HOÀN THIỆN QUY TRÌNH kỹ THUẬT REALTIME PCR từ các BỆNH PHẨM SINH học để ĐỊNH DANH VI SINH vật hệ TIẾT NIỆU SINH dục

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
REALTIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ
ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA
KHÓA 2013 – 2019

HÀ NỘI – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
REALTIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ
ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC
Ngành đào tạo : Bác sĩ đa khoa
Mã ngành

: 52720101
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA
KHÓA 2013 – 2019
Người hướng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN THỊ TRANG


HÀ NỘI – 2019
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN.................................................................................3
1.1. Khái niệm bệnh lây truyền qua đường tình dục.....................................3
1.2. Dịch tễ học bệnh STD trên thế giới và tại Việt Nam..............................3
1.3. Các phương pháp phát hiện vi khuẩn hệ tiết niệu – sinh dục hiện nay......4
1.3.1. Quan sát trực tiếp............................................................................4
1.3.2. Nuôi cấy..........................................................................................6
1.3.3. Giải trình tự gen..............................................................................7
1.3.4. Phản ứng chuỗi polymerase..........................................................10
1.3.5. Realtime PCR................................................................................12
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................16
2.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................16
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân...........................................................16
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ.........................................................................16
2.2. Địa điểm nghiên cứu............................................................................16
2.3. Thời gian nghiên cứu............................................................................16
2.4. Phương pháp nghiên cứu......................................................................16
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu.......................................................................16
2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu............................................................17
2.4.3. Thu thập mẫu nghiên cứu..............................................................17
2.4.4. Quy trình nghiên cứu.....................................................................18

2.5. Quy trình kỹ thuật định tính DNA 12 khuẩn đường tiết niệu – sinh dục.....18
2.5.1. Hóa chất và dụng cụ......................................................................18
2.5.2. Quy trình định tính DNA 12 khuẩn gây bệnh đường tiết niệu – sinh dục. .19
2.6. Phân tích kết quả..................................................................................23
2.7. Xử lý số liệu.........................................................................................24
2.8. Đạo đức nghiên cứu.............................................................................24


Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ....................................................................25
3.1. Kết quả hoàn thiện quy trình tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm..........25
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm...........................25
3.1.2. Hình ảnh kết quả Realtime PCR sau khi tách DNA......................27
3.2. Đánh giá kết quả của kỹ thuật Realtime PCR từ các mẫu bệnh phẩm sinh
học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục........27
3.2.1. Kết quả Realtime PCR từ các mẫu bệnh phẩm.............................27
3.2.2. Tỷ lệ nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục ở nhóm nghiên cứu.........27
Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN.................................................................28
4.1. Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm........................28
4.2. Đánh giá kết quả của kỹ thuật Realtime PCR từ các mẫu bệnh phẩm sinh
học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục..........28
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Danh sách 12 khuẩn đường tiết niệu – sinh dục được định danh...19


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo nhận định nấm và Trichomonas
vaginalis..........................................................................................5
Hình 1.2. Trichomonas vaginalis ...................................................................6
Hình 1.3: Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP..................10
Hình 1.4. Các bước cơ bản trong phản ứng PCR..........................................11
Hình 1.5. Biều đồ khuếch đại của Realtime PCR ........................................13
Hình 1.6. Biểu đồ chuẩn của Realtime PCR ................................................14
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu...........................................18
Hình 2.2: Máy đo quang phổ Nanodrop 2000...............................................21
Hình 2.3. Hình minh họa đo OD của DNA bằng máy Nanodrop 2000........22
Hình 2.4. Kết quả Realtime PCR của mẫu dương tính.................................24
Hình 2.5. Kết quả Realtime PCR của mẫu âm tính.......................................24


