PHẠM THỊ HỒNG NHUNG xây DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG GLICLAZID TRONG VIÊN nén GLICLAZID 30 MG GIẢI PHÓNG kéo dài KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
----- oOo-----

PHẠM THỊ HỒNG NHUNG

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG
GLICLAZID TRONG VIÊN NÉN
GLICLAZID 30 MG GIẢI PHÓNG KÉO DÀI

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ HỒNG NHUNG
Mã sinh viên: 1401456

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG
GLICLAZID TRONG VIÊN NÉN
GLICLAZID 30 MG GIẢI PHÓNG KÉO DÀI
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. ThS. Bùi Thị Lan Phƣơng
Nơi thực hiện:
Phòng Phân tích - Kiểm nghiệm và

Tƣơng đƣơng sinh học, Viện Công
nghệ dƣợc phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện và hoàn thành khoá luận này, em đã nhận đƣợc rất
nhiều sự giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ thầy cô, từ anh chị hƣớng dẫn và sự động viên
từ bạn bè, gia đình.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS.
Nguyễn Thị Kiều Anh và ThS. Bùi Thị Lan Phƣơng, là những ngƣời trực tiếp hƣớng
dẫn, đã dành nhiều tâm sức và thời gian giúp em hoàn thành khoá luận.
Cùng với đó, em cũng xin cảm ơn các anh chị Phòng Kiểm nghiệm - Phân tích
và Tƣơng đƣơng sinh học - Viện Công nghệ dƣợc phẩm Quốc gia, ThS. Ngô Quang
Trung, NCS. Phạm Thị Hiền, ThS. Đỗ Ngọc Cƣơng, DS. Vũ Thị Hoa, DS. Nguyễn
Thị Huyền, đã tạo điều kiện để em có không gian thực nghiệm tốt nhất và giúp đỡ em
giải quyết đƣợc rất nhiều vấn đề còn khúc mắc.
Xin gửi lời biết ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội,
tới các thầy cô – những ngƣời truyền đạt kiến thức và dìu dắt em trong cả hành trình 5
năm học tại trƣờng.
Và cuối cùng, em xin biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè – những ngƣời luôn
theo sát, động viên, giúp đỡ, luôn ủng hộ giúp em hoàn thành khoá học và khoá luận
này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Sinh viên
Phạm Thị Hồng Nhung


LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về gliclazid ...................................................................................... 3
1.1.1. Hoạt chất gliclazid ............................................................................................ 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt chất gliclazid .......................................................... 5
1.1.3. Các phương pháp định lượng gliclazid............................................................. 6
1.2. Tổng quan về HPLC ........................................................................................ 10
1.2.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ..................................................................... 10
1.2.2. Cấu tạo hệ thống HPLC .................................................................................. 11
1.2.3. Các thông số đặc trưng ................................................................................... 12
1.2.4. Một số phương pháp định lượng bằng HPLC................................................. 14
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 16
2.1. Điều kiện thực nghiệm ..................................................................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 16
2.1.2. Hoá chất, dung môi ......................................................................................... 16
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................................. 16
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 17
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng gliclazid bằng HPLC ............................. 17
2.2.2. Thẩm định phương pháp ................................................................................. 17
2.3. Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng đã xây dựng xác định hàm lƣợng
gliclazid trong viên nén gliclazid giải phóng kéo dài ................................................ 19
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 20
3.1. Chuẩn bị mẫu ................................................................................................... 20


3.1.1. Mẫu chuẩn ....................................................................................................... 20

3.1.2. Mẫu thử ........................................................................................................... 20
3.2. Lựa chọn dung môi pha mẫu và điều kiện sắc ký ......................................... 20
3.2.1. Lựa chọn dung môi pha mẫu........................................................................... 20
3.2.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký ............................................................................... 21
3.3. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng ............................................................. 21
3.3.1. Độ đặc hiệu ..................................................................................................... 21
3.3.2. Độ phù hợp của hệ thống ................................................................................ 23
3.3.3. Xây dựng đường chuẩn ................................................................................... 24
3.3.4. Độ lặp lại......................................................................................................... 25
3.3.5. Độ chính xác trung gian.................................................................................. 26
3.3.6. Độ đúng ........................................................................................................... 28
3.4. Ứng dụng phƣơng pháp đã xây dựng trong định lƣợng hàm lƣợng
gliclazid ......................................................................................................................... 29
BÀN LUẬN .................................................................................................................. 34
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 36
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 37
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DĐVN V

Dƣợc điển Việt Nam V

ĐTĐ

Đái tháo đƣờng

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

IDF

Liên đoàn Đái tháo đƣờng Thế giới
(International Diabetes Federation)

MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

MS

Khối phổ (Mass spectrometry)

