Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan b mạn tính

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

TRIỆU THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Triệu Thị Nguyệt

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược Học Quân sự - HVQY
TS. Mai Thị Đàm Linh – Đại học Khoa học Tự nhiên

Hà Nội – Năm 2019


LỜI CẢM ƠN
Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS. Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y
Dược học quân sự - Học viện Quân Y, người thầy đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và
hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Mai Thị Đàm Linh- Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người thầy đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và anh chị trong Phòng Công nghệ gen và Di
truyền tế bào - Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y vì các
thầy cô và anh chị đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài tại phòng.
Tôi đặc biệt cảm ơn CN. Vũ Nguyễn Quỳnh Anh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học cùng
các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình học tập
và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và
tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.

Hà Nội, 10 tháng 01 năm 2020
Học viên
Triệu Thị Nguyệt


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................7

DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................8
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................10
Chương 1 - TỔNG QUAN ..........................................................................................3
1.1. Tổng quan về HBV ........................................................................................3
1.1.1.

Đặc điểm phân loại HBV.....................................................................3

1.1.2.

Đặc điểm hình thái HBV .....................................................................4

1.1.3.

Cấu trúc hệ gen HBV...........................................................................5

1.1.4.

Các protein HBV .................................................................................7

1.1.5.

Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe ......................................10

1.1.6.

Chu trình nhân lên của HBV .............................................................12

1.1.7.

Con đường lây nhiễm của virus HBV ................................................14

1.2. Tổng quan về viêm gan B mạn tính.............................................................15
1.2.1.

HBV và viêm gan B ...........................................................................15

1.2.2.

Tình hình nhiễm HBV trên thế giới ...................................................16

1.3. Tình hình nghiên cứu HBV .........................................................................18
1.3.1. Trên thế giới ............................................................................................18
1.3.2.

Trong nước ........................................................................................21

1.4. Tính mới và tính sáng tạo của đề tài ............................................................23
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................26
2.1. Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu .......................................................26


2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................26
2.1.2. Vật liệu, hóa chất ....................................................................................27
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................28
2.2.1 . Thiết kế nghiên cứu ................................................................................28
2.2.2. Thu thập, bảo quản mẫu .........................................................................29
2.2.3. Tách chiết acid nucleic ...........................................................................29
2.2.4. Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương .....29
2.2.5. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA ..............................32

Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược: .............................................................34
Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược ......................................................35
Tối ưu nhiệt độ gắn mồi ....................................................................................36
Tối ưu thời gian luân nhiệt ................................................................................36
Tối ưu nồng độ mồi ...........................................................................................37
Tối ưu nồng độ probe ........................................................................................37
Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR .....................................................38
2.2.6. Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA..........................38
2.2.7. Phân tích, xử lý số liệu ............................................................................39
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................41
3.1. Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương
bệnh nhân CHB. ....................................................................................................41
3.1.1. Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA được tổng hợp in-vitro,
chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh. ...........................41


3.1.2. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng
hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn
trước khi hoàn thiện. .........................................................................................41
3.1.3. Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV
pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.......................................................42
3.1.4. Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RTqPCR đo tải lượng HBV pgRNA. ......................................................................44
3.2. Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết
tương bệnh nhân CHB. ..........................................................................................47
3.2.1. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các
bước và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR. .......47
3.2.2. Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme
DNA polymerase, nồng độ mồi và probe. Thành phần phản ứng bao gồm cả
dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm. ...................54
3.2.3. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA .........................................56

3.3. Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR. .....................................................57
3.3.1. Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét
nghiệm. Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy
trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. .57
3.3.2. Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải
lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. ..................................61
3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB. ...............................64
KẾT LUẬN ...............................................................................................................67
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………85