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) hiện là nhóm bệnh truyền
nhiễm phổ biến nhất ở hầu hết các quốc gia, đặc biệt là ở nhóm tuổi 15-50,
ảnh hưởng trầm trọng đến sức khỏe con người, đặc biệt là sức khỏe sinh sản.
Mặc dù có những tiến bộ quan trọng về mặt chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa
(ví dụ như tiêm chủng), chúng vẫn là những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và
phổ biến nhất [1]. Tỷ lệ mắc STD trên toàn thế giới do vi khuẩn và virus được
ước tính là hơn 125 triệu trường hợp mỗi năm [2]. Theo thống kê của Tổ chức
Y tế thế giới (WHO), hàng năm có ít nhất 1/10 người ở độ tuổi hoạt động tình
dục mắc một bệnh trong nhóm STD. Tại các nước đang phát triển thuộc châu
Phi, châu Á, STD là một trong năm bệnh thường gặp nhất [3]. Nhiễm trùng
tiết niệu sinh dục cũng là một trong số những lý do phổ biến nhất khiến cho
một người phụ nữ quyết định đến thăm khám bác sĩ phụ khoa hoặc chuyên gia
tiết niệu [4]. Ở Việt Nam, theo ước tính thì mỗi năm có gần 1 triệu trường hợp

mới mắc bệnh STD, trong đó các bệnh STD phổ biến là chlamydia, lậu, giang
mai, trichomonas, HPV, HSV...[5], [6].
Thuật ngữ bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) đề cập đến một
loạt các hội chứng lâm sàng do mầm bệnh truyền từ người bị nhiễm sang
người không nhiễm qua quan hệ tình dục bằng đường âm đạo, hậu môn hoặc
qua đường miệng [7]. Nhóm bệnh này chủ yếu do vi khuẩn, virus, vi nấm, ký
sinh trùng gây ra, có triệu chứng lâm sàng đa dạng và phương pháp điều trị
cũng khác nhau [5]. Tuy nhiên, có đến 90% các bệnh lây truyền qua đường
tình dục không có triệu chứng dẫn đến chẩn đoán và điều trị chậm trễ [8]. Nếu
không được điều trị kịp thời và kỹ lưỡng, chúng có thể gây ra các biến chứng
đe dọa đến tính mạng như ung thư, vô sinh, thai ngoài tử cung, phá thai tự
phát, chết thai, trọng lượng sơ sinh thấp, tổn thương thần kinh và thậm chí tử
vong [9]. Không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe, tính mạng của người nhiễm
bệnh, STD còn gây nên những hậu quả nghiêm trọng về mặt kinh tế và xã hội


2
[10]. Tại Hoa Kỳ, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) ước
tính chi phí cho các hệ thống chăm sóc sức khỏe của Mỹ để điều trị tám bệnh
STD phổ biến nhất là khoảng 16 tỷ đô la Mỹ mỗi năm [11].
Từ thực tế trên đặt ra vấn đề trong chẩn đoán sớm và điều trị sớm bệnh
STD. Đã có rất nhiều phương pháp xét nghiệm để chẩn đoán các tác nhân vi
sinh vật và ký sinh trùng gây STD như nhuộm soi, nuôi cấy vi sinh, miễn dịch
nhưng hầu hết các phương pháp này độ nhạy và độ đặc hiệu đều khá thấp.
Trong những năm gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của ngành sinh học phân tử
đã cho ra đời nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán, phát hiện
nhanh chóng và chính xác các tác nhân gây nhiễm bệnh STD, có thể kể đến
kỹ thuật tách chiết và điện di DNA, kỹ thuật PCR, kỹ thuật xác định trình tự
nucleotid trong phân tử DNA, kỹ thuật lai acid nucleic... trong đó kỹ thuật
Realtime PCR là một kỹ thuật phổ biến và đang trở thành công cụ chẩn đoán