MLC

Sắc ký lỏng sử dụng chất diện hoạt
(Micellar liquid chromatography)

NIDDM

Đái tháo đƣờng không phụ thuộc insulin
(Non-insulin dependent diabetes)

RPTLC

Sắc ký lớp mỏng pha đảo
(Reversed phase thin layer chromatography)

r

Hệ số tƣơng quan

RSD

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

S

Diện tích pic

SD

Độ lệch chuẩn

STT

Số thứ tự

TEA

Triethylamin

TFA

Acid trifluoroacetic

tR

Thời gian lƣu

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)

v/v

Thể tích/thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Nội dung

Trang

Bảng 1.1

Các phƣơng pháp định lƣợng gliclazid trong huyết tƣơng

7

Bảng 1.2

Các phƣơng pháp định lƣợng gliclazid trong dƣợc phẩm

9

Bảng 2.1

Nguyên liệu chuẩn dùng trong nghiên cứu

16

Bảng 2.2

Các hoá chất dùng trong nghiên cứu

16

Bảng 2.3

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

16

Bảng 2.4

Các dụng cụ dùng trong nghiên cứu

17

Bảng 3.1

Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống

24

Bảng 3.2

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của gliclazid

25

Bảng 3.3

Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp

26

Bảng 3.4

Kết quả khảo sát độ chính xác khác ngày của phƣơng pháp

27

Bảng 3.5

So sánh độ lặp của phƣơng pháp trong hai ngày khác nhau

27

Bảng 3.6

Kết quả thẩm định độ đúng của phƣơng pháp

29

Bảng 3.7

Kết quả định lƣợng gliclazid trong một số chế phẩm viên nén
giải phóng kéo dài gliclazid 30 mg

30


DANH MỤC CÁC HÌNH
Nội dung

Hình

Trang

Hình 1.1

Công thức cấu tạo của gliclazid

3

Hình 1.2

Nguyên tắc của quá trính sắc ký

11

Hình 1.3

Cấu tạo hệ thống HPLC

11

Hình 3.1

Sắc ký đồ của gliclazid chuẩn pha trong MeOH

21

Hình 3.2

Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu

22

Hình 3.3

Độ tinh khiết của gliclazid trong dung dịch thử

23

Hình 3.4

Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích

25

pic và nồng độ gliclazid
Hình 3.5

Biểu đồ kết quả định lƣợng các chế phẩm viên nén

32

gliclazid giải phóng kéo dài 30 mg
Hình 3.6

Sắc ký đồ của một số chế phẩm định lƣợng

33


ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đƣờng là một bệnh chuyển hóa, đặc trƣng bởi tình trạng tăng đƣờng huyết
mạn tính, có các biểu hiện rối loạn chuyển hoá carbohydrat, lipid và chuyển hóa protein.
Nguyên nhân là do khiếm khuyết trong bài tiết insulin (typ 1), hoạt động insulin (typ 2)
hoặc cả hai [24].
Theo Liên đoàn Đái tháo đƣờng Thế giới (IDF), năm 2015 toàn thế giới có 415
triệu ngƣời (trong độ tuổi 20-79) bị bệnh đái tháo đƣờng (ĐTĐ), tƣơng đƣơng cứ 11
ngƣời có 1 ngƣời bị ĐTĐ, đến năm 2040 con số này sẽ là 642 triệu, tƣơng đƣơng cứ 10
ngƣời có 1 ngƣời bị ĐTĐ. Bên cạnh đó, cùng với việc tăng sử dụng thực phẩm không
thích hợp, ít hoặc không hoạt động thể lực ở trẻ em, bệnh ĐTĐ typ 2 đang có xu hƣớng
tăng ở cả trẻ em, trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng [4]. Năm 2017, số
ngƣời mắc bệnh đái tháo đƣờng trong độ tuổi từ 20 đến 79 trên thế giới là 425 triệu và