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT
1

Nghĩa

Từ viết tắt
cccDNA

Covalently closed circular DNA – DNA kép, mạch
vòng

2

CHB

Chronic Hepatitis B – Viêm gan B mạn tính

3

Ct

Crossing threshold

4

CV

Coefficient of Variation - Hệ số biến thiên

5

ER

Endoplasmic Reticulum – Mạng lưới nội chất

6

HBeAg

Hepatitis B envelope Antigen – Kháng nguyên e
của HBV

7

HBcAg

Hepatitis B core antigen – Kháng nguyên lõi của

HBV

8

HCC

Hepatocellular Carcinoma – Ung thư biểu mô tế
bào gan

9

HBV

Hepatis B Virus – Virus viêm gan B

10

HBsAg

Hepatitis B surface Antigen – Kháng nguyên vỏ
của HBV

11

ME

Meaning – Độ lệch phép đo

12

ORF

Open Reading Frame – Khung đọc mở

13

NAs

Nucleos(t)ide Analogues

14

RT-qPCR

Reverse Transcription Realtime - quantitative
Polymerase Chain Reaction

15

rcDNA

Relaxed circular DNA – DNA dạng vòng không
kín

16

SD

Standard Deviation – Độ lệch chuẩn

17

pgRNA

Pre-genomic RNA

18

UNG

Uracil Deoxyribonucleic Acid Glycosylase


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [99]..............................................................5
Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV .....................................................................................7
Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [47]. ......................................................14
Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [47]. .....................................................14
Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S .................................................30
Hình 6: Kết quả phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe. .......................................43
Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR ....................................44
Hình 8: Panel độ nhạy ...............................................................................................45
Hình 9: Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy...............................................................46
Hình 10: Kết quả dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy. ...........................................46
Hình 11: Kết quả bộ panel độ đặc hiệu .....................................................................47
Hình 12: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ
45°C...........................................................................................................................48
Hình 13: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ
50°C...........................................................................................................................49

Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút. ...........................................................50
Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút. ...........................................................51
Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C. .............................................................................52
Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C. .............................................................................52
Hình 18: Kết quả ở thời gian gắn mồi 15 giây. .........................................................53
Hình 19: Kết quả ở thời gian gắn mồi 30 giây. .........................................................53
Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mồi. ......................................................................54
Hình 21: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,2 µM ................................................55
Hình 22: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,1 µM ................................................55
Hình 23: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn...........................59
Hình 24: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tuần. ............................................61
Hình 25: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau một tháng. ........................................62
Hình 26: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tháng. ..........................................62
Hình 27: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau ba tháng. ...........................................63


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị................................................................................27
Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu ....................................................................................27
Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCR .................................................................31
Bảng 4: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR .....................................................32
Bảng 5: Thành phần phản ứng RT-qPCR .................................................................34
Bảng 6: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR với hai nhiệt độ khác nhau ở bước
phiên mã ngược .........................................................................................................35
Bảng 7: Thành phần tối ưu của một phản ứng RT-qPCR .........................................56
Bảng 8: Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng RT-qPCR ...................................56
Bảng 9: Kết quả đánh giá quy trình định lượng trên dải nồng độ 104 – 1,25
copy/phản ứng trong 10 lần chạy ..............................................................................57
Bảng 10: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn ..........................59

Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua các chỉ số SD, CV, độ lệch phép đo (ME)..60
Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR.................................63
Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR.................................63


Bảng 13: Nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn tính
ở nhóm HBeAg dương tính và âm tính. ....................................................................64


MỞ ĐẦU
Nhiễm Hepatitis B virus (HBV) là một vấn đề y tế toàn cầu. Mặc dù đã có sự
phát triển các vaccine ngăn chặn bệnh hiệu quả cao từ những năm 1980 và việc bổ
sung chương trình tiêm chủng vaccine mở rộng tại hơn 168 quốc gia, bệnh gan do
nhiễm mạn tính HBV vẫn là gánh nặng khổng lồ đối với toàn xã hội. Tính đến thời
điểm hiện nay, trên thế giới, nhiễm HBV là nguyên nhân của 30% bệnh nhân xơ
gan và 53% trong số họ tiến triển thành HCC, với khoảng hơn 200,000 và 300,000
người mang HBsAg chết mỗi năm tương ứng do xơ gan và ung thư gan.
Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay được cấp phép là Peg-IFN α2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside
(nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir,
Tenofovir. Peg-IFN vừa có tác dụng điều hòa miễn dịch vừa có tác dụng kháng
virus trực tiếp, nhờ đó có thể duy trì sự ức chế HBV DNA sau khi ngừng điều trị ở
một nhóm bệnh nhân. Ngược lại, việc sử dụng NAs làm giảm mạnh HBV DNA và
các biến chứng ở hầu hết các bệnh nhân. Tuy nhiên NAs sẽ không ảnh hưởng tới sự
tổng hợp RNA tiền bộ gen (pgRNA) của HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính
hay tổng hợp protein virus như HBsAg vì cccDNA không bị ảnh hưởng và vẫn giữ
nguyên hoạt tính phiên mã. Hệ quả là, ngừng điều trị NAs thường dẫn tới bệnh tái
phát và hầu hết các bệnh nhân cần điều trị cả đời. Không may là việc điều trị bằng
thuốc NAs (như lamivudine) trong một khoảng thời gian dài có thể dẫn đến các đột
biến kháng thuốc và một số nguy cơ nghiêm trọng khác liên quan tới gan. Chính vì
vậy, việc đánh giá được nồng độ của cccDNA ở các bệnh nhân điều trị NAs là vô

cùng quan trọng giúp xác định thời điểm và hiệu quả của các loại thuốc kháng virus.
Tuy nhiên, việc đánh giá cccDNA lại yêu cầu phải sử dụng các mẫu mô sinh thiết,
gây khó khăn trong quá trình đánh giá lâm sàng.
Chức năng cơ bản của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất
cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp
tạo ra các DNA của virion. Do đó, nồng độ của cccDNA lại được phản ánh bởi