nhạy cảm nhất mà cho đến nay chưa có thử nghiệm nào sánh kịp [12], [13].
Realtime PCR tuân thủ thường quy chung của PCR nhưng cho một đường
cong khuếch đại tương tự đường cong phát triển vi khuẩn gồm ba giai đoạn
(kéo dài đến khi dấu hiệu của sản phẩm PCR lớn hơn dấu hiệu nền của hệ
thống, tăng gia tốc kéo dài và tạo hình phẳng), do đó, cả quá trình PCR được
hoàn thiện rõ hơn chứ không phải chỉ là một sản phẩm cuối cùng của phản
ứng sau một số chu kỳ nhất định [14]. Vì vậy, với mục đích sàng lọc, phát
hiện và điều trị sớm bệnh STD, tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Hoàn thiện
quy trình kỹ thuật Realtime PCR từ các bệnh phẩm sinh học để định danh
vi sinh vật hệ tiết niệu - sinh dục” với hai mục tiêu:
1. Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm (nước tiểu,
tinh dịch, dịch niệu đạo, dịch âm đạo, dịch màng tinh hoàn...).
2. Đánh giá kết quả của kỹ thuật Realtime PCR từ các mẫu bệnh
phẩm sinh học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh
dục.


3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD)
Bệnh lây lan qua đường tình dục (STD) chỉ một nhóm bệnh lây
truyền ở cả nam và nữ giới, bằng con đường tiếp xúc tình dục đồng gi ới
hay khác giới, bao gồm cả giao hợp qua âm đạo, qua miệng hay qua hậu
môn. Khả năng lây truyền của loại bệnh này rất cao và bất c ứ ai cũng có
thể mắc căn bệnh này nếu có đời sống tình dục không lành mạnh [5],
[15].
Có thể chia các bệnh STD ra thành các nhóm lớn theo căn nguyên gây
bệnh: do vi khuẩn (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae,

Treponema pallidum, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma), vi nấm (nấm
Candida), ký sinh trùng (Toxoplasma, Trichomonas vaginalis). Cho đến nay
đã phát hiện ra trên 40 tác nhân vi sinh vật gây bệnh STD, mỗi tác nhân gây
bệnh có một bệnh cảnh lâm sàng đặc trưng riêng [16].
1.2. Dịch tễ học bệnh STD trên thế giới và tại Việt Nam
STD là bệnh phổ biến trên thế giới, có tác động sâu sắc đến vấn đề
sức khỏe sinh dục và sinh sản. Theo WHO, hơn 1 triệu ca STD được ghi
nhận mỗi ngày. Mỗi năm, có khoảng 357 triệu ca nhi ễm m ới ch ỉ tính
riêng trong những bệnh STD phổ biến: chlamydia (131 triệu), bệnh lậu
(78 triệu), giang mai (5,6 triệu) và trichomonas (143 triệu) [3].
Tại Việt Nam, STD là một trong những bệnh rất hay g ặp ở độ tu ổi
hoạt động tình dục. Theo báo cáo của Viện Da liễu Quốc gia, h ằng năm ở
nước ta ghi nhận khoảng 200.000 trường hợp mới m ắc STD. Tuy nhiên
theo ước tính của các chuyên gia thì con số này vào lên đ ến 800 nghìn


4
đến 1 triệu người, trong đó có khoảng 500.000 trường hợp nhiễm
chlamydia đường sinh dục, 150.000 trường hợp nhiễm lậu...[5].
Mặc dù tỷ lệ nhiễm bệnh cao và gây nhiều biến chứng nguy hi ểm,
nhưng mức độ quan tâm của cộng đồng tới vấn đề này ch ưa th ật s ự
tương xứng. Một số nghiên cứu cho thấy kiến th ức của người dân về các
bệnh STD, về hậu quả của bệnh cũng như về phương pháp điều tr ị các
bệnh này là thấp. Tỷ lệ người biết về các bệnh này chỉ chiếm dưới 60%,
hiểu biết của các đối tượng về hậu quả và cách điều trị và phòng bệnh
STD còn ở mức dưới 50% [17]. Điều tra Quốc gia về Vị thành niên và
thanh niên Việt Nam (2004) cho kết quả: có 0,3% thanh thi ếu niên nói
đã từng mắc bệnh STD. Phần lớn thanh thiếu niên đã đi điều tr ị t ại các
cơ sở y tế công, một số nhỏ tới điều trị tại các phòng khám t ư, một s ố t ự
mua thuốc điều trị và một vài người nói là không điều trị gì [18].