năm 2045, con số này dự kiến là 629 triệu ngƣời. Ở châu Âu, số ngƣời mắc bệnh đái
tháo đƣờng trong cùng độ tuổi là 58 triệu và số ngƣời dự kiến sẽ tăng lên 67 triệu ngƣời
[19].
Ở Việt Nam, theo kết quả điều tra STEPwise về các yếu tố nguy cơ của bệnh không
lây nhiễm do Bộ Y tế thực hiện năm 2015, ở nhóm tuổi từ 18-69, cho thấy tỷ lệ ĐTĐ
toàn quốc là 4,1%, tiền ĐTĐ là 3,6% [4]. Năm 2017, ƣớc tính số ngƣời mắc đái tháo
đƣờng trong độ tuổi từ 20 - 79 là 334 nghìn ngƣời (đã đƣợc chẩn đoán), trong đó tỷ lệ
mắc đái tháo đƣờng typ 2 là chủ yếu và đự đoán đến năm 2045, con số này sẽ tăng lên
đến 583 nghìn ngƣời [22].
Để điều trị đái tháo đƣờng typ 2 sau khi cơ thể không đáp ứng với các biện pháp
không dùng thuốc nhƣ điều chỉnh chế độ ăn, vận động thể lực,.. thì cần thiết phải sử
dụng các thuốc có tác dụng hạ đƣờng huyết. Trong số các thuốc điều trị, dẫn chất
sulfonylure đang đƣợc quan tâm và sử dụng phổ biến.
Gliclazid là một thuốc hạ đƣờng huyết uống sulfonylure thế hệ thứ hai đƣợc sử
dụng trong điều trị đái tháo đƣờng không phụ thuộc insulin (NIDDM) và đƣợc chọn vào
danh sách các thuốc thiết yếu để điều trị ĐTĐ của Tổ Chức Y tế Thế giới. Gliclazid làm
giảm đƣờng huyết bằng cách điều chỉnh cả sự bài tiết insulin và tình trạng kháng insulin
ngoại biên. Hiện nay gliclazid dƣợc sử dụng rất phổ biến và các chế phẩm của nó cùng
với đó xuất hiện rất nhiều trên thị trƣờng dƣợc phẩm, cả trong và ngoài nƣớc. Vấn đề ở
đây là mặc dù đều có cùng mục đích điều trị nhƣng chất lƣợng của các chế phẩm này

1


rất cần phải đƣợc đánh giá, để từ đó chứng minh hiệu quả và an toàn trong quá trình sử
dụng. Trong đó một tiêu chí rất quan trọng góp phần đánh giá chất lƣợng của thuốc đó
là phải xác định đƣợc hàm lƣợng thực của hoạt chất có trong chế phẩm, chứng minh
đƣợc nằm trong giới hạn cho phép điều trị, đồng thời đây cũng là bƣớc đánh giá cơ bản
đầu tiên góp phần phục vụ công tác kiểm tra chất lƣợng của chế phẩm, từ đó hỗ trợ phát
triển công thức bào chế.

Chế phẩm viên nén giải phóng kéo dài chứa gliclazid đang đƣợc sử dụng ngày
càng phổ biến do hiệu quả và những lợi ích lớn mà nó mang lại nhƣ: tăng hiệu quả điều
trị, cải thiện tuân thủ sử dụng, giảm những nguy cơ sức khoẻ khi điều trị lâu dài... Tuy
vậy, những nghiên cứu phân tích về chế phẩm này còn hạn chế, chƣa đáp ứng đƣợc tính
sẵn có để phục vụ cho các lĩnh vực khác nhƣ bào chế, thử tƣơng đƣơng sinh học, đánh
giá PK/PD…cụ thể là chƣa đƣợc xây dựng thành chuyên luận riêng trong Dƣợc điển
Việt Nam và một số dƣợc điển khác nhƣ USP, BP…
Từ những lý do ở trên, đề tài: ―Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng gliclazid
trong viên nén gliclazid 30 mg giải phóng kéo dài‖ đƣợc thực hiện với các mục tiêu
sau:
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng gliclazid trong viên nén
gliclazid 30 mg giải phóng kéo dài bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Ứng dụng phương pháp định lượng đã xây dựng để xác định hàm lượng gliclazid
trong các chế phẩm bào chế phục vụ đánh giá chất lượng viên nén gliclazid 30 mg giải
phóng kéo dài.

2


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về gliclazid
1.1.1. Hoạt chất gliclazid
1.1.1.1. Cấu tạo hóa học [3,11]
 Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của gliclazid
 Tên khoa học: 1-(3 azabicyclo[3,3,0]-oct-yl)-3-(p- tolylsulfonyl) ure
 Công thức phân tử: C15H21N3O3S
 Khối lƣợng phân tử: 323,41 g/mol.
1.1.1.2. Tính chất

Gliclazid ở dạng tinh thể trắng hoặc bột kết tinh trắng, không mùi, không vị, tan
tốt trong cloroform, dicloromethan, tan vừa trong aceton, tan tốt trong MeOH, hầu nhƣ
không tan trong nƣớc [12,13].
1.1.1.3. Tác dụng dược lý
Gliclazid có thể có tác dụng giúp phục hồi độ nhạy insulin ngoại biên, nhƣ giảm
sản xuất glucose ở gan, tăng độ thanh thải glucose và tăng hoạt động tổng hợp glycogen
của cơ xƣơng [3,4,33].
Gliclazid có thể hạn chế các nguy cơ tim mạch ở những bệnh nhân mắc đái tháo
đƣờng không phụ thuộc insulin [21].
1.1.1.4. Dược động học
Gliclazid dễ hấp thu qua đƣờng tiêu hoá. Nồng độ đỉnh của thuốc trong huyết
tƣơng đạt sau khi uống khoảng 2 - 4 giờ. Thức ăn không làm thay đổi tốc độ và mức độ
hấp thu [3,17].
Thể tích phân bố (Vd ) của gliclazid thấp (13 đến 24 lít) có thể đƣợc giải thích
một phần do liên kết protein cao (85 đến 97%) [33].
Gliclazid đƣợc chuyển hóa chủ yếu ở gan thành những sản phẩm không còn hoạt
tính [3].

