NGHIÊN cứu mối LIÊN QUAN GIỮA đa HÌNH KIỂU GEN MTHFR c677t với một số BIẾN CHỨNG ở BỆNH NHÂN đái THÁO ĐƯỜNG TYPE 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHẠM HỒNG NGỌC

NGHI£N CøU MèI LI£N QUAN GI÷A §A H×NH
KIÓU GEN MTHFR C677T VíI MéT Sè BIÕN
CHøNG
ë BÖNH NH¢N §¸I TH¸O §¦êNG TYPE 2

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHẠM HỒNG NGỌC

NGHI£N CøU MèI LI£N QUAN GI÷A §A H×NH
KIÓU GEN MTHFR C677T VíI MéT Sè BIÕN
CHøNG
ë BÖNH NH¢N §¸I TH¸O §¦êNG TYPE 2
Chuyên ngành: Sinh lý học

Mã số: 60720106

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1.TS. Nguyễn Huy Bình
2.TS. Nguyễn Thi Thanh Hương

HÀ NỘI - 2016


CÁC TỪ VIẾT TẮT

ĐTĐ

Đái tháo đường

HTKTW

Hệ thần kinh trung ương

Hcy

Homocystein

TK

Thần kinh

MTHFR

Methyl tetrahydrofolate reductase

TBMMN

Tai biến mạch máu não

TALTT

Tăng áp lực thẩm thấu

HCTH

Hội chứng thận hư


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Vị trí và các kiểu đột biến gen MTHFR.........................................13
Bảng 1.2: Bảng tần số đột biến gen MTHFR trên thế giới..............................13
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR.............................................................28
Bảng 2.2: Trình tự chuỗi DNA mồi.................................................................28
Bảng 2.3: Phân độ tăng huyết áp.....................................................................32
Bảng 2.4: Tiêu chuẩn kiểm soát glucose và HbA1c theo IDF 2005................33
Bảng 3.1. Phân bố tuổi của đối tượng nghiên cứu...........................................34
Bảng 3.2. Phân bố giới của đối tượng nghiên cứu..........................................34
Bảng 3.3: Chỉ số vòng bụng, vòng mông, chiều cao, cân nặng.......................34
Bảng 3.4: Chỉ số khối cơ thể BMI...................................................................35
Bảng 3.5 Các yếu tố nguy cơ ĐTĐ.................................................................35
Bảng 3.6 Thời gian mắc ĐTĐ.........................................................................36
Bảng 3.7 Xét nghiệm hóa sinh........................................................................36

Bảng 3.8. Xét nghiệm kiểm soát đường máu..................................................37
Bảng 3.9. Tình trạng rối loạn lipid máu của bệnh nhân nghiên cứu...............37
Bảng 3.10. Xét nghiệm tổng phân tích nước tiểu............................................37
Bảng 3.10. Bảng kết quản siêu âm tim............................................................38
Bảng 3.11 Bảng kết quản siêu âm Doppler động mạch cảnhError! Bookmark
not defined.
Bảng 3.11 Kết quả tách chiết ADN.................................................................38
Bảng 3.12. Kết quả xác định kiểu gen bằng phương pháp ARMS-PCR.........38
Bảng 3.13 Kết quả phân tích kiểu gen MTHFR trên bệnh nhân ĐTĐ............38
Bảng 3.14. Mối liên quan giữa đột biến gen MTHFR với chỉ số nhân trắc học
.........................................................................................................................38


Bảng 3.15. Mối liên quan giữa đột biến gen MTHFR với HA động mạch.....38
Bảng 3.16. Mối liên quan giữa đột biến gen MTHFR với RLMM.................39
Bảng 3.17. Mối liên quan giữa đột biến gen MTHFR với xơ vữa động mạch
chủ...................................................................................................................39
Bảng 3.18. Mối liên quan giữa đột biến gen MTHFR với biến chứng thận....40
Bảng 3.19. Mối liên quan giữa đột biến gen MTHFR với kiểm soát đường
máu..................................................................................................................40


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Vị trí gen MTHFR...........................................................................10
Hình 1.2: Vai trò của MTHFR trong chu trình chuyển hóa acid folic.............12
Hình 1.3: Cơ chế hình thành huyết khối do ảnh hưởng đột biến gen MTHFR
.........................................................................................................................15
Hình 1.4: Minh họa chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR ..................................18
Hình 1.5: Kết quả chụp huỳnh quang sau ARMS - PCR.................................20

Hình 1.6: Kết quả giải trình tự gen..................................................................22
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................25
Hình 2.2: Đột biến MTHFR C677T................................................................29
Hình 2.3: Kết quả giải trình tự gen..................................................................30