1


RNA. Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm
viêm gan B, HBV pgRNA gần đây đã được báo cáo là một dấu ấn sinh học mới đầy
hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân CHB.
Việt Nam nằm trong khu vực có tỉ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng vào
loại cao nhất trên thế giới, nhiễm HBV mạn tính là một vấn đề y tế nặng nề tại nước
ta. Sự cấp thiết trong việc tìm ra hay thiết lập các công cụ theo dõi, kiểm soát điều
trị cũng như quản lý sự lây nhiễm trong cộng đồng là rất rõ ràng trong bối cảnh phổ
biến của nhiễm HBV mạn tính. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu nào trong nước
đề cập đến dấu ấn tiềm năng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân CHB. Chính vì
vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu: Xây dựng và tối ưu quy trình RTqPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao trên đối tượng là các
bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng các đồng đẳng nucleoside ở Việt
Nam.

2


Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về HBV
1.1.1. Đặc điểm phân loại HBV
Hepatitis B virus (HBV) là một thành viên của họ Hepadnaviridae [130].

Sở dĩ họ virus này có tên như vậy là bởi vì những virus này là nguyên nhân gây ra
các bệnh về viêm gan (hepatitis) và genome là DNA. Một số virus thuộc họ này có
khả năng lây nhiễm ở các động vật có vú và chim; ví dụ bao gồm woodchuck HBV
và heron HBV. HBV được biết đến nhiều nhất là virus có khả năng lây nhiễm ở
người, và là một trong những nguyên nhân gây bệnh gan ở người [46].
Các virus thuộc họ Hepadnaviridae đều có những đặc điểm chung như sau [121]:
-

Hệ gen là DNA sợi đôi không hoàn chỉnh bao gồm 2 sợi: sợi âm đầy

đủ và sợi dương không đầy đủ.
-

Enzyme DNA polymerase

-

Nhân lên thông qua mạch khuôn là pre-genomic RNA (pgRNA)

-

Có mức độ đặc trưng về mô và loài cao

Việc nghiên cứu về các HBV từ lâu đã được quan tâm vì hai lý do. Thứ nhất,
các virus này có bộ gen rất nhỏ, tuy nhiên chúng vẫn có khả năng mã hóa các
protein của virus và kiểm soát sự biểu hiện gen của virus. Thứ hai, bộ gen DNA của
các virus được nhân lên thông qua trung gian RNA. Nói cách khác, sự nhân lên của
virus bao gồm quá trình phiên mã ngược, vì vậy các virus thuộc nhóm này khác
biệt rất lớn với các virus có bộ gen là DNA có khả năng nhân lên một cách trực tiếp.
DNA của virus được nhân lên thông qua trung gian RNA còn được tìm thấy ở các

loài thực vật. Những virus này, cùng với HBV còn được gọi là Pararetrovirus [46].
Các nghiên cứu về giải trình tự nucleotide của HBV được phân lập ở người
trên khắp thế giới đã được thiết lập, 8 tuýp của virus HBV đã được xác định (A-H)
dựa trên sự khác biệt về trình tự lớn hơn 8% và không vượt quá 17% [61, 102]. Các
tuýp này có sự phân bố khác nhau, như tuýp A và D thường xuất hiện ở Châu Phi,
Châu Âu và Ấn Độ; tuýp B và C thường phân bố ở Châu Á; tuýp E được tìm thấy ở

