm; 4 µm)

(1:9)

Thể tích tiêm: 25 µl
Tốc độ dòng: 0,3

Tác động: Siêu
âm, lắc quay, ly

ml/phút

tâm

Pha động: ACN và
đệm amoni format 10
mM (pH 3,0)
(gradient)
Detector: ESI-MS
Viên nang, Chlorpheniramin

FEPC–DCBI-MS

Mẫu rắn: thêm

viên nén,
dung dịch

Giấy sắc kí: giấy lọc dung môi
Xinhua Grade 1 (tam EtOH, lắc tạo
giác cân: đáy 1cm, nhũ tương.

[22]

Mẫu lỏng: đưa
Nhiệt độ sắc kí: 25 ˚C trực tiếp vào hệ
Pha động: ethyl acetat sắc kí.
: ammoniac 28% trong
chiều cao 4 cm).

nước (10:1).
Thể tích chấm: 10µl.
Detector: DCBI-MS
Dạng lỏng,
viên nang
cứng , viên
nang mềm,
viên nén,
bột.

Mẫu được
[25]
Cột:
Waters thêm Na2CO3
ACQUITY® UPLC pH=10, dịch
thu được đem
BEH C18 column
(150×2.1mm, 1.7 μm). chiết lỏng lỏng
Triprolidin,
với
Thể tích tiêm: 2µL
Epinastin,
ethylacetate.
Tốc độ dòng: 0.30

Azelastin,
Lấy phần dịch
mL/phút
Cyproheptadin,
thân dầu đem
Pha động: 0,1% acid
Hydroxyzin,
cô cắn rồi hòa
formic trong nước và
Fexofeadin,
tan cắn vào hỗn
0,1% acid formic trong
Diphenhydramin,
hợp dung môi
acetonitrile.
Levocetirizin,
acid formic
Detector: Q/TOF – MS
Cetrizin, Loratadin,
0,1% : MeOH
Desloratadin,
Chlorpheniramin,
Astemizole,
Bromopheniramin,
Ketotifen Fumarat,

UHPLC-Q/TOF-MS

Olopatadin,

(1:1).
8


Tác động: siêu
âm, lắc xoáy,

Dimemhydrinat,
Acrivastin,

ly tâm, cô nitơ.

Promethazin,
Clemastin,
Terfenadin, Ebastin
Viên nén, Chlorpheniramin
nang cứng,
nang mềm,
dạng lỏng,
gel.

LC-IT/TOF-MS

Mẫu chiết bằng [19]
Cột:
Agilent methanol, sau
ZORBAX
Eclipse đó dịch chiết
AAA (150 mm × 4.5 đem đi chiết
lỏng lỏng với

mm, 5 μm).
Pha động: 0,1% acid acetonitrile
acetic trong nước và chưa 1% acid
0,1% acid acetic trong formic.
Tác động: ly
acetonitrile.
tâm, lắc xoáy
Thể tích tiêm: 10 µl
Tốc độ
ml/phút.

dòng:

0,5

Detector: IT/TOF-MS

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.3.1. Phương pháp LC-MS/MS
Sắc kí lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các
chất trong hỗn hợp của bộ phân sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khả năng phân
tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (MS).
Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao. Giới hạn phát hiện
(LOD) có thể đến 10-14 gam. Do vậy, phân tích khối phổ càng được áp dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ như xác định các đồng vị, xác định công thức
cấu tạo, định tính, định lượng các chất có trong dịch sinh học và trong các sản phẩm có
nguồn gốc tự nhiên. Đặc biệt dùng để phân tích hàm lượng vết trong mẫu có thành phần
phức tạp [1], [9].
Phương pháp khối phổ là phương pháp phân tích dựa trên cơ sở xác định khối
lượng phân tử của các hợp chất bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỷ số giữa khối

9


lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện
tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa… Các ion tạo thành này được tách theo
tỷ số m/z và được phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân
tử của hợp chất [2]

Cấu tạo thiết bị khối phổ:

Hình 1. 1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS
1, Bộ nạp mẫu: đưa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn cần chuyển
sang dạng hơi. Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc
ký.
2, Bộ nguồn ion hóa: ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí
hoặc hơi.
Có ba kiểu hình thành ion thường gặp: Ion hóa phun điện tử (Electrospray
Ionizaton – ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Photonization – APPI). Trong đó, kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được sử dụng phổ
biến nhất.