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................3
1.1. Đái tháo đường type 2...........................................................................3
1.1.1. Định nghĩa.................................................................................................................3
1.1.2. Sinh lý bệnh đái tháo đường type 2................................................................3
1.1.3. Triệu chứng lâm sàng...........................................................................................3
1.1.4. Triệu chứng cận lâm sàng...................................................................................4
1.1.5 Chẩn đoán xác định ĐTĐ...................................................................................5
1.1.6. Biến chứng.................................................................................................................5
1.1.7. Điều trị.........................................................................................................................8
1.2. Gen MTHFR.........................................................................................9
1.2.1. Tổng quan gen MTHFR......................................................................................9
1.2.2. Vai trò của gen MTHFR....................................................................................10
1.2.3. Đột biến gen MTHFR.........................................................................................12
1.2.4. Mối liên quan đột biến gen MTHFR với các chỉ số lâm sàng và cận
lâm sàng ở bệnh nhân ĐTĐ type 2...............................................................14
1.3. Các phương pháp phân tích đột biến gen MTHFR.............................16
1.3.1. Kỹ thuật PCR............................................................................................................17
1.3.2. Kỹ thuật RFLP-PCR..............................................................................................19
1.3.3. Kỹ thuật ARMS – PCR...................................................................19
1.3.4. Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp..................................................................21
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........23

2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................23
2.1.1. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu.....................................................................23
2.1.2. Quy trình lấy máu.................................................................................................24


2.1.3. Đánh giá biến chứng của đái tháo đường..................................................24
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu......................................................25
2.2.1. Thời gian nghiên cứu..........................................................................................25
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu...........................................................................................25
2.3. Thiết kế nghiên cứu............................................................................25
2.4. Phương tiện nghiên cứu......................................................................25
2.4.1. Trang thiết bị..........................................................................................................26
2.4.2. Hóa chất và sinh phẩm.......................................................................................26
2.5. Các bước tiến hành.............................................................................27
2.5.1. Tách DNA................................................................................................................27
2.5.2. Xác định kiểu gen bằng phương pháp ARMS - PCR...........................27
2.5.3. Phương pháp giải trình tự gen........................................................................29
2.6. Tiêu chuẩn nghiên cứu đánh giá.........................................................30
2.6.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ.............................................................................30
2.6.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán rối loạn lipid máu...................................................31
2.6.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán THA.............................................................................32
2.6.4. Tiêu chuẩn chẩn đoán biến chứng thận......................................................32
2.6.5. Tiêu chuẩn chẩn đoán béo phì........................................................................32
2.6.6. Tiêu chuẩn kiểm soát đường máu.................................................................33
2.7. Đạo đức nghiên cứu............................................................................33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................34
3.1

Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu........................................34

3.2. Kết quả xét nghiệm lâm sàng..............................................................36
3.3. Kết quả xét nghiệm Gen.....................................................................38
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.............................................................................41
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh lý phức tạp do nhiều yếu tố và nhiều gen gây
nên. Theo thông báo của Liên đoàn ĐTĐ quốc tế IDF (International Diabetes
Federation) hiện nay có khoảng 415 triệu người mắc ĐTĐ type 2 và con số này
sẽ tăng lên tới 642 triệu người vào năm 2020, nếu không có hành động can thiệp
kịp thời. IDF cũng ước tính là 183 triệu người không biết rằng họ mắc ĐTĐ [1].
Tại Việt Nam theo điều tra tại một số thành phố lớn thấy tỷ lệ mắc ĐTĐ rất cao
và cũng đang gia tăng nhanh chóng. Năm 1990 điều tra tại Hà Nội, Huế, Thành
phố Hồ Chí Minh tỷ lệ mắc ĐTĐ type 2 tương ứng là 1.2%, 0,96% và 2.52% [2].
Theo thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ trong cả nước là trên 5% (khoảng
4,5 triệu người), tại các thành phố lớn và khu công nghiệp có tỷ lệ từ 7,0 đến
10% [3]. Như vậy chỉ sau 10 năm tỷ lệ ĐTĐ đã gia tăng 300%. Tỷ lệ mắc bệnh
ĐTĐ đang gia tăng nhanh chóng trên toàn thế giới kéo theo những hậu quả
nghiêm trọng về sức khỏe và kinh tế đối với toàn xã hội. ĐTĐ là nguyên nhân
gây tử vong đứng hàng thứ 4 trên thế giới, gây giảm tuổi thọ trung bình từ 5 đến
10 năm, là nguyên nhân hàng đầu gây mù loà và suy thận giai đoạn cuối.
Có rất nhiều nguyên nhân làm gia tăng biến chứng của ĐTĐ đó là: chế độ ăn
uống không hợp lý, ít vận động, không tuân thủ chế độ chăm sóc và điều trị cũng
như dung thuốc không đúng... Ngoài ra còn một yếu tố khác cũng góp phần làm
gia tăng biến chứng trên đó là đột biến gen, trong đó có gen MTHFR C677T.

