PHÂN TÍCH TÍNH đa HÌNH (TG)m(T)n và một số đột BIẾN của GEN CFTR TRÊN BỆNH NHÂN bất sản ỐNG dẫn TINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

------***------

DƯƠNG THỊ HẢI VÂN

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH (TG)m(T)n VÀ MỘT SỐ
ĐỘT BIẾN CỦA GEN CFTR TRÊN BỆNH NHÂN
BẤT SẢN ỐNG DẪN TINH

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SỸ NỘI TRÚ

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
------***------

BỘ Y TẾ

DƯƠNG THỊ HẢI VÂN

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH (TG)m(T)n VÀ MỘT SỐ
ĐỘT BIẾN CỦA GEN CFTR TRÊN BỆNH NHÂN
BẤT SẢN ỐNG DẪN TINH
Chuyên ngành : Y sinh học- Di truyền
Mã số

: 62720301

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN BÁC SỸ NỘI TRÚ
Người hướng dẫn khoa học:
TS. BS. Lương Thị Lan Anh

HÀ NỘI – 2016


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN.................................................................................2
1.1. Bất sản ống dẫn tinh................................................................................2
1.1.1. Khái niệm.........................................................................................2
1.1.2. Dịch tễ học.......................................................................................2
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng bất sản ống dẫn tinh........................................2
1.1.4. Nguyên nhân....................................................................................3
1.1.5. Chẩn đoán bất sản ống dẫn tinh......................................................5
1.2. Gen điều hòa vận chuyển màng xơ nang CFTR.....................................6
1.2.1. Đặc điểm gen CFTR........................................................................6
1.2.2. Những đột biến gen CFTR liên quan đến bệnh xơ nang...............8
1.2.3. Những đột biến gen CFTR liên quan đến bất sản ống dẫn tinh....9
1.3. Xét nghiệm liên quan tới chẩn đoán bất sản ống dẫn tinh....................12
1.3.1. Tinh dịch đồ...................................................................................12
1.3.2. Fructose tinh dịch..........................................................................14
1.3.3. Xét nghiệm di truyền phân tử xác định đột biến CFTR..............14
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.......................................................20
2.1. Thời gian nghiên cứu............................................................................20
2.2. Tiêu chuẩn chọn đối tượng....................................................................20

2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................20
2.3.1. Tiến hành nghiên cứu....................................................................21
2.3.2. Quy trình tách chiết tách DNA.....................................................21
2.3.3. Kiểm tra độ tinh sạch của DNA....................................................22
2.3.4. Kỹ thuật Realtime- PCR................................................................22
2.3.5. Giải trình tự gen.............................................................................24
Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..........................................26


3.1. Đặc điểm chung của nam giới bất sản ống dẫn tinh..............................26
3.1.1. Phân bố theo tuổi...........................................................................26
3.1.2. Đặc điểm tinh dịch của nam giới bất sản ống dẫn tinh................26
3.1.3. Độ pH của tinh dịch nam giới bất sản ống dẫn tinh....................27
3.1.4. Đặc điểm fructose tinh dịch bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh......27
3.2. Đặc điểm đa hình (TG)m(T)n và một số đột biến gen CFTR khác trên
bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh...........................................................28
3.2.1. Đặc điểm tính đa hình (TG)m(T)n trên bệnh nhân bất sản ống
dẫn tinh.............................................................................................28
3.2.2. Đặc điểm đa hình M470V.............................................................28
3.2.3. Đặc điểm các loại đột biến gen CFTR khác.................................29
3.3. Đặc điểm mối tương quan giữa đa hình (TG)m(T)5 và đột biến gen
CFTR khác..........................................................................................30
Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN.................................................................32
4.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh...........................32
4.2. Đặc điểm về đa hình (TG)m(T)n và một số đột biến CFTR................32
4.3. Mối tương quan giữa đa hình (TG)m(T)n và những đột biến gen CFTR
khác.....................................................................................................32
DỰ KIẾN KẾT LUẬN....................................................................................33
DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ...................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACMG

American College Medical Genetics - Đại học Y khoa Di

CBAVD

truyền Hoa Kỳ
Congenital bilateral aplasia of the vas deferens - Bất sản ống

CFTR

dẫn tinh
Cystic fibrosis transmembrane conductance regular - Điều

CFTR- RDs

hòa vận chuyển màng trong bệnh xơ nang.
Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator related

DNA
mPCR

disorder - Rối loạn liên quan tới gen CFTR
Deoxyribonucleic acid
Mutilplex polymerase chain reaction - Phản ứng khuếch đại