Hình 1. 2. Sơ đồ sự tạo thành ion dương trong ESI
3, Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách
riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector. Có nhiều bộ phận phân

10


tích khối khác nhau như: bộ phân tích tứ cực, phân tích tứ cực chập ba, phân tích bẫy

ion, phân tích thời gian bay…
Trong đó, bộ tứ cực (Quadrupole) dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác
nhau sẽ dao động khác nhau theo điện áp tổng hợp một chiều và xoay chiều đặt vào môi
trường di chuyển của nó.

Hình 1. 3. Bộ phân tích tứ cực
Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm 3 tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3
(gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ.

Q0

Q1

Q2

Q3

Hình 1. 4. Mô hình bộ phân tích tứ cực chập ba
Trong đó:
Q0: nguồn ion mẹ.
Q1: bộ tứ cực thứ nhất, có nhiệm vụ tách các ion. Lựa chọn ion mẹ với m/z nhất
định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2.
Q2: bộ tứ cực thứ hai, ở điều kiện áp suất cao, các ion mẹ bị phân ly do va chạm
với khí trơ có mặt như N2, Ar, He. Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh
tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con. Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó
nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến. Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ
tách Q3.
Q3: bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ
phận phát hiện.
Thiết bị khối phổ ba tứ cực gọi là máy khối phổ hai lần (LC-MS/MS).

4, Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch
đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
11


5, Bộ phận ghi và xử lí số liệu (data system):
Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục
vụ xử lỹ dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ,
định lượng… Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm:
- SCAN: khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion
để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích.
- SIM (Selected Ion Monitoring): trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ cho tín hiệu
của các ion đã được lựa chọn trước đó, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát
năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
- SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring):
SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion
sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
MRM: cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất , phân mảnh ion cô lập đó
tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều)
ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
Ưu điểm của phương pháp LC-MS/MS:
- Phát huy được thế mạnh của cả sắc ký lỏng (thời gian lưu) và khối phổ (phát
hiện chất dựa vào tỷ số m/z) nên có tính đặc hiệu cao.
- Trên nền mẫu có tính chất phức tạp như chế phẩm đông dược, LC-MS/MS là
kỹ thuật có độ nhạy vượt trội có khả năng loại bỏ được ảnh hưởng của nền mẫu.
Hạn chế:
Giá thành cao, thiết bị phức tạp.
1.3.2. Phương pháp TLC
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật sắc ký dùng để tách các chất trong hỗn

hợp nhiều thành phần, được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó
đã có hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 - 30
µm, được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất, dày khoảng 250 µm trên
giá đỡ làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Một số chất thường dùng làm pha
tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex,... trong đó được
dùng phổ biến nhất là silica (SiO 2) và nhôm oxyd.
12


Pha động thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký. Cơ chế tách có thể là hấp phụ,
phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế, tùy
thuộc vào tính chất của hai pha. Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2 - 3
dung môi. Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn. Các chất phân tích sẽ
di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng
được tách riêng, có vị trí khác nhau trên bản mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức
độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf . Trị số này được tính bằng
tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường di chuyển của
pha động [1].
Rf = dR /dM
dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên
cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
Rf : có giá trị dao động giữa 0 và 1.
Ưu điểm của TLC:
- Chi phí thấp, thiết bị đơn giản.
- Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng
lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.
- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng,
khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên hạn chế sự
tác động của môi trường giữa các lần phân tích.

- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước khi cho các dung môi như
lọc và khử khí, lượng tiêu thụ pha động thấp cho mỗi mẫu.
Hạn chế của TLC:
Nền mẫu đông dược rất phức tạp, thành phần đa dạng, các thành phần trong dược
liệu có thể xuất hiện tại vị trí phát hiện chất phân tích nên có thể xảy ra hiện tượng dương
tính giả hoặc âm tính giả khi phương pháp không đáp ứng về độ nhạy.
Độ lặp lại của Rf thấp do thành phần pha động thay đổi khi tiến hành sắc ký đối
với dung môi dễ bay hơi.