Gen MTHFR C677T đột biến làm tăng nồng độ homocystein (Hcy) máu do làm
giảm hoạt tính enzyme methyltetrahydrofolat (MTHF), giảm chuyển hóa Hcy
thành methionine. Do đó ức chế phát triển nội mạc, giảm đáp ứng vận mạch,
giảm tác dụng heparin làm gia tăng biến chứng ĐTĐ đặc biệt biến chứng tim


2

mạch. Những người mang đột biến gen MTHFR 677TT ở dạng đồng hợp tử thì
enzyme hoạt động ít hơn 70% so với bình thường còn ở dạng dị hợp tử là 30 –
40% [7], [8]. Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên quan giữa đa
hình kiểu gen MTHFR C677T với biến chứng tim mạch, thận, thần kinh… Ở
Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đề cập đến vấn đề trên, vì vậy chúng tôi tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T
với một số biến chứng tim mạch ở bệnh nhân đái tháo đường type 2” với hai
mục tiêu:
1. Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T ở bệnh nhân ĐTĐ type.
2. Xác định một số liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với một
số biến chứng ở bệnh nhân ĐTĐ type 2.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Đái tháo đường type 2

1.1.1. Định nghĩa
Theo TCYTTG 2002: Đái tháo đường (ĐTĐ) là tình trạng tăng đường máu
mãn tính phối hợp với rối loạn chuyển hoá carbonhydrate, lipid, protein do thiếu
hụt bài tiết insulin hoặc hoạt động kém hiệu quả của insulin hoặc cả 2 [9]
1.1.2. Sinh lý bệnh đái tháo đường type 2
Hiện nay cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ type 2 chưa thực sự rõ ràng. Tuy nhiên
trong ĐTĐ type 2 người ta nhận thấy đặc điểm nổi bật nhất là những rối loạn
không đồng nhất biểu hiện bằng giảm nhạy cảm với insulin ở gan, cơ vân, mô
mỡ và sự suy chức năng tế bào beta.
Như vậy khác với ĐTĐ type 1, ĐTĐ type 2 không liên quan tới cơ chế tự miễn
và hệ thống HLA (human leucocyte antigen). Thay vào đó là tình trạng rối loạn tiết
insulin, kháng insulin ở mô đích, tăng sản xuất đường ở gan và sự tham gia của các
yếu tố cơ địa cũng như môi trường. Ngoài ra trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ type
2 còn liên quan tới sự tương tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường.
1.1.1.3.

Triệu chứng lâm sàng

ĐTĐ type 2 còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin đa số xuất hiện sau tuổi
40 thường ở những người béo phì nhất là ở các nước phát triển. Ở những bệnh
nhân ĐTĐ type 2 thì nồng độ insulin huyết tương bình thường hoặc cao tương
đối, nghĩa là còn khả năng để duy trì đường huyết ổn định. Nồng độ glucagon
huyết tương cao nhưng không ức chế được bằng insulin.


4

Biểu hiện lâm sàng của nhóm triệu chứng này là ăn nhiều, uống nhiều, đái
nhiều và gầy nhiều. Ngoài ra còn có thể gặp da khô, ngứa toàn thân, mờ mắt
thoáng qua.

Đa số bệnh nhân tình cờ phát hiện ĐTĐ khi đi thử máu (75%) và có tới 50%
mắc đái tháo đường 1-5 năm mà không có triệu chứng. Cũng có nhiều trường
hợp bệnh nhân vào viện với các biến chứng nặng nề của đái tháo đường như
nhiễm trùng bàn chân, TBMMN, hôn mê TALTT…
1.1.4. Triệu chứng cận lâm sàng


Đường huyết lúc đói > 126 mg/dl (> 7 mmol/l)



Đường niệu dương tính.



HbA1c: HbA1c < 6.5 %, HbA1c tăng: đường máu kiểm soát không tốt.



Peptid C : bình thường hoặc tăng.



Định lượng insulin máu : bình thường hoặc tăng.



Kháng thể kháng tiểu đảo tụy (ICA, GAD): âm tính



Các XN khác:

 Đo BMI, Mạch, HA.



Soi đáy mắt



Urê, creatinin



ECG, nghiệm pháp gắng sức.



Cholesteron, LDL, HDL, TG.



Siêu âm Doppler mạch máu.


I.4.1.1.5 Chẩn đoán xác định ĐTĐ
Chẩn đoán xác định ĐTĐ khi có một trong các tiêu chuẩn sau (WHO):
 Đường máu huyết tương lúc đói (bệnh nhân nhịn đói ít nhất 8 giờ) ≥
1,26 g/l  7,0 mmol/l (ít nhất 2 lần vào 2 ngày khác nhau).

 Đường máu huyết tương làm bất kỳ thời điểm nào ≥ 2 g/l  11,1
mmol/l kèm theo các triệu chứng của tăng đường huyết.
 Đường huyết 2 giờ sau uống 75 gr Glucose > 11,1 mmol/l.
 HbA1C > 7,0%.
1.1.1.6.

