PHÂN LẬP VÀ NHÂN DIỆN VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS TRONG MẪU THỰC PHẨM THỊT HEO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
BỘ MÔN VI SINH VẬT THỰC PHẨM

BÀI
BÁO
CÁO
Chủ Đề: Phân
lập và nhận diện vi
khuẩn Staphylococcus aureus
trong mẫu thực phẩm

Nha Trang, ngày 13 tháng 5 năm 20


Mục lục
LỜI MỞ ĐẦU.......................................................................................................................................................2
I.

TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS................................................................3

II.

PHÂN LẬP VI SINH VẬT:..........................................................................................................................4

1.
A.
B.
2.
A.
B.

CHỌN MẪU THỰC PHẨM PHÂN LẬP, VÀ TĂNG SINH VI SINH VẬT...................................................................4
MẪU THỰC PHẨM ĐỂ PHÂN LẬP: THỊT HEO......................................................................................................4
TĂNG SINH VI SINH VẬT:..................................................................................................................................4
PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP....................................................................................4
MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP:..................................................................................................................................4
PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP:................................................................................................................................5

III.
1.
2.
3.
4.

NHẬN DIỆN VSV:......................................................................................................................................7
ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, CẤU TRÚC:...................................................................................................................7
ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN........................................................................................................8
PHÂN BỐ:...........................................................................................................................................................8
ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA:........................................................................................................................................9

IV. Ý NGHĨA SỰ HIỆN DIỆN CỦA STAPHYLOCOCCUS AREUS TRONG MẪU THỰC PHẨM THỊT
HEO 9


LỜI MỞ ĐẦU
Trong xã hội hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm ở trên thế giới và Việt Nam là
rất cao. Tình trạng này chưa có dấu hiệu dừng lại và càng ngày càng tăng. Qua kiểm tra
cho thấy hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm này là do vi sinh vật gây ra. Đây là điều đã
được cảnh báo và đã có cách thức phòng ngừa nhưng vẫn xảy ra các vụ ngộ độc tập thể
gây nguy hiểm và có thể dẫn đến tử vong.
Các vụ ngộ độc thực phẩm có rất nhiều nguyên nhân như do: hóa chất, bản chất

thực phẩm chứa sẵn một số chất độc,… Nhưng quan trọng hơn hết vẫn là từ vi sinh vật,
hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm thường là do Salmonella, E.coli, Staphylococcus
aureus và một số loài khác gây ra. Đặc biệt Staphylococcus aureus - một trong những
nguyên nhân chính gây ngộ độc cao nhất.
Điều đáng lưu ý và quan tâm ở đây là chủng này có khả năng tiết ra một số độc tố
bền với nhiệt và khó bị phân hủy ở nhiệt độ cao. Hơn nữa, chúng lại có khả năng kháng
methiciline, penicilline khi gặp điều kiện thuận lợi còn có thể lây lan và gây nên những
căn bệnh nguy hiểm.
Chính vì vậy mà nhóm chúng em xin báo cáo về đề tài: “Phân lập và nhận diện vi
khuẩn Staphylococus aureus trong mẫu thực phẩm”.



I.

Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) thuộc giống Staphylococcus, do đó mang
những tính chất chung của Staphylococcus. S. aureus là những vi khuẩn hình cầu, không
di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, có thể đứng riêng lẻ từng đôi, từng chuỗi
ngắn hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho,chúng thường cư trú trên da của
người và động vật máu nóng. Staphylococcus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy
tiện, có cả sự trao đổi chất, hô hấp và lên men.
Phân loại: chia làm 3 nhóm:
- (+) với Coagullase: enzym đặc hiệu của chủng Staphylococus aureus.
- (-) với Coagullase nhạy kháng sinh Nabovicine.
- (-) với Coagullase kháng kháng sinh Nabovicine.
II.

Phân lập vi sinh vật:

1.

Chọn mẫu thực phẩm phân lập, và tăng sinh vi sinh vật.

a.