WHO

chuỗi
World heath organization - Tổ chức y tế thế giới


DANH MỤC BẢNG ( trong mục bảng này mình mới them một
bảng bạn them vào mục lục cho mình)
Bảng 1.1: Danh sách 23 đột biến gen CFTR phổ biến theo ACMG 2008........9
Bảng 1.2: Chỉ số xét nghiệm tinh dịch đồ bình thường theo WHO 2010.......13
Bảng 1.3: Những kỹ thuật phát hiện đột biến gen CFTR thường sử dụng ở
châu Âu.........................................................................................16
Bảng 2.1: Chu kì luân nhiệt chạy Reatime- PCR............................................23
Bảng 2.2: Trình tự mồi nhân đoạn đặc hiệu intron8 và exon 10.....................24
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn intron 8 và exon 10...........24
Bảng 2.4: Chu trình luân nhiệt mPCR intron8 và exon 10.............................25
Bảng 3.1: Phân bố tuổi của bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh...........................26
Bảng 3.2: pH tinh dịch của nam giới bất sản ống dẫn tinh............................27
Bảng 3.3: Những kiểu gen (TG)m(T)n trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh. 27
Bảng 3.4: Phân bố số lượng đột biến gen CFTR phát hiện được....................28
Bảng 3.5: Phân bố loại đột biến gen CFTR.....................................................29
Bảng 3.6: Phân bố kết hợp đa hình (TG)m(T)n và những đột biến CFTR
khác...............................................................................................29
Bảng 3.7: Tương quan (TG)m(T)5 và những đột biến CFTR khác................30


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Phân bố thể tích tinh dịch của nam giới bất sản ống dẫn tinh....27

Biểu đồ 3.2: Phân bố tính đa hình M470V......................................................28

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ chẩn đoán nam giới CBAVD và CFTR- RDs theo khuyến cáo
của châu Âu 2009............................................................................6
Hình 1.2. Mô tả gen CFTR trên nhiễm sắc thể số 7..........................................7
Hình 1.3. Mô tả cấu trúc protein CFTR............................................................7
Hình 1 4: Sơ đồ hệ thống máy giải trình tự tự động........................................19
Hình 2.1: Mô tả phân tích kết quả Realtime- PCR..........................................24
Hình 2.2: Máy giải trình tự tự động Biosystems 3500....................................25



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bất sản ống dẫn tinh là tình trạng ống dẫn tinh không hình thành đầy đủ
từ lúc trước sinh. Bệnh lý này có thể xuất hiện ở một bên hoặc hai bên ống
dẫn tinh [1], [2].
Bất sản ống dẫn tinh chiếm khoảng 1 ÷ 2% vô sinh nam và chiếm 6%
số nam giới vô sinh do không có tinh trùng [3], theo Rapour và cộng sự bất
sản ống dẫn tinhc ó thể chiếm tới 10% nam giới không có tinh trùng [4].
Nguyên nhân gây bệnh ở phần lớn bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh có liên
quan đến đột biến gen điều hòa vận chuyển màng CFTR trong bệnh xơ nang –
một bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể [1], [2]. Hơn 95% trường hợp
bệnh nhân xơ nang có kèm bất sản ống dẫn tinh [5]. Bất sản ống dẫn tinh
được xếp vào nhóm rối loạn có liên quan đến gen CFTR (CFTR- RDs) [6].
Nghiên cứu về những đột biến và kiểu gen đa hình của gen CFTR trên
bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh đã được thực hiện nhiều tại các nước phương

Tây. Tuy nhiên, ở Đông Nam Á, những nghiên cứu về bệnh lý này vẫn còn
khá ít. Điều này có thể do tỉ lệ mang gen bệnh ở cộng đồng khu vực thấp và
những hạn chế về điều kiện, khả năng thực hiện. Theo thống kê của Đại học
Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG), ở người Mỹ gốc Á, tỉ lệ người mang gen
bệnh xơ nang CFTR là 1/ 8780 và tỉ lệ sinh trẻ bị bệnh là 1/ 35100 [7]. Thống
kê nghiên cứu về CFTR ở châu Á, đặc biệt ở Việt Nam còn chưa nhiều. Để
góp phần tìm hiểu về những đột biến gen CFTR trên bệnh nhân bất sản ống
dẫn tinh, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa hình (TG)m(T)n và một số
đột biến của gen CFTR trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh” nhằm mục
tiêu sau:
1. Xác định được tỷ lệ đa hình (TG)m (T)n của intron 8 và một số đột biến
khác của gen CFTR trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh.
2. Mô tả được tương quan giữa (TG)m (T)n và một số đột biến gen CFTR
trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh.


2

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Bất sản ống dẫn tinh
1.1.1. Khái niệm
Bất sản ống dẫn tinh là tình trạng ống dẫn tinh không hình thành đầy đủ
từ lúc trước sinh. Bệnh lý này có thể xuất hiện ở một bên hoặc hai bên ống
dẫn tinh [1], [2].
1.1.2. Dịch tễ học
Tỷ lệ bất sản ống dẫn tinh chiếm khoảng 1 ÷ 2% vô sinh nam và tới 6%
nam giới vô sinh do không có tinh trùng [3]. Theo tác giả Radpour và cộng
sự, tỷ lệ bất sản ống dẫn tinh có thể lên đến 10% ở nam giới không có tinh
trùng [4].