Biến chứng

1.1.6.1. Biến chứng cấp tính
a. Hôn mê do nhiễm toan Ceton

Hôn mê toan ceton là biến chứng cấp tính của ĐTĐ có nguy cơ tử vong
cao. Nguyên nhân chính là do tăng các hoormon gây tăng đường huyết và
thiếu hụt insulin làm giảm sản xuất glucose tại gan, giảm chuyển hóa glucose,
tăng ly giải lipid tăng tổng hợp thể ceton gây toan ceton. Hậu quả cuối cùng
dẫn tới tình trạng lợi tiểu thẩm thấu gây ra tình trang mất nước và điện giải,
toan chuyển hóa.
b. Hôn mê tăng áp lực thẩm thấu

Là biến chứng thường xảy ra ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 do tình trạng đường
máu tăng rất cao kèm theo mất nước do lợi niệu thẩm thấu. Khi ALTT > 320 –
330 mOsm/kg nước sẽ bị kéo ra khỏi các neuron gây ra tình trạng lũ lẫn, hôn
mê.
c. Hôn mê do nhiễm toan acid lactic

Xảy ra ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 lớn tuổi điều trị bằng biguanide, thường có
tổn thương suy tế bào gan, suy thận. Biến chứng này ít gặp trên lâm sàng.
d. Hôn mê hạ đường huyết

Là biến chứng nguy hiểm gặp ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 điều trị bằng

sulfonylureas. Nếu bệnh nhân ĐTĐ có biến chứng thần kinh tự động làm mất
đáp ứng tiết catecholamine che dấu đi các triệu chứng của hạ đường huyết.


1.1.6.2. Các biến chứng mạn tính
a. Biến chứng vi mạch

Cơ chế tổn thương thành các vi mạch, dày màng đáy vi mạch và dễ vỡ
thành mạch, biến đổi trong mạch máu làm tăng kết dính tiểu cầu, tăng độ
nhớt máu.
 Bệnh lý võng mạc ĐTĐ: Nguyên nhân chính gây mù. Gồm hai giai
đoạn: bệnh võng mạc tăng sinh (NPDR: nonproliferative diabetic
retinopathy) và bệnh võng mạc không tăng sinh (PDR: proliferative
diabetic retinopathy)
 Đục thuỷ tinh thể: Do tăng glucose máu làm tăng tạo sorbitol thay đổi
tính thẩm thấu của thủy tinh thể, xơ hóa thủy tinh thể gây đục thủy tinh
thể. Có 2 thể hay gặp là thể dưới vỏ và thể lão hóa.

 Glaucom: Xảy ra ở 6% bệnh nhân ĐTĐ, thường là glaucom góc mở.
glaucom góc đóng ít gặp, gặp trong trường hợp có tân mạch ở mống
mắt.
b. Biến chứng thận

 Bệnh cầu thận ĐTĐ: Nguyên nhân do dày màng đáy mao mạch cầu
thận và lắng đọng glycoprotein ở trung mạc. Có 3 dạng tổn thương cầu
thận đó là xơ hóa ổ hoặc lan tỏa hoặc phối hợp cả hai. Bệnh tiến triển
qua các giai đoạn:
 Giai đoạn đầu, im lặng: tăng mức lọc cầu thận.
 Albumin niệu vi thể: 30 – 300 mg/ngày.
 Albumin niệu đại thể > 500 mg/ngày, có thể kèm theo HCTH.

 Suy thận tiến triển giai đoạn cuối.
c. Các biến chứng thận khác

 Viêm hoại tử đài bể thận: ít gặp. Biểu hiện gồm: sốt, đau thắt lưng, đái
mủ.


 Tổn thương thận mất bù sau khi tiêm thuốc cản quang trong các thủ
thuật như chụp UIV, chụp mạch, chụp – nong ĐM vành có thể gây suy
thận cấp.
d. Bệnh lý mạch máu lớn

Biểu hiện xơ vữa nhiều mạch máu lớn: thiếu máu cơ tim im lặng, NMCT
(50% tử vong), viêm tắc động mạch chi dưới gây hoại tử khô, viêm xương;
tắc mạch bàn chân; cẳng chân, phải cắt cụt chi, TBMMN, tắc mạch thận,
THA, suy thận. XVĐM sớm lan rộng ảnh hưởng đến các mạch máu.
e. Biến chứng thần kinh

Định nghĩa bệnh lý thần kinh ĐTĐ theo ADA 2005: “Sự hiện diện của các
triệu chứng và/hoặc dấu hiệu của rối loạn chức năng thần kinh ngoại biên ở
người ĐTĐ sau khi đã loại trừ các nguyên nhân khác”. Chẩn đoán bệnh lý
thần kinh ĐTĐ là một chẩn đoán loại trừ. Thường phối hợp với bệnh lý võng
mạc, bệnh lý thận tạo thành “tam bệnh” đặc hiệu của ĐTĐ.
f.