3


Tây Phi, và tuýp F xuất hiện ở cả Trung và Nam Mỹ. Sự phân bố của tuýp G và
tuýp H vẫn chưa rõ ràng, nhưng đã có những báo cáo cho rằng hai tuýp này đã xuất
hiện ở Trung Mĩ và Nam Âu [54]. Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng
có sự xuất hiện của các tuýp virus mới, như tuýp I là tuýp có độ tương đồng lớn với
tuýp C là tuýp được phát hiện ở một số nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào và
Đông Ấn [106]; và tuýp J được phát hiện ở một người Nhật Bản sống ở Borneo, là
dạng tái tổ hợp giữa tuýp C và HBV ở vượn [102]. Các tuýp A, B, C, D, F, I có thể
được phân ra thành các nhóm nhỏ hơn dựa trên sự khác biệt khoảng 4% nucleotide.
Có 44 nhóm các tuýp phụ: A1–6, B1–9, C1–16, D1–7, F1–4 và I1–2 [54, 84]. Thêm
vào đó, còn có một số dạng tái tổ hợp của các tuýp như đã kể trên, nhưng phần lớn
là các dạng tái tổ hợp B/C và C/D, trong khi các tái tổ hợp giữa các tuýp khác xảy ra
ít hơn các trường hợp kể trên [8].
1.1.2. Đặc điểm hình thái HBV
Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác
nhau (Hình 1): tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm, tiểu thể
hình ống (tubµLar particle) kích thước 22nm có chiều dài 40 - 400nm và tiểu thể
hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm. Tiểu thể hình cầu nhỏ và
hình ống là thành phần vỏ của HBV mà trong quá trình nhân lên tổng hợp dư thừa.
Đây chính là kháng nguyên bề mặt (HBsAg). Các tiểu thể này có thể đứng riêng rẽ
hay đứng hợp với nhau thành từng đám, chúng không có khả năng lây truyền bệnh

[48]. Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm. Đây chính là
hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp:
-

Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein. Lớp này có các kháng
nguyên bề mặt (HBsAg) [28].

-

Lớp lõi: Capsid đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõi HBcAg.
Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòng không kín,
enzyme phiên mã ngược polymerase và protein kinase [28, 34].

4


Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [100].
(A) Tiểu thể hình cầu lớn (tiểu thể Dane); (B) Tiểu thể hình cầu nhỏ; (C)
Tiểu thể hình ống.
1.1.3. Cấu trúc hệ gen HBV
Cấu trúc nucleocapsid HBV chứa bộ gen với chiều dài khoảng 3,2 kilobase
(kb) và là phân tử DNA sợi đôi không hoàn chỉnh dạng vòng không kín hoàn toàn
(relaxed circular DNA - rcDNA) [11, 17]. Nucleocapsid là một cấu trúc nhị thập
diện đều được hình thành bởi 240 phân tử protein capsid của virus với đường kính
khoảng 27 nm, và mỗi một nucleocapsid chứa một bản sao DNA của virus và
enzyme polymerase liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm [17, 58]. Một vài
protein của tế bào bao gồm protein kinase cũng được đóng gói vào trong cấu trúc
nucleocapsid [17]. Một trong những đặc điểm độc đáo của hệ gen HBV đó chính là
cấu trúc bất đối xứng giữa hai sợi. Sợi âm được tổng hợp đầy đủ và có chiều dài
bằng kích thước hệ gen, còn sợi dương bổ sung với sợi âm lại có sự khác biệt về

5


chiều dài, chiều dài của sợi dương cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu chính
xác, thay đổi theo từng tuýp, từng dòng [30]. Ngoài ra, cả sợi âm và sợi dương đều
có chung một điểm đặc biệt đó là cả 2 sợi đều là DNA dạng thẳng nhưng nhờ sự bổ
sung giữa 2 sợi mà hình thành cấu trúc vòng rcDNA.
Hệ gen của virus có chứa các khung đọc mở (open reading frame - ORF) xếp
chồng lên nhau kí hiệu là S, C, P và X mã hóa cho bốn protein khác nhau [58]. Cấu
trúc xếp chồng lên nhau của các vùng mã hóa khiến cho virus có thể sử dụng hệ gen
với hiệu suất 150% (Hình 2) [124].
-

Gen PreS1/PreS2 và S (mã hóa cho 3 protein vỏ L-, M- và S)

-

Gen precore/core (mã hóa cho protein nucleocapsid; HBcAg và các protein
không cấu trúc; HBeAg)

-

Gen polymerase (enzyme reverse transcriptase, RNase H)