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lê Thế Vũ và cộng sự về nguyên nhân
gây vô sinh nam cũng cho thấy tỉ lệ bất sản ống dẫn tinh chiếm 1% nam giới
không có tinh trùng [8]. Nghiên cứu đặc điểm tinh dịch đồ của 1.000 cặp vợ
chồng cho thấy nguyên nhân vô sinh do không có tinh trùng chiếm 8% [9].
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng bất sản ống dẫn tinh
Bất sản ống dẫn tinh có thể xuất hiện như một bệnh lý đơn độc trên
nam giới hoặc là một trong những triệu chứng đi kèm với bệnh xơ nang. Đây
là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường của tuyến nhầy, gây ra những
tổn thương tiến triển trên hệ thống hô hấp và những bệnh hệ tiêu hóa mạn
tính... Hơn 95% nam giới xơ nang bị vô sinh do không có tinh trùng gây ra
bởi không có, thiểu sản hay xơ hóa cấu trúc ống Wolffian xảy ra từ thời kì bào
thai [5].


3

Khi thăm khám nam khoa, bệnh nhân có tinh hoàn, dương vật bình
thường nhưng không sờ thấy hoặc chỉ sờ thấy sợi xơ vết tích của mào tinh
hoàn, ống dẫn tinh hoặc túi tinh và/ hoặc ống phóng tinh [5], [10].
Trên siêu âm qua đường trực tràng không có ống dẫn tinh trong ổ bụng,
không thấy tuyến tinh và những mức độ thiểu sản khác nhau của túi tinh.
Những bất thường này cũng có thể xác định được khi chọc hút mào tinh hoàn.
Xét nghiệm tinh dịch đồ bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh không có tinh
trùng, thể tích tinh dịch thấp (< 2.0 ml), pH < 7.2, không có hoặc giảm
fructose và α1-4 glucosidase.
Xét nghiệm hóa sinh máu những nội tiết nam cho thấy hormone FSH
(follicle stimulating), LH (luteinizing hormone), nồng độ testosterone bình
thường [11].
Tinh hoàn phát triển và có chức năng sinh tinh bình thường nhưng tinh
trùng không thể thoát ra ngoài qua ống dẫn tinh do tắc nghẽn. Kết quả là vô

sinh nam. Nam giới mắc bất sản ống dẫn tinh chỉ có thể làm cha khi có sự hỗ
trợ sinh sản. Bệnh lý này được báo cáo là không ảnh hưởng đến hoạt động
tình dục.
Đa số nam giới bất sản ống dẫn tinh không có biểu hiện đặc trưng khác
của xơ nang, tuy nhiên một vài nam giới mắc bệnh này có những biểu hiện
bệnh hô hấp nhẹ hoặc vấn đề tiêu hóa.
1.1.4. Nguyên nhân
Nguyên nhân của phần lớn trường hợp bất sản ống dẫn tinh liên quan
với bệnh xơ nang và đột biến gen CFTR. Hơn 95% nam giới bị xơ nang có
kèm bất sản ống dẫn tinh [5].
Tuy nhiên, kiểu đột biến gen CFTR ở bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh
rất khác biệt so với những đột biến gen CFTR tìm thấy trên bệnh nhân xơ


4

nang. Bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh thường là đồng hợp tử hai đột biến trên
hai alen (88%) hoặc hai đột biến nhẹ trên cùng một alen (12%). Trong khi,
những trường hợp biểu hiện bệnh xơ nang đặc trưng có dạng đồng hợp tử hoặc
dị hợp tử hai đột biến nặng gen CFTR gây ra. Những đột biến gen hay gặp nhất
trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh là đa hình alen T5, delF508, và R117H, hoặc
sự kết hợp giữa alen T5 và một đột biến nặng trên alen khác [12].
Nhóm nhỏ hơn (10 ÷ 40%) liên quan với bất sản ống dẫn tinh một bên.
Cơ chế di truyền của nhóm này chưa được hiểu rõ [1], [2].
Theo hướng dẫn thực hành xét nghiệm phân tử về chẩn đoán bệnh xơ
nang và những rối loạn liên quan đến bệnh xơ nang của châu Âu 2008, tiêu
chí đánh giá đột biến gen CFTR gây bệnh xơ nang [11]:
 Đột biến gen CFTR gây bệnh:
o Đột biến gây thay đổi trình tự amino acid gây ảnh hưởng nặng
đến tổng hợp và/ chức năng protein CFTR.

o Đột biến gây ra tín hiệu kết thúc trước khi protein CFTR được
tổng hợp hoàn thiện (thêm nucleotid, mất nucleotid hoặc đột biến
vô nghĩa).
o Đột biến gây thay đổi đa hình nucleotid GT/AG của instron tại vị
trí nối.
o Đột biến gây mất một hoặc nhiều exon.
 Đột biến gen CFTR có thể gây bệnh:
o Đột biến làm thay đổi trình tự một acid amin bình thường trên ít
nhất 100 người mang gen đột biến CFTR trong nhóm bệnh nhân
cùng chủng tộc.