1.3. Các phương pháp phát hiện vi khuẩn hệ tiết niệu – sinh dục
hiện nay
1.3.1. Quan sát trực tiếp (soi tươi, nhuộm soi)
- Soi tươi
Xét nghiệm soi trực tiếp (direct examination) tìm vi sinh vật gây
bệnh là phương pháp đơn giản nhất được triển khai rộng rãi từ tuyến huyện
trở lên. Đây là phương pháp đòi hỏi trang thiết bị đơn giản, rẻ tiền, thao tác
nhanh, thường được dùng để quan sát trạng thái sống của vi khuẩn. Soi tươi
bệnh phẩm dịch âm đạo, niệu đạo có thể phát hiện nấm men, trùng roi
Trichomonas vaginalis, Gradnerella vaginallis và nhận định mật độ tế bào âm
đạo và bạch cầu [19].


5

Hình 1.1. Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo
nhận định nấm và Trichomonas vaginalis [19]
- Nhuộm soi
Năm 1884, Hans Christian Joachim Gram, một nhà khoa học người
Đan Mạch đã sáng chế ra phương pháp nhuộm vi khuẩn mới mà ngày nay tên
gọi đã trở nên rất quen thuộc với mọi phòng thí nghiệm vi khuẩn trên thế giới.
Phương pháp nhuộm gram là một trong những kỹ thuật cơ bản và quan
trọng nhất trong phân tích vi khuẩn ở giai đoạn đầu nhằm xác định sơ bộ đặc
tính của các dòng vi khuẩn muốn nghiên cứu theo tính chất bắt màu gram của
chúng. Vi khuẩn bắt mầu hỗn hợp crystal violet - iodin sẽ có màu tím nâu khi
quan sát dưới kính hiển vi quang học và được xếp vào nhóm vi khuẩn gram
dương. Những dòng vi khuẩn khác không giữ được mầu crystal violet và bắt
màu fuchsin (đỏ) được xếp vào nhóm vi khuẩn gram âm.
Phương pháp nhuộm gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của
thành tế bào tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn. Việc xác định

thời gian tẩy mầu là yếu tố quan trọng trong việc phân biệt vi khuẩn gram
dương và vi khuẩn gram âm. Nếu kéo dài thời gian tẩy mầu, ngay cả vi khuẩn
gram dương cũng không giữ được mầu nhuộm ban đầu. Ngoài ra, một số loài
vi khuẩn gram dương cũng có thể bị tẩy mầu dễ dàng và vì thế chúng được
coi là các dòng vi khuẩn có tính chất bắt mầu gram thay đổi (có thể âm lẫn


6
dương). Chất nhuộm fuchsin (hoặc có thể thay bằng safranin) tạo cho vi
khuẩn gram âm có màu hồng đỏ. Fuchsin nhuộm màu mạnh hơn và có màu dễ
nhìn hơn safranin. (Haemophilus spp., và một vài dòng vi khuẩn kỵ khí không
ăn màu safranin) [20].

Hình 1.2. Trichomonas vaginalis [19]
1.3.2. Nuôi cấy
Nuôi cấy tìm vi sinh vật gây bệnh là xét nghiệm dùng môi trường nhân
tạo để nghiên cứu sự phát triển của vi sinh vật dưới các điều kiện khác nhau.
Các vi sinh vật đích trong các xét nghiệm này là: vi khuẩn ( kỵ khí, hiếu khí,
hiếu kỵ khí tùy tiện), virus, nấm..., ngoài ra một số ký sinh trùng khác cũng có
thể nuôi cấy. Như vậy, chúng ta thấy rằng chỉ những vi sinh vật mọc được
trên môi trường nhân tạo mới áp dụng phương pháp xét nghiệm này. Đây là
loại xét nghiệm cơ bản nhất của labo vi sinh lâm sàng từ tuyến tỉnh trở lên.
Các công đoạn của xét nghiệm nuôi cấy tìm vi khuẩn bao gồm:
- Lấy bệnh phẩm
- Cấy phân vùng
- Thuần khiết
- Định danh
- Xác định tuýp huyết thanh