-

Gen X (mã hóa cho protein điều hòa X)
Các gen S và C nằm ở các ORF riêng có các bộ ba mã mở đầu khác nhau,

tổng hợp các sản phẩm gen có chức năng khác nhau [30, 58]. Các ORF S và C lần
lượt kéo dài đến preS1 (preS1 và preS2) và vùng preC ở đầu 5’. Ở các vùng ORF
xếp chồng lên nhau có sự xuất hiện của các gen điều hòa là 4 vùng khởi động
(preC/C, preS1/S và X) và 2 trình tự tăng cường, các gen này cho phép sự biểu hiện
của 7 protein khác nhau được phiên mã từ các bộ ba mã mở đầu khác nhau bởi ít
nhất 5 mRNA khác nhau với đuôi tự do. Sản phẩm phiên mã đầu tiên có chiều dài
0,7 kb mã hóa cho protein HBx; các sản phẩm phiên mã có chiều dài 2,1 kb và 2,4
kb lần lượt mã hóa cho M- và S-HBsAg, L-HBsAg [30]. Sản phẩm phiên mã mã
hóa cho cả protein core và polymerase là pregenomic RNA (pgRNA). Pregenomic
RNA là mạch khuôn cho quá trình tổng hợp virus HBV và được phiên mã ngược để
hình thành nên hệ gen DNA của HBV. Như chúng ta đã biết, hệ gen của virus có
chiều dài 3,2 kb, và chiều dài của pgRNA là 3,5 kb, tức là dài hơn hệ gen của virus,
đó chính là bản sao “dự phòng” của hệ gen virus [75, 95]. Hai vùng gen với 11 nu
lặp lại được gọi là DR1 và DR2 nằm ở đầu 5’ ở cả sợi âm và sợi dương và hai gen

6


này có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của DNA virus [33, 58]. Hai trình
tự tăng cường (enhancer) kí hiệu là Enh1 và Enh2, giúp tăng biểu hiện của các sản
phẩm gen virus đặc hiệu với tế bào gan [58].
Vùng ORF S mã hóa cho các protein bề mặt của virus, HBsAg có cấu trúc
được phân chia và phân hóa tại các vùng preS1, preS1 và S với 3 bộ ba mã mở đầu
AUG khác nhau [92]. Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụ
thể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein
M và S HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [30, 33, 107].

Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV
1.1.4. Các protein HBV
Hệ gen HBV mã hóa cho 7 protein: HBx, core, polymerase, L-, M- và SHBsAg. Trong số các protein này, HBx là protein điều hòa không tham gia vào hình

thành cấu trúc của virus, HBeAg không tham gia vào cấu trúc của virion và protein
này được giải phóng một cách riêng biệt khỏi tế bào, polymerase chịu trách nhiệm
cho quá trình nhân lên của cả hệ gen, và protein core và HBsAg có chức năng hình
thành cấu trúc của virion. Chức năng của từng protein của virus HBV sẽ được nhắc
đến chi tiết hơn ở phần dưới đây.
Kháng nguyên E
HBeAg là sản phẩm cuối cùng của quá trình sau dịch mã ORF precore. Là
một trong những protein được mã hóa bởi sản phẩm phiên mã từ bộ gen của virus,

7


sự biểu hiện của protein này phụ thuộc vào vùng khởi động của bộ gen virus. ORF
HBeAg mã hóa cho một trình tự với đích là lưới nội chất (endoplasmic reticulum ER) và đồng thời cũng dịch mã ra các peptide hướng ngoài ER, nơi mà protein sau
khi hoàn thiện tồn tại ở dạng 15kD HBeAg - chính là các kháng nguyên được tiết ra
từ các tế bào nhiễm HBV [113].
Kháng nguyên bề mặt
HBsAg là protein vỏ của virion HBV. Như sự tồn tại của HBsAg ở các
virion trưởng thành, người lành mang HBV có chứa một lượng dư các tiểu thể hình
cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg không có khả năng gây nhiễm cũng tồn tại
trong huyết thanh của họ. Những tiểu thể này được tiết ra nhiều hơn (100 -100,000
lần) khi so với số lượng các virus trưởng thành được tiết ra [107]. Có một số báo
cáo đã chỉ ra rằng lý do các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg
được tổng hợp với số lượng gấp hàng nghìn lần so với tiểu thể Dane có thể là cái
bẫy dành cho hệ miễn dịch, từ đó, sự nhiễm mạn tính có thể được hình thành [30,
35]. HBsAg không chỉ được tạo ra bởi quá trình dịch mã của mRNA mà còn từ các
DNA tích hợp với bộ gen của người. Điều kiện này có thể giúp chúng ta biết được
trạng thái nhiễm của bệnh nhân một cách toàn diện hơn [107].
Chức năng chính của các kháng nguyên bề mặt đó là hình thành nên lớp vỏ
của virus. Ba dạng khác nhau của hạt virus được giải phóng từ tế bào nhiễm HBV là

kết quả của quá trình biểu hiện không đồng đều của ba kháng nguyên bề mặt này. SHBsAg là protein có mức biểu hiện cao nhất trong các kháng nguyên bề mặt của
virus HBV và protein này chính là thành phần chính cấu thành nên vỏ virus [25].
Protein lõi (protein core)
Protein core (protein lõi) (21 kD) hay còn gọi là HBcAg, là protein có vai trò
định hình cho virion. Khi được biểu hiện trong tế bào, protein này thường tồn tại ở
dạng nhị hợp, hoặc ở dạng capsid nhị thập diện đều T = 3 hoặc T = 4. Khoảng 95%
các nucleocapsid được phân lập từ tiểu thể Dane có chứa capsid