5

o Đột biến làm thay đổi trình tự amino acid có tính bảo tồn cao
trong quá trình tiến hóa.
o Đột biến gây ra một vị trí nối mới hoặc tiềm tàng.
o Đột biến giống những trình tự đa hình được quan sát thấy ở
những protein khác thuộc nhóm protein vận chuyển gắn ATP.
1.1.5. Chẩn đoán bất sản ống dẫn tinh
Một số tiêu chí lâm sàng và cận lâm sàng chẩn đoán bất sản ống dẫn
tinh (Khuyến cáo Châu Âu 2009, Samuel M Moskowitz và cộng sự [5] ):
Tiêu chí bắt buộc :
• Không có tinh trùng trong tinh dịch.
• Không sờ thấy ống dẫn tinh.
• Một đột biến xác định ở trên một/ hai alen của gen CFTR.
Tiêu chí phụ khác có thể kèm theo:
• Thể tích tinh dịch thấp (< 2 ml )
• Triệu chứng sinh hóa điển hình: pH< 7.2, không có hoặc giảm
fructose và α1-4 glucosidase (những marker bình thường của

túi tinh và mào tinh hoàn)
• Trên siêu âm qua trực tràng: không thấy phần ống dẫn tinh trong
ổ bụng, globus không điển hình, và mức độ thiểu sản khác nhau
của túi tinh. Những bất thường này cũng có thể xác định thông
qua phẫu thuật chọc hút tinh trùng.
• Hormon FSH, LH và testosterone bình thường.


6

Hình 1.1. Sơ đồ chẩn đoán nam giới CBAVD và CFTR- RDs theo khuyến cáo
của châu Âu 2009
1.2. Gen điều hòa vận chuyển màng xơ nang CFTR
1.2.1. Đặc điểm gen CFTR
 Vị trí, kích thước gen
Gen CFTR nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 7, vùng 3, băng 1, băng
phụ 2 (kí hiệu 7q31.2 ) được phát hiện đầu tiên năm 1989. Gen CFTR gồm 27
exon. Trình tự mã hóa của gen dài khoảng 230 kb; mRNA xấp xỉ 6,5 kb.


7

Hình 1.2. Mô tả gen CFTR trên nhiễm sắc thể số 7
(nguồn: ghr.nlm.nih.gov)
 Cơ chế gây bệnh
Gen CFTR mã hóa protein điều hòa vận chuyển màng trong bệnh xơ
nang. Đây là một glycoprotein gồm 1480 amino acid, có trọng lượng phân tử
khoảng 170.000 dalton. Protein này là thành viên gia đình protein vận chuyển
tích cực gắn ATP. Protein là phức hợp gổm 2 tiểu đơn vị, mỗi đơn vị có 6
vùng xuyên màng và gắn với nhau tại vị trí gắn ATP. Giữa 2 đơn vị là một

vùng điều hòa [7].
Protein này hình thành kênh vận chuyển ion qua màng tế bào chủ yếu là
kênh clo ngoài ra nó còn có thể vận chuyển một số ion khác như natri, HCO3MSD (Membrane spainning domain ):
Vùng xuyên màng
NBD (Nucleotid binding domain): Vùng
gắn nucleotid
R (Regulatory domain ): Vùng điều hòa

Hình 1.3. Mô tả cấu trúc protein CFTR
(nguồn: www.genet.sickkid.on.ca/CFTRtr/)
Đột biến gen tạo ra sản phẩm protein bất thường,dẫn đến sự thiếu hụt
vận chuyển điện tử và thiếu hụt kênh vận chuyển ion trên màng tế bào biểu


8

mô của tuyến nước bọt, đường thở, tuyến tụy, đường sinh dục và đường tiêu
hóa. Có 4 lớp phân loại đột biến gen CFTR:
 Đột biến lớp 1 dẫn tới thiếu hụt sản phẩm protein.
 Đột biến lớp 2 dẫn tới thiếu hụt tiến trình hoàn thiện protein.
 Đột biến lớp 3 gây tổn thương điều hòa kênh.
 Đột biến lớp 4 dẫn tới thiếu hụt vận chuyển qua kênh một phần do
đó bệnh có biểu hiện nhẹ hơn.
Ngoài ra, đột biến gen CFTR có thể ảnh hưởng đến gắn cAMP vùng điều
hòa của kênh clo. Quá trình phosphoryl hóa vùng điều hòa có vai trò trong
điều khiển hình thành lỗ màng hoặc mở cổng của kênh [7].
Ở bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh, protein mã hóa bởi gen CFTR hình
thành kênh vận chuyển ion clo ra vào tế bào. Đột biến gen CFTR gây rối loạn
chức năng kênh clo, mất điều hòa vận chuyển dòng ion clo và nước qua màng
tế bào. Những tế bào trong đường sinh dục nam sản xuất ra chất nhầy đặc