3


Thuốc chƣa biến đổi và các chất chuyển hoá chủ yếu đƣợc đào thải qua nƣớc tiểu
(60 - 70%). Khoảng 10 đến 20% qua phân ở dạng chuyển hoá. Suy thận ít ảnh hƣởng
đến dƣợc động học của gliclazid [3].
Thời gian bán thải (t1/2) của gliclazid khi sử dụng đơn liều và uống lặp lại từ 40
đến 120 mg là 8,1 - 20,5 giờ. Độ thanh thải huyết tƣơng khoảng 0,78 lít/giờ (tƣơng ứng
13 ml/phút) [3,33].
1.1.1.5. Chỉ định
Đái tháo đƣờng không phụ thuộc insulin typ 2 ở ngƣời lớn khi không còn kiểm
soát đƣợc glucose huyết bằng chế độ ăn, luyện tập thể lực và giảm cân [3].

1.1.1.6. Chống chỉ định
Không đƣợc dùng gliclazid cho các trƣờng hợp sau:
 Ðái tháo đƣờng phụ thuộc insulin (typ 1).
 Hôn mê hay tiền hôn mê do đái tháo đƣờng, nhiễm toan do đái tháo đƣờng
 Suy gan nặng, suy thận nặng.
 Có tiền sử dị ứng với sulfonamid và các sulfonylure khác.
 Phối hợp với miconazol viên.
 Nhiễm khuẩn nặng hoặc chấn thƣơng nặng, phẫu thuật lớn.
1.1.1.7. Tương tác thuốc
Sự phối hợp của một số thuốc có thể làm tăng hoặc giảm tác dụng hạ đƣờng huyết
của gliclazid:
Một số thuốc có khả năng làm tăng tác dụng hạ đƣờng huyết của gliclazid nhƣ
miconazol (dùng đƣờng toàn thân và gel bôi miệng), thuốc chống viêm không steroid
(đặc biệt là aspirin), sulfamid kháng khuẩn, thuốc chẹn β, diazepam, tetracyclin,
cloramphenicol, clofibrat, uống rƣợu cũng có thể làm tăng tác dụng hạ đƣờng huyết của
gliclazid.
Một số thuốc làm giảm tác dụng hạ đƣờng huyết của gliclazid nhƣ barbituric,
corticosteroid, thuốc lợi tiểu thải muối và thuốc tránh thai đƣờng uống [3].
1.1.1.8. Liều dùng và cách dùng
Gliclazid đƣợc khuyên dùng để điều trị đái tháo đƣờng typ 2 ở ngƣời trƣởng
thành không đáp ứng với việc thay đổi chế độ ăn uống.
Liều gliclazid phải phù hợp cho từng trƣờng hợp cụ thể và phải dựa theo lƣợng
đƣờng huyết của ngƣời bệnh. Với viên nén thông thƣờng, liều khởi đầu thƣờng là 40 –

4


80 mg uống một lần vào lúc ăn sáng rồi tăng dần nếu cần, lên tới tối đa là 320 mg/ngày.
Liều khởi đầu của viên Diamicron® MR 30 mg là 30 mg/ngày. Liều tối đa của
Diamicron® MR 30 mg là 120 mg/ngày (4 viên/ngày) [3].