Mẫu thực phẩm để phân lập: thịt heo


b.

Tăng sinh vi sinh vật:

Cân chính xác 25g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 225ml môi trường
SPW(pepton water), buộc kín và đồng nhất mẫu bằng tay trong vòng 10 phút, sau đó ủ
tăng sinh.
2.

Phương pháp phân lập và môi trường phân lập.

a.

Môi trường phân lập:

-

Môi trường thạch máu (Blood agar): các thành phần cơ bản của môi trường

được hòa tan trong nước và đun cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Khử trùng ở nhiệt độ

121oC trong 15`. Làm nguội môi trường đến 45-50oC. thêm 5% máu cừu hoặc bê con đã
được loại bỏ các sợi huyết hoặc thêm chất chống đông là citrate. Hòa tan máu vào môi
trường và phân phố vào đĩa petri. Môi trường phải pha chế trước 2 ngày để kiểm tra khả
năng bị nhiễm. Môi trường không nên đổ quá dày để quan sát các vòng tan máu.
-

Môi trường Baird Parker Agar (BP): sau khi pha chế đầy đủ các thành phần

của môi trường, đem khử trùng ở 121 oC trong 15` và làm nguội đến 50 oC. Sau đó bổ
sung egg yolk vào môi trường.
-

Môi trường TSA

b.

Phương pháp phân lập:
Pha mẫu

Mẫu sau khi được ủ tăng sinh,lấy ra pha loãng mẫu:chuẩn bị dãy pha loãng mẫu
thích hợp tùy theo mức nhiễm của mẫu, sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa
thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa.
Phân lập trên môi trường chọn lọc:
-

Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird

Parker.Dùng que cấy tam giác thủy tinh ( thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt
môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho
mỗi loại pha loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37

± 1oC trong24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường
thạch máu.
-

Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có

đường kính 0,5 – 1 mm, lồi , đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh.
-

Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp

tục ủ 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu
đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn
lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc
như trên. Cần đếm và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc.
-

Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S. aureus cho khuẩn lạc bóng

loáng, đục, lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2µm. Hầu hết S.
aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này.

Hình 1: khuẩn lạc s. aureus đặc trưng trên mt BP


Khẳng định:

-

Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc

trưng từ môi rường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 1oC trong 24 giờ.
-

Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết

tương đã rã đông, ủ ở 37 ± 1oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các
khoảng thời gian 2,4,6,8 và 24 giờ.
-

Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng.

Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu.
-

Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi

mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối
đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.

Hình 2: kết quả thủ nghiệm coagulase


Kết quả:

Mật độ S. aureus trong mẫu thực phẩm được tính như sau:
10(NtHt + NaHa)

Mật độ(CFU/g hay CFU/ml) =
F1 + F2


Trong đó:


F: là độ pha loãng



Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng



Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng



Ht: tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so

vớikhuẩn lạc đặc trưng
Ha: tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+)



sovới số khuẩn lạc không đặc trưng
III.

Nhận diện vsv:

1.

Đặc điểm hình thái, cấu trúc:

Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính chất
chung của Staphylococcus. S.aureus là những vi khuẩn hình cầu, không di động, gram
dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho, không di động, là
những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện.

2.

Đ
ặ

điểm sinh trưởng và phát
Hình 3: hình thái S. aureus
triển

c

Hình 4: Tụ cầu Staphylococcus aureus gram
dương dưới kính hiển vi

-

Nhiệt độ tăng trưởng 7-48 độ C và nhiệt độ tối ưu 37 độ C.

-

Enterotoxin được sản xuất ra tối ưu ở 35-40 độ C.

-

Tăng trưởng tối ưu ở pH từ 6-7 pH tối thiểu là 4 và tối đa là 9.8-10.


-

Nó tăng trưởng dễ dàng trong các môi trường có 5-7% NaCl và một vài

chủng có khả năng tăng trưởng ở môi trường lên đến 20% NaCl.
-

Staphylococus aureus bền vững khi ở nồng độ đường cao, tuy nhiên sẽ bị

ức chế ở nồng độ đường 60%, có khả năng bám dính tốt.
3.