7
- Xác định độc lực, gây bệnh thực nghiệm
- Xác định độ nhạy cảm của chủng phân lập được với kháng sinh (kháng
sinh đồ)
1.3.3. Giải trình tự gen
Trình tự nucleotid của một đoạn DNA có thể được xác định bằng cách
sử dụng một quy trình hóa học theo nguyên lý của Alan Maxam và Walter
Gilbert hay một quy trình enzym được phát triển bởi Fred Sanger. Quy trình
của Sanger thường được gọi là phương pháp dideoxynucleotid, và hiện nay
quy trình này là cơ sở để phát triển những phương pháp giải trình tự hiện đại.
Phương pháp enzyme được phát triển bởi Sanger và các cộng sự năm 1977 đã
nhanh chóng trở thành phương pháp được lựa chọn rộng rãi vì dễ tiến hành và
có độ tin cậy cao.
- Phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert [21]: Năm 1976-1977,
Allan Maxam và Walter Gilbert đã phát triển một phương pháp giải trình tự
DNA dựa trên sự cải biến hóa học DNA và sự phân cắt giới hạn tại những
nucleotid đặc hiệu. Phương pháp này đòi hỏi phải gắn phóng xạ tại đầu 5’ kết
thúc của sợi DNA (thường bằng một phản ứng kinase sử dụng gamma-32P
ATP) và đoạn DNA giải trình tự phải được tinh sạch. DNA được xử lý với hóa
chất tạo ra các điểm gãy ở một vị trí nhỏ của một hoặc hai trong số bốn
nucleotid của một trong bốn phản ứng (Dimethyl sunphat phá hủy G,
Glicosidic phá hủy A + G, Hydrazin phá hủy C, Hydrazin+ NaCl phá hủy C +
T). Phân tử DNA cải biến này sau đó được làm đứt bởi piperidine nóng ở vị
trí các nucleotid cải biến. Nồng độ của các chất hóa học được điều khiển để
trung bình chỉ có một cải biến trên mỗi phân tử DNA. Như vậy, một loạt các
đoạn đứt có đánh dấu được tạo ra. Các đoạn đứt trong bốn phản ứng được
điện di trong làn cạnh nhau trên gel polyacrylamide. Để quan sát kích thước


8

các đoạn đứt, gel được đưa lên phim chụp phóng xạ tự ghi X-ray để phát hiện
vạch, từ các vạch đó đó ta suy ra trình tự đoạn DNA ban đầu.
Phương pháp giải trình tự của Maxam-Gilbert ít được sử dụng vì những
nhược điểm bộc lộ ngày càng rõ như những phức tạp về mặt kỹ thuật không
thể sử dụng trong các kit sinh học phân tử tiêu chuẩn, cũng như việc phương
pháp này sử dụng nhiều hóa chất độc hại và gặp những khó khăn trong việc
mở rộng quy mô và cải tiến phương pháp.
- Phương pháp enzym (phương pháp Sanger) [22]: Vì phương pháp
Sanger có hiệu quả cao hơn đồng thời sử dụng ít hóa chất độc hại cũng như ít
các chất phóng xạ hơn phương pháp của Maxam và Gilbert, nó nhanh chóng
trở thành phương pháp được chọn lựa phổ biến hơn.
Nguyên lí:
+ Dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase và dideoxynucleotid
(ddNTP) trong quá trình tổng hợp DNA.
+ Khi DNA polymerase gặp các ddNTP thì dừng lại: enzyme DNA
polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí
3’OH (vị trí này cần cho việc hình thành liên kết phosphodieste ở chuỗi
polynucletid đang hình thành với các nucleotide kế tiếp), khi gặp nucleotid
không có nhóm 3’OH ở ddNTP, phản ứng tổng hợp bị dừng lại và tạo ra các
đoạn DNA chênh lệch nhau một nucleotid.
Ví dụ: Nếu ta thêm ddCTP vào hỗn hợp phản ứng đang tổng hợp DNA
thì quá trình tổng hợp chuỗi polynucleotide sẽ dừng lại ở vị trí C.
+ Điện di các đoạn DNA này với việc bổ sung 1% các loại ddNTP riêng
biệt (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) sẽ được bốn bản điện di khác nhau. Các
băng DNA xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi, hoặc các ddNTP.
Dưa vào đó để đọc trình tự DNA.