Biến chứng xương và khớp



Bệnh lý bàn tay ở người ĐTĐ trẻ tuổi: tay cứng dần do co kéo da ở trên

khớp. Nguyên nhân do biến đổi các collagen và các protein khác ở mô liên
kết.


Gãy Dupuytren: cân ở gan tay dày thành nốt, gây biến dạng như vuốt

thú.


Mất chất khoáng xương.

g. Bàn chân người ĐTĐ

Bệnh lý bàn chân ĐTĐ là biến chứng hay gặp và là nguyên nhân dẫn tới cắt
cụt và tử vong cao ở người ĐTĐ. Trong bệnh lý bàn chân vai trò của biến
chứng TK ngoại vi, bệnh lý mạch máu ngoại vi và nhiễm trùng luôn gắn bó
mật thiết với nhau. Tổn thương bàn chân bắt đầu ở những ngón chân, ô mô bị
mất cảm giác, đặc biệt những nơi ngón bị biến dạng và hoặc thiếu máu.
Những ngón chân dễ bị chấn thương, dễ hình thành cục chai, ổ loét, nhiễm


trùng và hoại thư. Tổn thương TK gây giảm tiết mồ hôi và khô da, làm da
người bệnh dễ nứt nẻ, loét và hoại tử.
h. Các biến chứng nhiễm khuẩn

Biến chứng nhiễm trùng rất hay gặp, bệnh nhân thường mắc các bệnh như:
lao, nhiễm khuẩn tiết niệu dai dẳng và tái phát nhiều lần, viêm thận bể thận
ngược dòng và suy thận. Nhiễm trùng da và niêm mạc: nhọt tụ cầu vàng, viêm
âm hộ, viêm bao qui đầu..., đôi khi chính nhiễm trùng này làm khởi phát ĐTĐ

có sẵn.
i.

Các biến chứng khác

 Tăng HA: Thường phối hợp với ĐTĐ, đôi khi có trước khi ĐTĐ xuất
hiện, hoặc thông thường do bệnh lý cầu thận, xơ vữa; tần suất gặp nhiều
ở ĐTĐ type 2 nhất là béo phì vì có sự tương quan giữa béo phì và THA.
 Biến chứng da: Ngoài tổn thương nhọt nhiễm trùng, ở da còn có những
biểu hiệu sau: viêm teo dạng mỡ biểu hiệu bằng những nốt mà phần
trung tâm teo lại, vùng viền xung quanh tím dần, định vị ở ngón tay hay
chi dưới, dị ứng da do insulin, phì đại mô mỡ hoặc teo mô mỡ.
.1.7. Điều trị
 Chế độ ăn: Thực hiện chế độ ăn hợp lý, cân đối giữa các thành phần
glucid (chiếm 50-60%), protid (chiếm 15-20%), lipid (chiếm 2030%). Nên chọn loại thực phẩm có chỉ số tăng đường huyết thấp
nhiều chất xơ, kiêng đồ ăn ngọt.
 Hoạt động thể lực: Tối thiểu 30 phút 1 ngày, 5 ngày 1 tuần lưu ý tình
trạng đường huyết, huyết áp trước tập. Các loại hình luyện tập như
đi bộ, bơi lội, cầu lông, leo cầu thang,...
 Điều trị insuline: Liều bắt đầu 0,2 UI/kg/ngày. Thường là 0,3 – 0,6
UI/kg/ngày.
 Điều trị bằng thuốc: Các nhóm thuốc điều trị tăng đường huyết bao
gồm nhóm kích thích tụy bài tiết insuline (sulphonylure), nhóm


thuốc làm tăng nhạy cảm insuline ở ngoại vi, giảm đề kháng
insuline (metformin, thiazolidinedione), nhóm ức chế enzym alpha
glucosidase (acarbose), nhóm glinid,....
a. Điều trị yếu tố nguy cơ
Điều trị THA, rối loạn lipid, điều trị các biến chứng,...

1.1.2. Gen MTHFR

1.1.1. Tổng quan gen MTHFR
Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR; EC 1.5.1.20) là một trong
những enzyme quan trọng nhất trong quá trình chuyển hóa folate. Trong chu
trình chuyển hóa folate MTHFR liên quan tới việc chuyển 5,10
methylenetetrahydrofolte

(CH2THF)

thành

5

methyltetrahydorfolate

(CH3THF), con đường này xúc tác việc loại bỏ gốc methyl của homocysteine
để tạo thành methionine. Sau đó, cơ thể sử dụng methionine để tạo ra protein
và các sản phẩm quan trọng khác. Ngoài ra, nó cũng ảnh hưởng tới gốc
methyl của acid nucleic, các hoormon, các chất dẫn truyền thần kinh, cũng
như việc tổng hơp purin và pyrimidine.
MTHFR là phân tử protein có khối lượng phân tử 150 kDa bao gồm 656 aa.
Gen MTHFR nằm trên nhánh ngắn p của NST số 1 (1p36.3). Gen MTHFR
bắt đầu từ cặp base 1944 và kết thúc ở cặp base 27374. Tổng cộng có 25431
cặp base. Nó bao gồm 11 exon và 11 introns [10].
Gen MTHFR còn được biết đến với các tên gọi khác như:
 5, 10 methylenetetrahydrofolate reductase.
 Methylenetetrahydrofolate reductase.
 MTHR_HUMAN.