1.1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt chất gliclazid
1.1.2.1. Trên thế giới
Năm 1955, thuốc sulfonylure có tác dụng hạ đƣờng huyết đầu tiên (carbutamid)
đƣợc sử dụng, mặc dù tác dụng của các hợp chất này đã đƣợc Loubatieres và Janbon
phát hiện vào năm 1942 [28]. Hơn 10 000 dẫn xuất của các hợp chất 'sulfonylure' này
đã đƣợc tổng hợp và thử nghiệm trên động vật, nhƣng chỉ một vài trong số chúng đã
thành công trên lâm sàng. Gliclazid là một thuốc hạ đƣờng huyết uống sulfonylure thế
hệ thứ hai có hiệu quả trong việc kiểm soát đƣờng huyết cho bệnh nhân mắc đái tháo
đƣờng không phụ thuộc insulin (NIDDM). Ngƣời ta đã đề xuất rằng gliclazid có thể phù
hợp cho bệnh nhân tiểu đƣờng bị suy thận và cả những bệnh nhân cao tuổi bị suy giảm
chức năng thận có nguy cơ hạ đƣờng huyết sau khi dùng một số sulfonylure khác
[23,33].
Trong lĩnh vực bào chế, dạng thuốc gliclazid giải phóng kéo dài đƣợc nghiên cứu
và đã đƣợc sử dụng thành công để điều trị bệnh tiểu đƣờng typ 2 nhằm cải thiện sự tuân
thủ lâu dài và tăng cƣờng khả năng kiểm soát đƣờng huyết chặt chẽ [31]. Các viên nén
giải phóng kéo dài 30 mg, 60 mg, 80 mg đã đƣợc sản xuất và lƣu hành trên thị trƣờng
dƣới nhiều tên thƣơng mại khác nhau (Diamicron® MR, Azukon® MR, Diaprel® MR,
Emicron®...). Bên cạnh đó, để nâng cao sinh khả dụng đƣờng uống của gliclazid, một số
nghiên cứu bào chế các dạng thuốc mới của gliclazid đƣợc thực hiện nhƣ hệ tiêu phân
mang thuốc nano lipid rắn [35], hệ tiểu phân nano mang gliclazid có chất mang là
chitosan [16], tạo phức với cyclodextrin [32]…
Trong lĩnh vực phân tích và kiểm nghiệm, một số kỹ thuật phân tích đã đƣợc mô
tả để xác định gliclazid trong dƣợc phẩm và chất lỏng sinh học, nhƣ sắc ký khí (GC)
[29], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2,25,26,34,36], sắc ký lớp mỏng pha đảo
(RPTLC) [22] và LC-MS [30]. Gần đây, phƣơng pháp sắc ký khối phổ sắc ký lỏng (LCMS) đã đƣợc phát triển nhƣng mới đủ nhạy để đo mức gliclazid trong các mẫu sinh học
với giới hạn định lƣợng (LOQ) là 0,1 µg/ml trong 0,5 ml huyết tƣơng [34] và 0,5 µg/ml
trong 1 ml huyết tƣơng [30]. Do đó, những cải tiến về phƣơng pháp để xác định nhanh

5

chóng và định lƣợng gliclazid trong các mẫu sinh học là rất cần thiết cho các thử nghiệm
lâm sàng.
1.1.2.2. Ở Việt Nam
Năm 2009, Võ Thụy Cẩm Vy và cộng sự (Khoa Dƣợc, ĐH Y dƣợc TP.HCM)
thực hiện đề tài ‗Nghiên cứu tương đương sinh học của viên Gliclazid 30 mg phóng
thích kéo dài‘. Kết quả đánh giá sinh khả dụng và tƣơng đƣơng sinh học in vivo cho thấy
chế phẩm thử nghiệm (Gliclazid SR 30 mg) tƣơng đƣơng sinh học với chế phẩm đối
chiếu (Diamicron® MR 30 mg). Nhƣ vậy hai chế phẩm này có thể dùng thay thế nhau
trong điều trị. Không có phản ứng có hại nào xảy ra cho ngƣời tình nguyện trong suốt
và sau 2 tuần thử nghiệm, chứng tỏ độ an toàn của công thức viên nghiên cứu [10]. Điều
này đã bƣớc đầu đáp ứng mong muốn trong tƣơng lai có thể tự sản xuất thế phẩm bào
chế để cung cấp cho thị trƣờng dƣợc phẩm.
Năm 2011, PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến và cộng sự thực hiện đề tài "Nghiên cứu
bào chế viên nén gliclazid giải phóng kéo dài" với mục tiêu xây dựng công thức bào chế
viên nén gliclazid 30 mg giải phóng kéo dài 8 giờ và đã bào chế đƣợc viên nén với công
thức ổn định ba tháng trong điều kiện thƣờng [7].
Năm 2013, Nguyễn Hạnh Thuỷ và PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến đƣa ra đƣợc công
thức bào chế pellet gliclazid nhân thích hợp nhằm cải thiện độ hòa tan cho gliclazid
trong pellet nhân. Đồng thời, nghiên cứu cũng đã xây dựng đƣợc công thức màng bao
kiểm soát giải phóng dƣợc chất từ pellet sử dụng Eudragit RS 100 và Eudragit RL100
[9].
Nhƣ vậy, với sự xuất hiện ngày càng phổ biến của bệnh đái tháo đƣờng typ 2 và
tầm quan trọng của gliclazid trong lâm sàng, thì những nghiên cứu về gliclazid cần đƣợc
phát huy và quan tâm trong mọi lĩnh vực: bào chế, lâm sàng, kiểm nghiệm và đánh giá
tƣơng đƣơng sinh học.
1.1.3. Các phương pháp định lượng gliclazid
1.1.3.1. Các phương pháp định lượng trong huyết tương