dính. Loại dịch nhầy này ức chế ống dẫn tinh hình thành và khiến chúng bất
sản từ thời kì bào thai.
Bất sản ống dẫn tinh, viêm tụy cấp tính hoặc mãn tính hay tái phát, bệnh
phổi tiến triển mạn tính kèm rối loạn chức năng protein CFTR được xếp vào
nhóm những rối loạn liên quan đến gen CFTR (CFTR-RDs) [13].
1.2.2. Những đột biến gen CFTR liên quan đến bệnh xơ nang
Thống kê đầy đủ những đột biến gen CFTR có thể tìm thấy trong cơ sở
dữ liệu đột biến gen CFTR về xơ nang tại địa chỉ www.genet.sickkids.on.ca/
CFTRtr/. Hơn 2.000 đột biến đã được phát hiện trên gen CFTR. Tuy nhiên,
phần lớn những đột biến có tần số thấp < 0.1% hoặc chỉ là những đột biến rời
rạc, hiếm. Những đột biến này thay đổi theo chủng tộc và khu vực địa lý. Đại
học Y khoa di truyền Hoa Kì (ACMG) đã đưa ra danh sách thống kê 23 đột
biến gen CFTR hay gặp. Đồng thời, ACMG cũng khuyến cáo những phòng


9

thí nghiệm cần xem xét kĩ danh sách đột biến sàng lọc tùy theo vùng địa lý và
chủng tộc để tỉ lệ phát hiện đột biến đạt được cao nhất.
Bảng 1.1: Danh sách 23 đột biến gen CFTR phổ biến theo ACMG 2008
ΔF508
ΔI507
621+1G>T
G85E
3849+10kbC>

R553X
G542X
R117H
R334W

2789+5G>A

R1162X
G551D
1717-1G>A
R347P
3659delC

2184delA
W1282X
A455E
711+1G>T

3120+1G>A
N1303K
R560T
1898+1G>A

T
1.2.3. Những đột biến gen CFTR liên quan đến bất sản ống dẫn tinh
Đột biến gen CFTR gây bệnh ở nam giới bất sản ống dẫn tinh rất khác
biệt so với những đột biến gen CFTR tìm thấy trên bệnh nhân xơ nang. Bệnh
nhân bất sản ống dẫn tinh thường là đồng hợp tử hai đột biến nhẹ trên hai alen
(88%) hoặc hai đột biến nhẹ trên cùng alen (12%).Trong khi, bệnh nhân xơ
nang điển hình có đột biến gen CFTR dạng đồng hợp tử hoặc dị hợp tử hai đột
biến nặng. Những đột biến gen hay gặp nhất trên bệnh nhân bất sản ống dẫn
tinh là đa hình alen T5, ΔF508, và R117H, hoặc sự kết hợp giữa alen T5 và
một đột biến nặng trên alen khác [12].
 Đột biến ΔF508 (c.1521_1523delCTT/ p.Phe508del/ [delta]F508)
ΔF508 là đột biến mất bộ ba nucleotid mã hóa acidamin phenylalanin tại

ví trí 508 trên phân tử protein CFTR trưởng thành. Đột biến này dẫn đến tạo
ra một protein không thể vận chuyển đến đúng vị trí trên màng tế bào. Kết
quả protein bị giáng hóa và thiếu hụt trầm trọng protein CFTR trên màng
ngoài tế bào biểu mô [14].
ΔF508 là đột biến phổ biến hay gặp nhất chiếm tới 31 ÷ 72% đột biến
CFTR trên người da trắng. Tỷ lệ này thay đổi tùy theo chủng tộc và địa lý [7].


10

Tại Trung Quốc, nghiên cứu của Wu- Hua Nivà cộng sự năm 2012 trên
109 bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh và 104 nam giới khỏe mạnh bình thường cho
thấy trong số những bệnh nhân này không phát hiện đột biến ΔF508 [15].
Tại Việt Nam, nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật phát hiện đột biến gen
CFTR của Trương Văn Hợp, Trần Đức Phấn trên 55 nam giới không có tinh
trùng tại bộ môn Y sinh học- Di truyền năm 2015 cũng không phát hiện đột
biến này [16]. Nghiên cứu của Mai Hà Nam và cộng sự năm 2005 phân tích
trên 495 mẫu máu ngẫu nhiên của người Việt Nam khỏe mạnh không phát
hiện đột biến ΔF508 [17]. Tuy số lượng nghiên cứu còn chưa nhiều, nhưng
những nghiên cứu này chỉ ra phần nào sự khác biệt về phân bố đột biến gen
CFTR ở người châu Âu và châu Á nói chung, người Việt Nam nói riêng.


(TG)m(T)n
Vùng poly T là đoạn chứa baso thymidin nằm ở intron8 của gen CFTR.