T = 4 tạo nên

khoảng 120 lõi nhị hợp, với 5% còn lại là các capsid T = 3 với 90 nhị hợp.

8


Protein lõi được dịch mã từ pgRNA và 149 axit amin đầu tiên hình thành nên
vùng lắp ráp, có chức năng cho sự hình thành in vitro của capsid, capsid này sẽ có
sự khác biệt với capsid được phân lập từ tiểu thể Dane [16]. Khoảng 34 - 36 axit
amin còn lại sẽ tạo nên vùng C-terminal giàu Arginine (CTD); quá trình phosphoryl
hóa của một số axit amin trong vùng CTD có chức năng điều hòa một số giai đoạn
trong chu trình sống của virus [57, 65, 73, 81].
Polymerase/Reverse transcriptase (RTase)
Không lâu sau khi xác định được dạng virus giống HBV ở vịt [69], mô hình
DHBV đã được sử dụng để xác định bộ gen của DHBV có trải qua trung gian RNA,
cho thấy HBV nhân đôi thông qua quá trình phiên mã ngược (RT) [99]. Trong khi
quá trình phiên mã ngược là một cơ chế đã được nhiều virus sử dụng, HBV trải qua
quá trình sao chép bộ gen với nhiều đặc điểm độc đáo. Protein polymerase (reverse
transcriptase/RTase/Pol/P) là protein 90kD và có khoảng 838 axit amin được tạo
thành từ 3 vùng chức năng và một vùng đệm thay đổi. Ở vùng N-terminal là vùng
TP (terminal protein), là vùng có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trình

sao chép bộ gen virus. Mặc dù vùng này có vai trò quan trọng giúp polymerase bám
vào pgRNA, đóng gói RNA, liên kết các protein [9, 119, 129], vùng TP là một
domain độc đáo không có ở các virus RT không thuộc nhóm HBV. Một vùng đệm
thay đổi có khả năng phân chia TP domain từ RT domain, và đã có một số nghiên
cứu cho thấy gần như tất cả axit amin thuộc vùng đệm này có thể bị đột biến mà
không làm thay đổi chức năng của P [86]. Thực tế là, chỉ có 3 phân tử cysteine nằm
trong vùng C-terminal của vùng đệm, cùng với một phần tư của đầu N-terminal của
RT domain là quan trọng đối với chức năng của enzyme RTase/polymerase [53].
RT domain có vai trò trong quá trình nhân lên của bộ gen virus bằng cách phiên mã
ngược pgRNA để hình thành sợi âm trong DNA của bộ gen virus và sau đó sợi âm
này được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp sợi dương của DNA. Domain
này có độ tương đồng cao đối với các loại retrovirus khác [122]. Hiện nay domain
RT là liệu pháp đích duy nhất chống lại HBV [91], dựa trên hiệu quả của các loại
thuốc NAs có khả năng ức chế khả năng của enzyme RTase của virus HIV. Thực tế

9


là, các thành phần trong HBV RTase có thể được thay thế bằng các thành phần
đồng hợp của HIV RTase [116].
Domain cuối cùng, P, là domain của enzyme RNase H. Domain này chịu
trách nhiệm cho việc cắt bỏ mạch khuôn pgRNA trong suốt quá trình tổng hợp sợi
âm của hệ gen DNA. Sự định hướng của các liên kết ion kim loại là rất quan trọng
đối với hoạt tính của RNase H, đạt được qua 4 carboxylate được bảo toàn [103].
Một vài nghiên cứu về domain RNase H cho thấy vai trò quan trọng của domain
này trong việc đóng gói pgRNA [10].
Protein X
HBx là protein có chức năng điều hòa duy nhất được mã hóa bởi HBV.
Protein này gồm có 154 axit amin, 17 kD và được mã hóa bởi ORF nhỏ nhất của
HBV. Đã có rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy những bằng chứng xác thực về vai trò