6

Bảng 1.1: Các phƣơng pháp định lƣợng gliclazid trong huyết tƣơng
Tài liệu

Phƣơng pháp

Điều kiện sắc ký

phân tích

LOQ

- Cột C18 Inertsil ODS 3V (4,6 x 250 mm, 5µm)
- Chất chuẩn nội: Celecoxib 20 µl
- Pha động:
Kênh A: dung dịch acid formic 0,01M (pH = 3)
[36]

HPLC

Kênh B: MeOH : nƣớc (90 : 10)
Kênh C: Nƣớc : MeCN (5 : 95)

500
ng/ml

- Detector UV – VIS: λ = 260 nm
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Thể tích tiêm: 100 µl

- Cột C18 (5 µm, 250 mm × 1.5 mm)
- Chất chuẩn nội: glyburid 100 µl
- Pha động: dung dịch KH2PO4 40 mM (pH 4.6)
[34]

HPLC

: MeCN : isopropyl alcohol (5:4:1, v/v/v)
- Detector UV – VIS: λ = 229 nm

100
ng/ml

- Tốc độ dòng: 0,22 ml/phút
- Thể tích tiêm: 30 µl

- Cột Chromolith RP – 18e (100 mm × 4.6 mm)
- Pha động: dung dịch K2HPO4 0,01 M : MeCN
(52:48, v/v) điều chỉnh tới pH 4
[20]

HPLC

- Detector UV – VIS: λ = 230 nm
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
- Thể tích tiêm: 30 µl

7

100

ng/ml


- Cột C18
- Chất chuẩn nội: tolbutamid
- Pha động: MeOH 0,5 % : acid formic (80 : 20,
[27]

LC ‐ ESI ‐ MS

v/v)

250

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

ng/ml

- Tín hiệu ion m/z 324,0 cho gliclazid đo ở chế
độ dƣơng
 Điều kiện sắc ký lỏng siêu tới hạn:
- Cột nucleosil C18
- Pha động: MeCN : nƣớc (80 : 20) lƣu lƣợng
dòng 0,2 ml/phút và CO2 lỏng siêu tới hạn lƣu
lƣợng 2,0 ml/phút
- Chất chuẩn nội: phenformin
[14]

SFC / MS / MS

- Thể tích tiêm: 20 µl
- Áp suất: 20 MPa
 Điều kiện khối phổ:
- Nhiệt độ buồng : 3000C
- Thế phân mảnh 215 V
- Tín hiệu ion m/z 324,0 đến 110,0 đối với
gliclazid

1.1.3.2. Các phương pháp định lượng trong dược phẩm

8

750
ng/ml


Bảng 1.2: Các phƣơng pháp định lƣợng gliclazid trong dƣợc phẩm
Phƣơng
Tài liệu

Mẫu thử

Điều kiện phân tích

pháp phân
tích

- Cột kích thƣớc (25 cm x 4,6 mm) đƣợc
nhồi pha tĩnh B (5 µm)
- Dung môi pha mẫu: MeCN : nƣớc (40

: 60, v/v)
Viên nén giải
[2]

phóng

nhanh

- Pha động: TFA : TEA : MeCN : nƣớc
HPLC

(0,1 : 0,1 : 40 : 60, v/v/v/v)
- Detector UV – VIS: λ = 235 nm

gliclazid 80 mg

- Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 µl

- Cột C18 Inertsil ODS 3V (4,6 x 250
mm, 5µm)
- Chất chuẩn nội: Celecoxib 20 µl
- Pha động:
Kênh A: dung dịch acid formic 0,01M

Viên nén giải
[36]

phóng nhanh

(pH = 3),

HPLC

Kênh B: MeOH : nƣớc (90 : 10)

Dianorm

Kênh C: nƣớc : MeCN (5 : 95)
- Detector UV – VIS: λ = 260 nm
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Thể tích tiêm: 100 µl
- LOQ = 100 ng/ml

9


- Cột Agilent Eclipse Plus C18

Viên nén

- Pha động: TEA : MeCN (43 : 57, v/v)

Gliclazid giải
[37]

phóng kéo dài
chứa gôm

HPLC

- Detector UV – VIS: λ = 229 nm
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

xanthan (chế
phẩm bào chế)
- Pha tĩnh : đĩa RP – 18
- Pha động: MeCN : dung dịch đệm

Viên nén giải
[22]

phóng nhanh

phosphat (pH 2,3) (60 : 40, v/v)
RPTLC

Diabrezide

- λ = 215 nm
- LOQ = 200 ng/ml

- Cột Nucleosil C18 (50 mm x 4,6 mm, 5
µm)
- Pha động: Natri dodecyl sulphat
[18]

Viên nén
Diamicron 80 mg

0,12M : n-propanol : TEA (99,7 : 10 :
MLC

0,3, v/v/v)
- Detector UV – VIS: λ = 254 nm
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 µl
- LOQ = 109 ng/ml

1.2. Tổng quan về HPLC
1.2.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Sắc ký lỏng hiệu năng cao còn đƣợc gọi là sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC) là một
kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong
cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao.