Kích cỡ vùng poly T có thể gây CFTR- RDs (những rối loạn liên quan tới gen
CFTR ) khác nhau. Ba đa hình phổ biến của vùng poly T là 5T, 7T và 9T. Cả
7T và 9T được xem là những đa hình bình thường. 5T được xem là đa hình
gây rối loạn liên quan đến đột biến gen CFTR trong đó có bất sản ống dẫn

tinh. 5T được cho rằng làm giảm khả năng nối của intron 8 dẫn tới mất exon 9
khi phiên mã. Theo ACMG, đánh giá polyT là phù hợp nhất khi có phát hiện
đột biến R117H trên bệnh nhân xơ nang hoặc bất sản ống dẫn tinh [5], [7].
Mức độ nặng của bệnh phổi ở những bệnh nhân có một hoặc hai đột biến
R117H phụ thuộc vào độ dài đoạn poly T của intron 8 [18]. Những bệnh nhân
có một đột biến gen CFTR gây bệnh cộng thêm đoạn 5T ở vị trí cis với đột
biến R117H thường biểu hiện bệnh phổi của bệnh xơ nang, nhưng nếu đột
biến đó đi kèm với đa hình 7T hoặc 9T bệnh nhân có thể không có triệu chứng
hoặc triệu chứng nhẹ của bệnh phổi [19], [20].


11

Khi đa hình T5 trên gen CFTR được sử dụng để chẩn đoán bất sản ống
dẫn tinh hoặc những trường hợp bệnh xơ nang không điển hình, chiều dài
đoạn lăp TG nên đươc xác định [5].
Vùng TG nằm ngay ở đầu 5’ của vùng poly T. Vùng này chứa một đoạn
lặp TG ngắn thường lặp 11 hoặc 12 hoặc 13 lần. Vùng lặp TG càng nhiều (12
hay 13 lần) nối với đoạn poly T càng ngắn (5T) có liên quan chặt chẽ với tỉ lệ
mất nối exon 9. Bệnh nhân mang (TG)12(T)5 và (TG)13( T)5 ở vị trí trans
với đột biến genCFTR khác có thể phát triển thành triệu chứng nhẹ của xơ
nang. Những bệnh nhân này nên được đánh giá lâm sàng để theo dõi, quản lý
bệnh lâu dài [7].
Ramin Rapour và cộng sự khi nghiên cứu tính đa hình của vùng
(TG)m(T)n trên 112 bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh Iran thấy rằng kết hợp
T5 ở vị trí cis với (TG) 12- 13 trên intron 8 có tăng biểu hiện mất exon 9 [21].
Nghiên cứu của Qiang Du và cộng sự trên 89 nam giới mắc bất sản ống dẫn
tinh cho thấy đồng hợp tử kiểu gen (TG)13T5 và (TG)12T5 dẫn tới bất sản
ống dẫn tinh [22].
(T)5 và lặp poly TG kết hợp với những đột biến khác ở vị trí cis trên gen

CFTRcó thể hình thành nên phức hợp allen gây bệnh. Ngoài việc những đột
biến này được sử dụng để phục vụ chẩn đoán, tiên lượng trên bệnh nhân,
chúng còn có giá trị để sàng lọc trước sinh.
 R117H (c.350G>A/ p.Arg117His)
Đây là đột biến gen CFTR ở vị trí nucleotid thứ 350, đột biến này có sự
thay thế nucleotid guanine (G) thành adenine (A). Đột biến thuộc exon 4 của
gen CFTR gây thay thế acidamin Arginin (R) thành Histidine (H) ở vị trí 117
trên phân tử protein CFTR trưởng thành. Đột biến này có tần xuất khoảng
0,3% trong số đột biến gen CFTR (cơ sở dữ liệu gen CFTR: http://www.
genet.sickkids. on.ca/). R117H ở cùng vị trí cis trên nhiễm sắc thể với T5 hoặc
T7. R1117H(T)5 được xem như phức hợp alen gây nên những biểu hiện bệnh


12

xơ nang nhẹ trong đó có bất sản ống dẫn tinh [7], [11]. Ngược lại, R117H ở vị
trí trans với T5 được xem là đột biến không gây bệnh [7].
 Đột biến M470V (c.1408A>G/ p.Met470Val ):
Đây là đột biến gen CFTR ở vị trí nucleotid 1540 trên exon10. Đột biến
thay thế base adenin (A) thành guanine (G) gây ra sự thay thế acid amin thứ
470 của protein CFTR từ Methionine (M) thành Valine (V). M70V không
phải là đột biến gây bệnh xơ nang ( Tuy nhiên, nhiều
nghiên cứu cho thấy đột biến này khi kết hợp với một số kiểu gen (TG)m(T)n
làm tăng nguy cơ bị bệnh bất sản ống dẫn tinh. Nghiên cứu của Qiang Du và
cộng sự năm 2012 trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh người Trung Quốc cho
thấy kiểu gen (TG)12T5- V470 có thể dẫn tới mắc bệnh bất sản ống dẫn tinh.
Nghiên cứu của Wu- Hua Ni và cộng sự (2012) về đa hình poly T, TG và
M470V trên 109 bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh cũng cho kết quả tương tự
[15]. Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy M470 là nhân tố bảo vệ trong sự
xuất hiện bất sản ống dẫn tinh [17], [23].