cần thiết của HBx trong suốt quá trình nhân lên của HBV. Đặc biệt, có một vài
nghiên cứu đã chỉ ra rằng HBx liên kết với cccDNA [13], và HBx là yếu tố cần cho
quá trình phiên mã từ cccDNA [94]. Ngoài ra còn một số nghiên cứu về các HBV ở
động vật có vú cho thấy vai trò của các protein X đối với quá trình nhân lên của bộ
gen virus [128]. Những thử nghiệm về việc ức chế HBx đều cho thấy sự suy giảm
về mức độ nhân lên của virus HBV đã cho chúng ta thấy một điều rằng có thể HBx
không thật sự cần thiết cho quá trình nhân lên của virus nhưng không thể nghi ngờ
gì về khả năng tăng cường mức độ nhân lên của virus [108]. Quan trọng là, sự cần
thiết của HBx đã được chứng minh trong các tế bào gan của người trực tiếp nhiễm
HBV kiểu dại hoặc HBV có gen HBx bị bất hoạt [64].
1.1.5. Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe
a) Lựa chọn vùng trình tự ổn định, đặc hiệu cho HBV pgRNA làm đích thiết
mồi/probe.
HBV là virus rất được quan tâm từ nhiều thập kỷ trước, tuy nhiên cho đến
nay HBV vẫn còn là một bí ẩn do hệ gen của HBV chứa nhiều biến dị di truyền và
đột biến ngẫu nhiên. Do đó, bước quan trọng trước khi lựa chọn vùng trình tự

10


pgRNA để thiết kế mồi, probe là phân tích tính đa dạng di truyền, các đột biến trong
hệ gen HBV để từ đó xác định được vùng gen ổn định, đặc hiệu nhất.
Đa dạng di truyền của virus viêm gan B:
Như các virus khác, biến dị di truyền và sự tiến hóa của hệ gen là những yếu
tố quan trọng trong chu trình sống của virus HBV. Tuy nhiên, khác với những virus
có hệ gen là DNA khác, HBV có những đặc tính riêng biệt làm chúng trở nên khác
biệt với các virus đó. Đáng chú ý là enzyme polymerase của HBV thiếu đi chức
năng đọc sửa, và virus này có một bước trung gian qua RNA (pgRNA) trong chu
trình nhân lên của chúng. Hai đặc điểm này làm tăng khả năng xảy ra những sai số
ngẫu nhiên trong suốt quá trình nhân lên của hệ gen virus, dẫn đến sự biến đổi của

hệ gen [19, 51, 52]. Nói chung, tỉ lệ đột biến thay thế nucleotide của HBV ước tính
vào khoảng 1,4 – 5,0 × 10−5 trên từng vị trí mỗi năm, gấp gần 10 lần so với những
virus có bản chất hệ gen là DNA và RNA [76]. Mặt khác, nhờ vào cấu trúc xếp
chồng phức tạp của các khung đọc mở (open reading frame - ORFs) trong hệ gen
của HBV, thuận lợi cho việc phát sinh các biến dị [74, 77].
Đột biến ngẫu nhiên:
Đột biến điểm ngẫu nhiên có thể xuất hiện ở những cá thể tùy thuộc vào áp
lực chọn lọc khác nhau, như đã đề cập đến ở trên, hoặc xuất hiện trong quá trình
nhân lên của hệ gen, phân cắt hoặc nối hệ gen virus hoặc quá trình ghép nối và sửa
chữa của pgRNA [29, 98, 112]. Các đột biến ở những vùng khác nhau trên hệ gen
xuất hiện xuyên suốt các pha đặc hiệu trong quá trình lây nhiễm, ví dụ như đột biến
xảy ra ở vùng precore (đột biến PC), ở vùng lõi nền vùng khởi động (đột biến BCP),
thêm hoặc mất ở gen C, preS1 hoặc preS2, thay thế yếu tố quyết định kháng nguyên
‘a’ của HBsAg, đột biến kháng thuốc lamivudine hay các loại thuốc kháng virus
khác xảy ra ở protein Pol và đã được nghiên cứu xuyên suốt. Những loại đột biến
này giúp cho virus có thể sống dai dẳng trong các tế bào gan và có khả năng trốn
thoát khỏi hệ thống miễn dịch và áp lực của điều trị. Dù sao, dựa trên lý thuyết là
chủng dại (wild type) sẽ không bị thay thế dù trải qua hàng trăm năm của quá trình