10


Hình 1.2: Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Chất tan đƣợc phân bố giữa pha tĩnh và pha động. Quá trình tách dựa trên tính
chất vật lý, hoá lý của các chất; dựa trên quá trình hấp phụ và giải hấp phụ xảy ra liên
tục giữa hai pha: pha tĩnh (chất rắn hoặc chất lỏng) và pha động (gồm một hoặc hỗn hợp
nhiều chất lỏng). Pha động hoà tan, đẩy chất phân tích di chuyển. Pha tĩnh lƣu giữ chất
phân tích. Đối với mỗi chất, sự lƣu giữ đƣợc quy định bởi ba lực F1, F2, F3; trong đó
lực F1, F2 giữ vai trò quyết định. F1 là lực giữ chất phân tích của pha tĩnh trên cột, F2
là lực của pha động kéo chất phân tích ra khỏi cột. Nhƣ vậy, các chất khác nhau có lực
F1, F2 khác nhau, do đó chúng di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và sẽ tách nhau
khi ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ đƣợc phát hiện và ghi lại dƣới dạng pic sắc
ký. Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho chúng ta sắc ký đồ [1,6].
1.2.2. Cấu tạo hệ thống HPLC

Hình 1.3: Cấu tạo hệ thống HPLC

11


1.2.3. Các thông số đặc trưng
1.2.3.1. Thời gian lưu tR
Thời gian lƣu là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất tan đƣợc
rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn,
thời gian lƣu của mỗi chất là xác định. Vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện
định tính các chất.
Thời gian lƣu phụ thuộc các yếu tố:
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thƣớc, độ xốp, cấu trúc xốp…
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.
- Trong một số trƣờng hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất tạo
phức, nếu các yếu tố này có ảnh hƣởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký
[1].
1.2.3.2. Hệ số phân bố K
Là đại lƣợng đặc trƣng cho sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh.
Cs
K=
CM
Trong đó:
CS là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh.
CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động.
K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong
hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn
[1].

1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’
Là đại lƣợng cho ta biết tỷ số khối lƣợng của chất tan phân bố vào pha tĩnh và
pha động.
k‘ = K

VS
VM

=

tR− tM
tM

Trong đó:
K : hệ số phân bố
VS, VM: thể tích pha tĩnh và pha động
tR, tM: thời gian lƣu của chất cần phân tích và chất không lƣu giữ
Cần chọn cột, pha động…sao cho k‘ nằm trong khoảng 1 ≤ k‘ ≤ 8 [1,6].

12


1.2.3.4. Hệ số đối xứng F
Để đánh giá tính đối xứng của pic ta dùng hệ số đối xứng
F=

W
2a

Trong đó:

W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic
a: khoảng cách từ đƣờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đƣờng cong phía
trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao pic
Trong phép định lƣợng, yêu cầu: 0,8 ≤ AF ≤ 2.
Hệ số đối xứng thấp do hiện tƣợng mở rộng dải (doãng pic), nguyên nhân có thể
do quá trình khuếch tán xoáy, khuếch tán dọc, hoặc quá trình chuyển khối không cân
bằng [1,6]
1.2.3.5. Số đĩa lý thuyết N
Là đại lƣợng đặc trƣng cho cột sắc ký.
N = 16�

2�

2

�2 2

= 5,54 � �
�1⁄2

Trong đó:
W: Chiều rộng đo ở đáy pic.
W1/2: chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic.
Theo thực tế, trong hầu hết các hỗn hợp mẫu, số đĩa lý thuyết nằm trong khoảng
3500 - 7500 là vừa đủ. Nếu quá nhỏ thì không có sự tách của các chất, nếu quá lớn thì
tR lớn, rửa giải tốn nhiều dung môi [1,6].
1.2.3.6. Độ phân giải RS
Để đánh giá khả năng tách của các chất trong một hệ pha, ngƣời ta dùng đại lƣợng
độ phân giải RS.
RS =

2( tRB − tRA )
WB + WA

=

1,18( tRB − tRA )
W1/2B + W1/2A

Trong đó:
tRA , tRB: thời gian lƣu hiệu lực của 2 pic liền kề nhau (A và B).
WA, WB: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2A, W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ƣu RS = 1,5 [1,6].