13


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn
Bảng 2. 1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
Nguyên liệu

STT

1
Chất
chuẩn

Tiêu

Nguồn gốc

chuẩn

Chlorpheniramin

Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

maleat

DĐVN

SKS: WS.0317032.03 HL: 99,10%

Cyproheptadin

Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

hydrochlorid

PTN

SKS: 0102126 HL: 100,64%

Chuẩn

Chuẩn VKNTTW

PTN

SKS: SKS 0108242 HL: 99,6%

2

3

Loratadin

4

Acetonitril

HPLC

Merck - Đức

Hóa

5

Acid formic

PA

Merck - Đức

chất

6

Ethanol

AR

Trung Quốc

7

Methanol

HPLC

Merck - Đức

8

Cloroform

PA

Trung Quốc

9

Acid acetic

PA

Trung Quốc

10

Amoniac

PA

Trung Quốc

2.1.2. Máy móc – trang thiết bị
- Bình khai triển sắc kí TLC CAMAG.
- Bản mỏng silicgel GF254 của Merck – Đức
- Máy sắc ký lỏng 2 lần khối phổ LC/MS/MS: Triple Quadrupole BRUKER
EVOQ Qube – Mỹ.
Và các dụng cụ khác.
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
* Mẫu thử: Các chế phẩm đông dược và thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng bào
chế viên nang cứng, viên hoàn, thuốc bột có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các
trường hợp mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đang lưu hành tại Việt Nam.
14


- Nơi thu thập mẫu: từ các hiệu thuốc đông y, thuốc gia truyền, mạng internet,
mẫu gửi.
- Nơi lưu hành mẫu: Hà Nội, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Hà Tĩnh, An Giang, Phú
Yên.
- Dạng bào chế: viên hoàn, viên nang cứng, thuốc bột.
* Mẫu trắng: 3 nền mẫu dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích
được xây dựng dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh
điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị
ứng đã công bố. Cả 3 nền mẫu được chế tạo tại Công ty Cổ phần Traphaco – Hà Nội.

- Nền N1 (viên hoàn): Dựa vào bài thuốc cổ tryền Ngân kiều tán trong sách Ôn
bệnh điều biện và Dược điển Việt Nam V, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù
hợp với tác dụng điều trị, gồm 9 loại dược liệu như sau: kim ngân hoa, liên kiều, cát
cánh, bạc hà, đạm trúc diệp, kinh giới tuệ, lô căn, ngưu bàng tử, cam thảo. Các bước tiến
hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều, vê thành viên, bao màu,
sấy khô, đóng gói.
- Nền 2 (bột cốm): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Liên kiều bại độc tán trong sách
Thương hàn toàn sinh tập gồm 14 loại dược liệu như sau: liên kiều, chi tử, khương hoạt,
huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy,
hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử. Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu,
thêm tá dược tạo khối ẩm, xát hạt qua rây, sấy hạt, sửa hạt, đóng gói.
- Nền 3 (viên nang): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Tiêu phong tán trong sách Y
tông kim giám, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với tác dụng điều trị,
gồm 11 loại dược liệu như sau: kinh giới, phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền thoái, sinh
địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo. Các bước
tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều tạo khối ẩm, rây
qua rây tạo hạt, sấy hạt, thêm tá dược thích hợp, đóng nang.
* Mẫu tự tạo: Mẫu trắng có thêm các chất phân tích với tỉ lệ nhất định.

15


2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
* LC-MS/MS: Dựa vào tính tan của các chất phân tích và một số nghiên cứu đã
công bố [6], [22], [26], [14], [19], [29] tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc hóa
dược từ nền mẫu qua các bước sau:
- Khảo sát dung môi chiết: MeOH, EtOH, ACN, hỗn hợp MeOH : H2O theo các
tỉ lệ khác nhau.
- Khảo sát thời gian siêu âm: 5 – 15 phút.

Quy trình chiết xuất các đối tượng nghiên cứu đối với LC-MS/MS gồm các bước
như sau:
- Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu.
- Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng 1/10 liều dùng vào ống falcon 50 ml,
thêm chính xác 25 ml dung môi chiết, lắc đều.
- Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong thời gian thích hợp ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần dịch trong pha loãng tới nồng
độ thích hợp bằng MeOH, lọc qua màng lọc 0,22 µm, tiến hành phân tích.
* TLC: Dựa trên kết quả khảo sát dung môi chiết và thời gian siêu âm của phương
pháp LC-MS/MS, xây dựng quy trình chiết xuất các đối tượng nghiên cứu đối với TLC
gồm các bước như sau:
- Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu.
- Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng ½ liều dùng vào ống falcon 50 ml,
thêm chính xác 20 ml dung môi chiết, lắc đều.
- Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong thời gian thích hợp ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần dịch trong pha loãng tới nồng
độ thích hợp bằng MeOH.
- Lấy chính xác 10 ml dịch sau ly tâm đem cô nitơ đến cắn. Hòa cắn bằng 1ml
MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành phân tích bằng TLC.
2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích
2.2.2.1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS
Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

16