9
Các vạch DNA được hiện hình bằng cách chụp phóng xạ tự ghi hoặc soi

trên tia cực tím, và trình tự DNA có thể được đọc trực tiếp trên film X-ray
hoặc hình ảnh của gel.
Những thay đổi trong kỹ thuật giải trình tự bằng chất kết thúc chuỗi chủ
yếu nằm ở việc gắn các nucleotid với đuôi phospho có chứa phóng xạ, hoặc
sử dụng mồi có gắn chất nhuộm huỳnh quang ở đuôi 5’. Việc gắn chất nhuộm
vào mồi tạo điều kiện phát triển một hệ thống quang học để có thể phân tích
nhanh hơn, kinh tế hơn và dễ dàng tự động hóa. Sau này, Leroy Hood và các
đồng nghiệp của ông đã sử dụng hai phương pháp gắn chất nhuộm huỳnh
quang lên các ddNTPs và mồi để mở ra kỷ nguyên tự động hóa và giải trình
tự công suất lớn.
- Phương pháp giải trình tự tự động [23]: Cấu tạo của máy giải trình tự
tự động gồm hai phần chính yếu: phần điện di với gel pop7 và capilary36 và
phần phát hiện peak điện di. Các mạch đơn DNA trong ống phản ứng giải
trình tự được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn
này phát sáng khi đi qua chùm tia laser.
Nguyên tắc hoạt động: trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một
vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và con mắt
cảm quang sẽ ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu
đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh
tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự DNA.
Ngày nay, người ta dùng bốn màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu
bốn loại ddNTP, nhờ vậy, phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ
trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di một hàng mà không
cần phải trên bốn hàng khác nhau như trước đây.


10

Hình 1.3: Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP
1.3.4. Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction: PCR)

Phương pháp này do Mullis và cộng sự đề xuất năm 1985. Mục đích
của phương pháp là phát hiện và nhân đoạn DNA nhiều lần trong ống nghiệm.
Để thực hiện phương pháp cần có: phân tử DNA ban đầu; hai đoạn
DNA mồi (primers), mỗi đoạn gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở hai
đầu của phân tử DNA ban đầu: mồi ngược và mồi xuôi; bốn loại Nu (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP); Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt
độ cao, được tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus [24].


11
Mỗi chu kỳ PCR gồm ba giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:
(1) Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng sợi kép thành
dạng sợi đơn ở nhiệt độ 94 – 95 0C trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1
– 1,5 phút).
(2) Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống 40 –
650C cho phép hai đoạn mồi gắn vào DNA mẫu ở vị trí tương đồng theo
nguyên tắc bổ sung (A – T, G – C) ở hai đầu DNA cần nhân.
(3) Giai đoạn kéo dài: ở nhiệt độ 720C, DNA Taq polymerase hoạt
động kéo dài đoạn DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới được tổng hợp
theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu.
Sau môt chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một đoạn DNA khuôn được
nhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại được
coi là DNA khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy, sau k chu kỳ
nhân bản sẽ tạo ra 2k đoạn DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu [25].