13


1.2.4. Một số phương pháp định lượng bằng HPLC
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phƣơng pháp định lƣợng hay đƣợc sử dụng trong sắc ký là: phƣơng pháp
chuẩn ngoại, phƣơng pháp chuẩn nội, phƣơng pháp thêm chuẩn và phƣơng pháp chuẩn
hóa diện tích.
Ở khóa luận này, để định lƣợng gliclazid đã áp dụng phƣơng pháp chuẩn ngoại.
 Phƣơng pháp chuẩn ngoại:
Là phƣơng pháp định lƣợng trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều đƣợc tiến hành
sắc ký trong cùng điều kiện.
So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao)
pic mẫu chuẩn đã biết nồng độ từ đó xác định đƣợc nồng độ của các chất trong mẫu thử.

Có thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm:
 Chuẩn hóa 1 điểm:
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ
mẫu thử theo công thức:
CX = CS.
CX, CS: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn.
chuẩn.

SX, SS: diện tích pic của chất phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu
 Chuẩn hóa nhiều điểm:
Cách tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi

tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu đƣợc là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm
chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic
với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính toán
nồng độ của chất cần xác định. Xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính mô tả quan
hệ giữa diện tích ( hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định:
Y = a + bCx
Trong đó:
Y: diện tích pic (hoặc chiều cao).
a: giao điểm của đƣờng chuẩn với trục tung.

14


b: độ dốc của đƣờng chuẩn
C: nồng độ của chất phân tích.
Dựa vào phƣơng trình hồi quy này ta tính đƣợc nồng độ của chất thử:
Cx =

𝑌− 𝑎

Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử phải nằm trong
khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn [1,6].

15


CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Điều kiện thực nghiệm
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
 Chuẩn nguyên liệu: bột gliclazid có hàm lƣợng 100,7%
 Chế phẩm thử: các chế phẩm viên nén gliclazid 30 mg giải phóng kéo dài
2.1.2. Hoá chất, dung môi
Các hoá chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 2.1 và 2.2
Bảng 2.1: Nguyên liệu chuẩn dùng trong nghiên cứu
Tên

Gliclazid

Nhà cung cấp

Nhà sản xuất

Hàm lƣợng

Công ty cổ phần

Công ty dƣợc phẩm

Traphaco

Zhejiang jiuzhou - China

100,7%

Bảng 2.2: Các hoá chất dùng trong nghiên cứu
Hoá chất

Độ tinh khiết

Nhà sản xuất

Acetonitril (MeCN)

HPLC

Merck – Đức

Methanol (MeOH)

HPLC

Merck – Đức

Triethylamin (TEA)

≥ 99,8%

Merck – Đức

Acid trifluoroacetic (TFA)

≥ 99,0%

Merck – Đức

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị
Các dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 2.3 và 2.4.
Bảng 2.3: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Thiết bị

Nhà sản xuất

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Shimadzu, Nhật Bản

Cân phân tích

Mettler Toledo, Thuỵ Sĩ

Tủ sấy

Memmert, Đức

Máy ly tâm

Hettich EBA 20, Đức

16


Bảng 2.4: Các dụng cụ dùng trong nghiên cứu
Dụng cụ

Nhà sản xuất

Bình định mức 20, 50 ml

ISOLAB, Đức

Pipet chính xác 2 ml

Đức

Phễu lọc

Buchner, Đức

Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc

Đức

0,45 μm
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng gliclazid bằng HPLC
 Phƣơng pháp xử lý mẫu
Cân chính xác 20 viên nén, tính khối lƣợng trung bình viên và nghiền thành bột

mịn. Cân chính xác một lƣợng bột viên tƣơng ứng với khoảng 100 mg gliclazid chuyển
vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH và lắc siêu âm 15 phút. Định mức
bằng MeOH và lắc đều. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 3 phút. Hút chính xác 2,0 ml dịch
trong vào bình định mức 20 ml và pha loãng bằng MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều.
 Lựa chọn điều kiện sắc ký
Nguyên tắc của việc lựa chọn điều kiện sắc ký là lựa chọn đƣợc loại cột sắc ký, thành
phần pha động, tỉ lệ pha động, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng và bƣớc sóng phát hiện
đảm bảo các chất tách nhau rõ rệt, pic gọn, thời gian phân tích không quá dài, đáp ứng
phân tích là tối ƣu đối với hoạt chất.
Trong khoá luận này, điều kiện sắc ký đƣợc lựa chọn để thực hiện phân tích tham
khảo dựa theo Dƣợc điển Việt Nam V:
- Cột C8 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động: TEA – TFA – MeCN – nƣớc (0,1 : 0,1: 40 : 60)
- Detector quang phổ tử ngoại đặt tại bƣớc sóng 235 nm
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 µl
2.2.2. Thẩm định phương pháp [5,8,15]

17