Hình 1.1: Vị trí gen MTHFR
(Nguồn: />1.1.2. Vai trò của gen MTHFR
MTHFR tham gia vào quá trình chuyển hóa của acid folic, nó xúc tác sự
hình thành của 5 methylentetrahydrofolate từ 5, 10 methylentetrahydrofolate.
Đột biến gen MTHFR sẽ làm giảm hoạt tính của emzyme MTHFR với những
người mang đột biến gen MTHFR C677T ở dạng đồng hợp tử (MTHFR
677TT) thì enzyme hoạt động ít hơn 70% so với bình thường còn ở dạng dị
hợp tử (MTHFR 677CT) là 30 – 40% [11], [12]. Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ
ra rằng đột biến gen MTHFR là yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý như tim
mạch, đột quỵ, tăng huyết áp, tiền sản giật, một rối loạn về mắt như bệnh tăng
nhãn áp, rối loạn tâm thần, và một số loại ung thư. Nguyên nhân được cho là
đột biến gen MTHFR làm thay đổi hoặc giảm hoạt động của men
methylenetetrahydrofolate reductase, dẫn đến sự gia tăng Hcy trong máu. Khi
Hcy máu tăng, Hcy nhanh chóng bị oxy hóa tạo thành hỗn hợp disulfides và
Hcy thiolactone đồng thời sinh ra các gốc oxy hóa superoxide và hydrogen
peroxide, gây tổn thương màng tế bào nội mô gián tiếp thông qua hydrogen
peroxide do làm bộc lộ cấu trúc phía dưới và tế bào cơ trơn, thúc đẩy quá
trình tăng sinh và hoạt hóa tiểu cầu, bạch cầu [13], [14]. Đồng thời khi đó quá
trình tự oxy hóa Hcy tạo ra những dạng oxy gen độc tế bào khác bao gồm gốc
anion superoxide và gốc hydroxyl. Superoxid khởi đầu cho sự oxi hóa lipid,
quá trình này xảy ra ở màng bào tương tế bào nội mô và phân tử lipoprotein
trọng lượng phân tử thấp. Ngoài ra Hcy làm thay đổi quá trình đông máu


thông qua tăng cường hoạt động của yếu tố V, XII và ức chế hoạt động của
protein C, ức chế thrombomodulin, cũng như hoạt tính của heparin sulfat. Tất
cả ảnh hưởng trên tăng cường quá trình hình thành cục máu đông [15], [11],
[12], [16], [17]. Như vậy sự giảm hoạt tính enzyme do đột biến gen MTHFR
ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa acid folic và dẫn tới nhiều tình trạng bệnh

lý. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều yếu tố về di truyền và môi trường tác động vào
bệnh lý nói trên [18], [19], [20].

Hình 1.2: Vai trò của MTHFR trong chu trình chuyển hóa acid folic
(Nguồn: />1.2.3. Đột biến gen MTHFR


Một số người có nồng độ Hcy cao do trong chế độ ăn của họ thiếu vitamin
B12 và acid folic. Nồng độ Hcy cao cũng thấy ở người mắc bệnh thận, suy giảm
hormon tuyến giáp, bệnh vảy nến hoặc dùng một số thuốc như thuốc chống động
kinh hay methotrexate. Ngoài ra cũng khá phổ biến là tình trạng mang gen đột
biến được gọi là MTHFR, đột biến gen này cũng dẫn đến tình trạng tăng Hcy
máu. Có khoảng 50 kiểu đột biến gen MTHFR đã được tìm thấy trong đó hay
gặp kiểu đột biến gen MTHFR C677T và MTHFR A1298C, cả hai đều làm giảm
hoạt tính của MTHFR và dẫn tới tăng Hcy máu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi
chỉ quan tâm tới đột biến gen MTHFR C677T, C (cytosine) biến đổi thành T
(thymine) ở vị trí nucleotid số 677 làm biến đổi valine thành alanine. Từ đó hình
thành nên các kiểu gen 677CC, 677CT và 677TT. Trong đó 677CC là kiểu gen
bình thường, 677CT là kiểu gen dị hợp tử còn 677TT là kiểu gen đồng hợp tử.
Những người mang đột biến gen MTHFR 677TT ở dạng đồng hợp tử thì
enzyme hoạt động ít hơn 70% so với bình thường, còn ở dạng dị hợp tử là 30 –
40% [11], [12].
Bảng 1.1: Vị trí và các kiểu đột biến gen MTHFR
Đột biến
129C→T
IVS2+533G→A
677C→T
1068T→C
IVS6+31T→C
1298A→C