12
Hình 1.4. Các bước cơ bản trong phản ứng PCR (Andy Vierstraete,
1999)
1.3.5. Realtime PCR

1.3.5.1. Khái niệm
Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự
phân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel
sau khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, phương pháp Realtime PCR cho phép
phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang
diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số
lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Realtime PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép
chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ
nhạy cao trên một phạm vi động học lớn. Các kết quả của Realtime PCR có
thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng
(số bản copy của DNA). Số liệu của Realtime PCR có thể đánh giá mà không
cần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa
vào quá trình được tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu
được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được
giảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ [13].
1.3.5.2. Các vấn đề kỹ thuật cơ bản của Realtime PCR
* Biểu đồ khuếch đại của Realtime PCR
Biểu đồ này có trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống
phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt.
Cường độ huỳnh quang trải qua ba giai đoạn:


13
- Giai đoạn ủ (giai đoạn tiềm phục): cường độ huỳnh quang mà máy ghi
nhận được trong những chu kỳ đầu sẽ rất thấp và hầu như không thay đổi, hiển
thị bằng một đường thẳng nằm ngang, vì trong giai đoạn này dù DNA đích đã
có thể được nhân bản thành các bản sao nhưng do số lượng chưa đủ để giúp
cho chất phát huỳnh quang nhận được ánh sáng kích thích phát ra ánh sáng
huỳnh quang đủ cường độ để máy ghi nhận.

- Giai đoạn lũy thừa: một khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến
một ngưỡng nhất định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ để
được máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy đường biểu diễn khuếch đại
bắt đầu ngóc lên. Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi
sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA đích tăng
gấp đôi sau mỗi chu kỳ.
- Giai đoạn bình nguyên: cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ
tăng trưởng đến một mức nào đó thì độ tăng trưởng sẽ chậm dần và đạt đến
bình nguyên vì các bản sao của DNA đích, do phản ứng đã cạn dần dNTP và
enzyme Taq polymerase không hoạt động hiệu quả nữa, nên sẽ không còn gia
tăng số lượng theo cấp số hai nữa [13].


14

Hình 1.5. Biều đồ khuếch đại của Realtime PCR [6]
Chu kỳ ngưỡng hay Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại th ời đi ểm này thi ết
bị realtime ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống ph ản ứng
bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền. Có nh ững ống ph ản ứng
có Ct sớm và cũng có những ống phản ứng có Ct xuất hiện muộn h ơn .
Nếu trong ống phản ứng số lượng DNA đích nhiều thì sẽ c ần ít chu kỳ
nhiệt hơn để đạt đến số lượng bản sao đủ để ống phản ứng cho đ ược
tín hiệu huỳnh quang mà máy sẽ ghi nhận được, còn nếu số lượng DNA
đích ít hơn thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn [13].
* Biểu đồ chuẩn của Realtime PCR


15

Hình 1.6. Biểu đồ chuẩn của Realtime PCR [13]

Đường biểu diễn chuẩn (standard curve) là đường biểu diễn vẽ
lên mối quan hệ giữa số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các m ẫu
chuẩn và chu kỳ ngưỡng tương ứng. Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung
(Y) là Ct còn trục hoành (X) là số l ượng bản DNA đích ban đ ầu có trong
các mẫu chuẩn.
1.3.5.3. Một số thành tựu của Realtime PCR
Năm 2005, Caliendo AM cùng cộng sự (Khoa bệnh học và Phòng thí
nghiệm Y khoa, Trường Đại học Y khoa Emory, Atlanta, GA 30322, Hoa Kỳ)
đã tiến hành nghiên cứu "Cải thiện việc phát hiện Trichomonas vaginalis
(T.vaginalis) bằng Realtime PCR so với nuôi cấy". 524 mẫu bệnh phẩm, thu
thập từ các phụ nữ Mỹ gốc Phi và trẻ vị thành niên tham gia vào các chương
trình dự phòng HIV-1, được tiến hành phân tích để phát hiện T.vaginalis bằng
cách nuôi cấy trực tiếp và Realtime PCR. Kết quả, 36/524 mẫu dương tính khi
nuôi cấy và 54/524 mẫu dương tính trong thử nghiệm Realtime PCR [26].
Năm 2013, ZhangMJ cùng cộng sự (Phòng Kiểm soát và Phòng ngừa
Bệnh truyền nhiễm Quốc gia, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh
Trung Quốc) tiến hành nghiên cứu "Phát triển và ứng dụng Realtime PCR để
trực tiếp phát hiện và định lượng Campylobacter jejuni (C.jejuni) trong phân
người". 242 mẫu phân được phân tích để phát hiện sự có mặt của C.jejuni
bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trực tiếp và Realtime PCR. Kết quả, 20/242
(8.3%) chủng C.jejuni đã được phân lập từ nuôi cấy vi khuẩn, trong khi