Ngoài ra còn rất nhiều đột biến gen CFTR khác gây bất sản ống dẫn tinh,
nghiên cứu của chúng tôi bước đầu tập trung vào phân tích vùng đa hình
(TG)m(T)n, M470V và một số đột biến CFTR khác bao gồm del21kb,
L138ins, delI507, delF508, 394delTT, 604insA, 1677delTA, 2143delT,
2184insA, 3821delT, 3944delTG.
1.3. Xét nghiệm liên quan tới chẩn đoán bất sản ống dẫn tinh
1.3.1. Tinh dịch đồ
Trong quá trình phóng tinh, tinh dịch được tạo thành từ sự trộn lẫn
tinh trùng trong cặp mào tinh hoàn với dịch tiết từ tuyến sinh dục. Khi so
sánh tinh dịch trước và sau thắt ống dẫn tinh cho thấy khoảng 90% thể tích
tinh dịch được tạo thành do những tuyến tiết dịch phụ này, phần lớn là dịch
tuyến tiền liệt và túi tinh với một lượng nhỏ góp vào của tuyến Cowper và
mào tinh hoàn.


13

Tinh dịch có 2 phần chính:
• Tổng số tinh trùng: phản ánh khả năng sinh tinh của tinh hoàn và sự
thông thoáng của đường dẫn tinh
• Tổng thể tích dịch tiết: Dịch tiết được tạo nên từ nhiều tuyến tiết
phụ do đó thể tích dịch phản ánh hoạt động bài tiết của các tuyến
sinh dục.
Tinh dịch đồ phân tích số lượng và chất lượng của tinh dịch thoát ra
trong quá trình xuất tinh. Tinh dịch đồ đánh giá cả hai thành phần của tinh
dịch là tinh trùng và dịch tiết. Đây là xét nghiệm đầu tay trong đánh giá vô
sinh nam.
Khi đánh giá chất lượng tinh dịch nam giới, WHO khuyến cáo cần đánh
giá 2 đến 3 mẫu tinh dịch để có được thông tin cơ bản của bệnh nhân.
Bảng 1.2: Chỉ số xét nghiệm tinh dịch đồ bình thường theo WHO 2010

Chỉ số xét nghiệm
Thể tích tinh dịch
pH tinh dịch
Độ tụ tinh trùng
Di động tinh trùng

Giá trị bình thường
≥1,5ml
≥7,2
mức 1 ÷ 4
 Tổng số tinh trùng di động (gồm tiến tới

nhanh và không tiến tới) ≥ 40%
 Tổng số tinh trùng tiến nhanh ≥ 32%
Tỉ lệ sống tinh trùng
≥ 58%
Tổng số tinh trùng
≥ 39 x 106 tinh trùng
Mật độ tinh trùng
≥ 15 x 106 tinh trùng/ml
Tế bào khác (tế bao biểu mô, < 1 x 106 tế bào/ ml
tế bào tròn (tế bào gốc và
bạch cầu) hoặc tinh trùng
biến dạng đầu và đuôi
Hình thái tinh trùng

≥ 4% bình thường

Do thể tích tinh dịch trong mỗi lần xuất tinh chủ yếu do túi tinh và tuyến
tiền liệt tiết ra, một lượng nhỏ do tuyến Cowper và mào tinh hoàn. Thể tích

14

tinh dịch dùng để tính toán tổng số lượng tinh trùng và tế bào khác trong mỗi
lần xuất tinh. Đo lường thể tích tinh dịch là cần thiết khi đánh giá bất kì mẫu
tinh dịch nào. pH tinh dịch phản ánh sự cân bằng toan kiềm trong dịch tiết của
những tuyến tiết sinh dục khác nhau. Trong đó, tuyến tinh tiết dịch kiềm,
tuyến tiền liệt tiết dịch toan. pH tinh dịch bình thường ≥ 7,2. Trong bất sản
ống dẫn tinh, do ống dẫn tinh và túi tinh không phát triển dẫn đến không có
hoặc ít tinh trùng trong tinh dịch, thể tích tinh dich và pH thấp (< 7,0) [24].
1.3.2. Fructose tinh dịch
Fructose trong tinh dịch chủ yếu do tuyến tinh bài tiết. Fructose có vai
trò quan trọng trong sự vận động tinh trùng.
Nồng độ fructose tinh dịch thấp phản ánh tắc nghẽn ống dẫn tinh hoặc
bất sản ống dẫn tinh, xuất tinh ngược dòng một phần hoặc do thiếu hụt
androgen [24].
Trên bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh, nồng độ fructose tinh dịch thấp
30-80 mg/100ml trong khi bình thường nồng độ khoảng 250 ÷ 720 mg/100ml
tinh dịch [5].
1.3.3. Xét nghiệm di truyền phân tử xác định đột biến CFTR
Xét nghiệm di truyền ở mức độ phân tử nhằm phát hiện đột biến gen
CFTR (những đột biến là nguyên nhân gây bệnh) chủ yếu dựa trên quá trình
phân tích gen CFTR trực tiếp. Quá trình này cần dựa trên kiến thức về bệnh
học của đột biến gen CFTR và sự sẵn có của các thiết bị xét nghiệm di truyền
ở mức độ phân tử phát hiện đột biến. Có rất nhiều thiết bị được sử dụng để
phát hiện những biến đổi trên gen CFTR và hiện chưa có một tiêu chuẩn vàng
nào cho xét nghiệm thường quy. Tất cả những phương pháp đều yêu cầu kỹ
năng, kinh nghiệm để thực hiện và phiên dịch gen được. Dù không có tiêu
chuẩn hay một phương pháp thực sự hiệu quả nhưng các phòng thí nghiệm nên