1317T→C
IVS10+262C→G
1793G→A

Bộ ba biến đổi
P39P
n/a(intronic)
A222V
S352S
n/a (intronic)
E429A
F435F
n/a (intronic)
R594Q

Vị trí
Exon 1
Intron 2
Exon 4
Exon 6
Intron 6
Exon 7
Exon 7
Intron 10
Exon 11

Tác giả
Linnebank M et al [21]
Rosenberg N et al [22]
Frosst P et al [23]

Goyette P et al [24]
Goyette P et al [25]
Viel A et al [26]
Weisberg I [27]
Linnebank M et al [21]
Rady PL et al [28]

(Nguồn: />Tần số của alen C677T là thay đổi đáng kể tùy theo từng dân tộc và địa lý.
Tần số cao nhất (> 20%) được tìm thấy ở nhưng người gốc Tây Ban Nha,


Colombia, và Amerindians ở Brazil. Ngược lại, ở quần thể người da đen, ít
hơn 2% có kiểu gen đột biến. Trong số các quần thể da trắng ở châu Âu, Bắc
Mỹ và Úc, tần số dao động từ 8% đến 20% [29].
Bảng 1.2: Bảng tần số đột biến gen MTHFR trên thế giới
n

677CC

Gen
677CT

Pháp
Anh

178
94

Italia

500

n (%)
72(40.0)
45(47.9)
172(34.0

n (%)
85(48.0)
42(44.7)
196(39.0

n (%)
21(11.8)
7(7.4)
132(26.4

587

)
234(40.0

)

Nga

)
312(53.0
)
51(42.2)

57(83.8)
172(41.6

)
53(43.8)
11(16.2)
183(42.2

)
77(59.7)
55(90.2)
24(87.5)

)
42(32.6)
6(9.8)
3(12.5)

Quốc gia

Trung Quốc 121
Indonesia
68
Canada

414

Brazil
Kenya
Gambia

129
61
24

Alen
677TT

677T

Tác giả

(%)
35.7
18.6

Wilcken et al [30]
Scheneider et al [31]

46.0

Wilcken et al [30]

41(7.0)

26.9

Wilcken et al [30]

17(14.0)

0(0.0)

35.9
8.1

Sadewa et al [32]
Sedewaet al [32]

59(14.3)

36.3

Hegele et al [33]

10(7.6)
0(0.0)
0(0.0)

24.0
4.7
6.25

Sadewa et al [32]
Schneider et al [31]
Schneider et al [31]

1.2.4. Mối liên quan đột biến gen MTHFR với các chỉ số lâm sàng và cận
lâm sàng ở bệnh nhân ĐTĐ type 2
Đái tháo đường là bệnh lý phức tạp do nhiều yếu tố và nhiều gen gây nên.
Nó là vấn đề sức khỏe lớn trên toàn thế giới. Bệnh nhân mắc ĐTĐ tăng nguy

cơ tim mạch từ 2 -6 lần so với bệnh nhân không mắc ĐTĐ.
MTHFR tham gia vào quá trình chuyển hóa của acid folic, nó xúc tác sự
hình thành của 5 methylentetrahydrofolate từ 5,10 methylentetrahydrofolat.
Do đó, khi gen MTHFR bị đột biến sẽ làm tăng nồng độ Hcy trong huyết
tương bệnh nhân. Từ đó:


 Thúc đẩy tăng sinh tế bào cơ trơn mạch máu, ức chế phát triển tế bào nội
mạc.
 Rối loạn chức năng mạch máu do giảm đáp ứng vận mạch cũng như
giảm đáp ứng của thrombomodulin ở động mạch chủ.
 Ức chế tác dụng của Heparin, ức chế phóng thích NO và Prostacyclin,
gia tăng tổng hợp Fibrinogen, gia tăng sự hoạt hóa yếu tố X, V và kéo
dài quá trình sống của tiểu cầu

Tổn thương
thành động
mạch

Tế bào
miễn dịch

Tổn thương tế
bào nội mạc

Vết thương

Hình 1.3: Cơ chế hình thành huyết khối do ảnh hưởng đột biến gen MTHFR
(Nguồn: />Nghiên cứu của Laura Di Renzo tiến hành trên 44 phụ nữ Italia năm 2013
đã chỉ ra mối liên quan giữa chỉ số khối cơ thể (BMI) với đột biến gen

MTHFR. Nghiên cứu cũng đề cập tới mối liên quan giữa đột biến gen
MTHFR với các chỉ số, HA tâm thu, HA tâm trương, glucose, HbA1C,
cholesterol, L-DLC và triglyceride. Đồng thời, nghiên cứu này cũng chỉ ra
rằng những người có đột biến gen MTHFR C677T có chỉ số BMI, vòng bụng,
vòng mông, vòng cổ chân cao hơn so với người không mang đột biến [34].