11


tiến hóa, cho đến khi chúng vẫn là những kiểu gen không gây hại, ít nhất là ở những
giai đoạn đầu của pha dung nạp miễn dịch, trong khi chúng được thay thế sau đó
bởi các biến dị ở các giai đoạn sau của quá trình lây nhiễm [37].
Mặc dù hệ gen của HBV tồn tại nhiều biến dị, đột biến ngẫu nhiên song vẫn
tồn tại một số vùng bảo thủ cho thiết kế mồi, probe. Các vùng bảo thủ trong các
vùng gen của HBV đã được khảo sát từ nhiều nghiên cứu trước. Karinova và cộng
sự [50] đã tìm ra hai vùng được bảo thủ trong vùng gen S và X. Hai vùng gen này
có liên quan đến sự sao chép của HBV và lây nhiễm tế bào gan. Đặc biệt, vùng gen

X có liên quan mật thiết với HCC. Trong nghiên cứu này, vùng gen S được lựa
chọn là vùng có tỉnh ổn định và đặc hiệu cho HBV, vùng đích thiết kế mồi, probe
cho phản ứng RT-qPCR.
b) Đánh giá sơ bộ tính đa hình, đột biến của vùng gen dự định thiết kế mồi/probe
của HBV trên người Việt Nam.
Vùng gen S được đánh giá là vùng trình tự pgRNA ổn định, đặc hiệu. Tuy
nhiên, không phải tất cả vùng S đều ổn định. Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát
vùng trình tự ổn định nhất thuộc gen S trên đối tượng người Việt Nam. Các nghiên
cứu trên thế giới cho thấy vùng trình tự đầu N-terminal là vùng bảo thủ nhất của gen
S. Ngoài ra, vùng này cần thiết cho sự lắp ráp và bài tiết các hạt virus, tương tác với
kháng nguyên bề mặt [85]. Do đó, vùng đầu N-terminal của gen S được lựa chọn
làm vùng gen đích cho thiết kế mồi, probe trong phản ứng RT-qPCR định lượng
HBV RNA.
1.1.6. Chu trình nhân lên của HBV
HBV là một tác nhân truyền nhiễm chủ yếu qua đường máu và dịch cơ thể.
Qua tương tác với thụ thể vận chuyển nhân tế bào và protein nhận, lõi capsid và
relaxed circular HBV DNA (rcDNA) (hệ gen virus) được chuyển vào tế bào gan
[47]. Tuy nhiên, trước đó rcDNA được cải biến để chuyển thành dạng cccDNA
(DNA dạng vòng mạch kép). Cơ chế chuyển đổi như sau: Đầu tiên, rcDNA được
gắn với polymerase để khởi động quá trình. Sau đó, loại RNA primer ở đầu 5’ sợi

12


dương, loại trình tự thừa r và protein P ở đầu 5’ sợi âm. Bước tiếp theo là hoàn thiện
sợi dương không hoàn chỉnh. Cuối cùng, lai sợi âm và sợi dương với nhau hình
thành cccDNA, cccDNA được chuyển vào trong tế bào gan [31].
Qua sự hình thành cccDNA trong lây nhiễm tế bào gan, sự nhân lên của virus
trong tế bào gan như sau: cccDNA là khuôn phiên mã ra 5 loại RNA của virus cần
thiết choc ho việc tạo các kháng thể và quá trình nhân lên của virus. Sau đó, quá

trình diễn ra trong bào tương phiên mã ngược pgRNA trong các nucleocapsid mới
hình thành. RcDNA có chứa nucleocapsid tiếp theo được bao gói trong hạt virus và
được tiết ra dòng máu [115].
Hoạt tính phiên mã của cccDNA có thể được xác định qua đo tải lượng
pgRNA trong tế bào gan. Để tránh sinh thiết gan, các marker tự do trong huyết
tương được sử dụng để đánh giá hoạt tính phiên mã của cccDNA trong dự báo đáp
ứng điều trị CHB. Thêm vào đó, HBV RNA được xác định có mặt trong máu ngoại
vi bệnh nhân CHB và quan trọng nhất là pgRNA được bao gói trong hạt virus.
PgRNA huyết tương phản ánh lượng pgRNA trong tế bào gan, vì vậy pgRNA trong
huyết tương gián tiếp phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA trong tế bào gan
[7].

13


Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [49].

Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [49].
1.1.7. Con đường lây nhiễm của virus HBV
Theo WHO, HBV có thể tồn tại bên ngoài cơ thể ít nhất 7 ngày. Trong
khoảng thời gian đó, virus vẫn có khả năng lây nhiễm nếu như virus có thể xâm
nhập vào cơ thể của một người không được bảo vệ bởi vaccine. Quá trình ủ bệnh
của virus HBV trung bình khoảng 75 ngày, nhưng có thể nằm trong khoảng từ 30

14