nhận thức được các giới hạn trong lựa chọn phương pháp và nên biết những đột


15

biến nào không thể tìm ra. Mỗi phòng thí nghiệm độc lập nên chọn một phương
pháp phù hợp nhất với kinh nghiệm, khả năng và mục đích sử dụng.
Các phương pháp được sử dụng trong phát hiện đột biến gen CFTR có
thể chia thành 2 nhóm [11]:
- Nhóm xét nghiệm những đột biến đã biết. Ví dụ: kiểm tra các mẫu
DNA để tìm sự có mặt hay vắng mặt của một hoặc một vài đột biến nhất định.
- Nhóm sàng lọc phát hiện đột biến. Ví dụ: rà soát lại các mẫu DNA để
tìm ra sự chênh lệch so với các biến đổi chuẩn.
Mục đích chung của cả 2 nhóm phương pháp đều là để tìm ra sự sắp
xếp lại mức độ lớn chưa được phát hiện trên gen CFTR bao gồm cả những
mất đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn,... bằng việc sử dụng các kỹ thuật PCR bán
định lượng như MLPA (multiplex ligation-dependant probe amplification)
hoặc multiplex PCR [25], [26], [27]. Với các kỹ thuật này, các đột biến vốn
khó được phát hiện bằng các kỹ thuật khuếch đại thông thường, sẽ có khả
năng tìm thấy tăng thêm đến 2% trên các allen của bệnh nhân xơ nang [25],
[26], [27] , [28], [29] và 1% của các bệnh nhân bất sản ống dẫn tinh [30].


16

Bảng 1.3: Những kỹ thuật phát hiện đột biến gen CFTR thường sử dụng ở
châu Âu [11]
Kỹ thuật phát

Đột biến được

Ưu điểm

Hạn chế

Nhanh, đơn giản

Sự di chuyển của

hiện đột biến
Phân tích

phát hiện
Chủ yếu là

Heteroduplex

F508del và

các mẫu không

I507del

đặc hiệu cho một
đột biến nhất

định.
Phân tích enzym Chủ yếu là các Nhanh, đơn giản, Không đặc hiệu,
giới hạn

đột biến độc lập

thuận

tiện

cho đặc biệt nếu có

việc tìm các đột sự thay đổi locus.
Lai dot blot

> 20 đột biến

biến hiếm
Phù hợp với

ngược

khác nhau

nghiên cứu chuỗi

36 đột biến
> 20 đột biến

lớn
Tính đặc hiệu cao
Phù hợp với
Khó

Inno LiPA
ARMS

tạo

đoạn

nghiên cứu chuỗi

mồi, các kết quả

lớn

dựa trên sự vắng
mặt của sản phẩm
PCR.

Tepnel
OLA

28-30 đột biến

Độ đặc hiệu cao
Phù hợp với
nghiên cứu cỡ

Abbott Molecular 32 đột biến
KT phát hiện đột
biến chưa biết
DGGE

Phát hiện tất cả

mẫu lớn
Độ đặc hiệu cao

Độ nhạy cao (> Khó thực hiện


17

các đột biến của

95%)

các mẩu base
trong vùng mã hóa
và vùng ranh giới
giữa các intron
Nt

Độ nhạy cao (>

SSCP
Sequencing

Nt
Nt

95%)

Đơn giản, nhanh
Độ nhạy gần

MLPA

100%
Phát hiện các đột Đơn giản, nhanh

Khó tìm ra đột

biến mất đoạn,

biến lặp đoạn

DHPLC

Độ nhạy 80-85%

thêm đoạn, lặp
đoạn của tất cả
các vùng mã hóa.
Tuy nhiên, các kỹ thuật và phương tiện không thể giúp phát hiện ra 100%
các đột biến. Những đột biến không thể tìm thấy có thể không nằm trong các
intron hoặc vùng điều hòa của gen, là những vị trí không thường được phân tích.
Bên cạnh các quy trình phân tích gen trực tiếp được giới thiệu ở trên,
việc phân tích các marker CFTR đa hình thái cũng có thể hữu ích trong nhiều
trường hợp cụ thể mà thường dùng nhất là trong việc nghiên cứu phả hệ.
Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng kỹ thuật Realtime- PCR, giải trình tự gen
để phát hiện đột biến gen CFTR.
 Phản ứng chuỗi polymerase: phương pháp này được Mullis và

cộng sự đề xuất vào năm 1985.
Mục đích phương pháp là phát hiện và nhân đoạn DNA nhiều lần trong
ống nghiệm.
Thực hiện phương pháp này cần có: phân tử DNA ban đầu, hai đoạn
DNA mồi, mỗi mồi khoảng 20 base, hai phân tử này gắn ở hai đầu phân tử