Trong nghiên cứu của mình, Boyi Yang và cộng sự đã kết luận có mối liên
quan chặt chẽ giữa đột biến gen MTHFR C677T với tình trạng cao huyết áp
(OR = 1.86, 95%CI = 1,22 – 2,82), cũng như tăng TG ( OR = 1,61, 95%CI =
1,06 – 2,46) [35]. Cùng quan điểm đó, Nevin llhan chỉ ra mối liên quan giữa
đột biến gen MTHFR với THA và bệnh lý về tim mạch [36].
R. F. Franco khi nghiên cứu trên 337 đối tượng trong đó có 186 nam và 151
nữ đã kết luận rằng đột biến gen MTHFR làm gia tăng yếu tố nguy cơ của xơ
vữa mạch và huyết khối tĩnh mạch [37].
Theo Santosh Kumar Gupta khi nghiên cứu trên 199 đối tượng dưới 45 tuổi
sống tại New Delhi từ năm 2005 đến năm 2008 chỉ ra rằng đột biến gen
MTHFR C677T làm tăng các chỉ số cholesterol, LDL – C, triglycerid hơn so
với nhóm không có đột biến (95 %CI = 1,27 – 2,94) [38]. Còn theo Frosst P
và cộng sự thì đột biến gen MTHFR là yếu tố nguy cơ quan trọng của bệnh lý
mạch máu [39].
Khi nghiên cứu trên 156 bệnh nhân đái tháo đường type II, Makiko Maeda đã
chỉ ra tần số đột biến C677T là 40% đồng thời cũng xác định mối liên quan giữa đột
biên gen MTHFR C677T với các chỉ số lâm sàng và cận lâm sàng như tuổi, giới,
BMI, HbA1C, G máu, HDL-C, LDL-C, cholesterol, triglycerid, và creatinin. Ngoài
ra ông còn nhận thấy rằng tỷ lệ đột biến gen 677T/677T ở bệnh nhân có biến chứng
võng mạc do đái tháo đường cao hơn các kiểu gen còn lại [40].
Nghiên cứu của Vlad Shpichinetsky kết luận rằng đột biến gen MTHFR có mối
liên quan với sự phát triển của bênh thận ở bệnh nhân đái tháo đường [41].
1.1.3. Các phương pháp phân tích đột biến gen MTHFR

Với sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật để xác
định kiểu gen. Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu như kỹ
thuật ARMS-PCR (Amplification refractory mutation system- PCR: Hệ thống
khuếch đại đột biến chịu nhiệt), ASP-PCR (Allelen Specific-PCR: phản ứng


khuếch đại chuỗi đặc hiệu alen), Real-Time multiplex PCR, Sequencing (giải trình
tự gen trực tiếp). Trong đó, ARMS-PCR là phương pháp có độ nhạy cao, kỹ thuật
đơn giản và giá thành rẻ, được áp dụng rộng rãi trong các labo sinh học phân tử ở
Việt Nam. Bởi vậy, trong phạm vi của đề tài tôi xin trình bày những nét chính của
kỹ thuật ARMS-PCR, là kỹ thuật liên quan đến việc xác định kiểu gen MTHFR
trong nghiên cứu này. Sau đó kiểm tra ngẫu nhiên một số mẫu bằng phương pháp
giải trình tự gen. Về cơ bản, kỹ thuật ARMS-PCR được tiến hành dựa trên cơ sở
khuếch đại đoạn gen nghi ngờ mang đột biến bằng kỹ thuật PCR.
1.3.1. Kỹ thuật PCR
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của
DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase. Với
nguyên liệu là bốn loại nucleotid, enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi hỏi sự có mặt của những mồi
xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba
bước:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch
phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA
được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,
thường là 94oC - 95oC trong vòng 30-60 giây.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho
phép các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 oC-70oC tuỳ thuộc Tm
của các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây.

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq
polymerase, Tth polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ


thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây
đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
để làm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo.
Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng
khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được
xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi.

Hình 1.4: Minh họa chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR
(Nguồn: />Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA
ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ. Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi
lượng mẫu của lần trước. Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đã nhân bản
được thành 2n bản sao. Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách ra khi điện di,
phát hiện được sau khi nhuộm và để tạo dòng hoặc giải trình tự. Trong quá trình
thực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng nhưng lượng
mồi và dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate) tự do giảm, enzym DNA
polymerase hoạt động yếu dần. Do đó, cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP và
enzym để đảm bảo phản ứng PCR cho kết quả tốt nhất [42].