16
41/242 (16.9%) mẫu dương tính với Realtime PCR. Kết luận, độ nhạy của
việc phát hiện vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm cao hơn rất nhiều khi sử dụng
Realtime PCR so với phương pháp nuôi cấy trực tiếp [27].
Tóm lại, Realtime PCR là kỹ thuật khuếch đại gen, có nhiều ưu điểm so
với PCR truyền thống cũng như các phương pháp định danh vi khuẩn khác,
được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong di truyền học, công nghệ sinh học

cũng như nhiều lĩnh vực của cuộc sống.

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu gồm những bệnh nhân đến khám và làm xét
nghiệm tại Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Đại học Y Hà Nội.
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
- Tất cả các bệnh nhân được chỉ định làm xét nghiệm Realtime PCR định
danh hệ khuẩn đường tiết niệu - sinh dục.
- Bệnh nhân chưa tham gia điều trị các bệnh nhiễm khuẩn hệ sinh dục tiết niệu.
- Bệnh nhân tình nguyện tham gia vào nghiên cứu.


17
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Bệnh nhân đã được điều trị các bệnh lây truyền qua đường tình dục.
- Bệnh nhân có mẫu lấy không đảm bảo đúng quy trình.
- Bệnh nhân không tình nguyện tham gia vào nghiên cứu.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường đại học Y Hà Nội.
2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 1 năm 2018 đến tháng 12 năm 2018.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.

2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
Chúng tôi chọn ngẫu nhiên 50 mẫu bệnh phẩm để hoàn thiện quy trình:

 10 mẫu nước tiểu
 10 mẫu tinh dịch
 10 mẫu dịch màng tinh hoàn
 10 mẫu dịch niệu đạo
 10 mẫu dịch âm đạo
2.4.3. Thu thập mẫu nghiên cứu
- Thu thập thông tin từ phiếu phỏng vấn đã soạn sẵn:
Các đối tượng tham gia trả lời phiếu phỏng vấn nhằm cung cấp các
thông tin bao gồm tuổi, tiền sử về các bệnh lây truyền qua đường tình dục.


18
- Khám và lấy bệnh phẩm:
Bệnh nhân được khám để phát hiện tình trạng bệnh lý đường sinh dục
trên lâm sàng: tình trạng viêm, tổn thương và phát hiện các khối u. Bệnh
phẩm thu được được chuyển về Bộ môn Y sinh học – Di truyền, Đại học Y Hà
Nội, bảo quản ở 4oC để phục vụ cho các xét nghiệm tiếp theo.
Mẫu nghiên cứu sau thu thập được tiến hành phân tích tại Bộ môn Y sinh
học - Di truyền Trường Đại học Y Hà Nội.


19
2.4.4. Quy trình nghiên cứu
Thu thập thông tin bệnh nhân (họ tên, tuổi)

Thu thập, bảo quản (2-8°C) và phân loại mẫu

Tách chiết DNA

Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ DNA

Realtime PCR định danh vi sinh vật
hệ tiết niệu – sinh dục

Phân tích và đánh giá kết quả

Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu

2.5. Quy trình kỹ thuật định tính DNA 12 khuẩn đường tiết niệu –
sinh dục
2.5.1. Hóa chất và dụng cụ
 Hóa chất:
- Hóa chất tách chiết DNA: bộ Kit tách DNA- express đạt chuẩn IVD và
CE Châu Âu của công ty Lytech (Nga).