Phân bố:

-

S. aureus cư trú trên người và động vật, có trong sữa bò bị bệnh, thịt heo

tươi, trong đất, vết thương sưng mũ.
-

Đầu tiên phát triển với số lượng thấp, sau đó phát triển lên số lượng lớn nếu

không có các bước gia nhiệt hợp lý để phá hủy chúng hòan toàn.
-

Dễ dàng phát triển ở các sản phẩm không qua xử lý nhiệt, các sản phẩm làm

bằng tay và các sản phẩm làm lạnh không hợp lý.
-

Nguổn thực phẩm gây bệnh chủ yếu: thịt heo, bánh mì, trứng, thịt bò,thịt gà

4.

Đặc điểm sinh hóa:

-

Phát triển tôt ở môi trường tổng hợp, đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc

tây….

huyết thanh, sinh betahemolysin trong môi trường thạch máu.
-

Phản ứng indol, NH3, thủy phân gelatine, đông huyết tương.

-

Trên môi trường thạch khuẩn lạc có hình tròn trơn bóng, đục mờ.

-

Trên môi trường lỏng tế bào ở dạng cặn, vòng dãn mờ trong ống nghiệm ở

bề mặt môi trường.
-

Tụ cầu có hệ thống enyme phong phú, những enzyme được chuẩn đoán là:


Coagulase có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi

đã được chống đông. Đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu vàng với các
tụ cầu khác.


Coagulase có hai loại: một loại tiết ra môi trường(coagulase tự do),

một loại bám vào vách tế bào(coagulase cố định).




Catalase dương tính: enzyme này thủy phân H2O2, catalase có ở tất

cả các tụ cầu mà không có ở liên cầu.

IV.



Lên men đường mannitol.



Desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA.

Ý nghĩa sự hiện diện của Staphylococcus areus trong mẫu thực phẩm

thịt heo
Khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus cũng rất lớn do chúng
phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố. Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào chủ yếu
qua con đường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người. Sự hiện diện với
mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của quá trình chế
biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. Tuy nhiên, điều đó
không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy ra khi S.
aureus được phân lập tạo độc tố. Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ S. aureus tạo độc tố
cũng có thể gây ngộ độc.


Staphylococcus aureus gây 2 hội chứng là nhiễm trùng và nhiễm độc:


Hội chứng nhiễm độc: do tác dụng của một hay nhiều độc tố vi

khuẩn mà có khi không cần có sự hiện diện của vi khuẩn. Các biểu hiện nhiễm độc bao
gồm: hội chứng shock do độc tố( TSST: Toxic Shock Syndrome Toxin), hội chứng tróc
da do tụ cầu hay ngộ độc thức ăn do tụ cầu. Quá trình nhiễm độc:
Xâm nhập Sinh độc tố Hấp thụ độc tố Lây nhiễm


Hội chứng nhiễm trùng: các biểu hiện nhiễm trùng là do vi khuẩn

tăng sinh, xâm nhập hay phá hủy các mô của ký chủ, gây ra đá ứng viêm tại chỗ hoặc
toàn thân. Chúng sản xuất ra các yếu tố độc lực giúp vi khuẩn có thể tồn tại và phát triển
trong cơ thể ký chủ.


Các yếu tố độc lực của Staphylococus aureus:


Protein bề mặt: thúc đẩy quá trình gắn kết vào tế bào vật chủ




Yếu tố xâm lấn: giúp tế bào vận chuyển xâm lấn vào các tổ chức mô

của tế bào vật chủ, có khả năng phân hủy cấu trúc màng tế bào.


Độc tố đường ruột của chủng Staphylococus: Staphylococial

enterotoxin – bền với nhiệt độ (không phân hủy bằng cách gia nhiệt).
Việc ngộ độc của chủng này gây ra chỉ được xét khi có khả năng tạo độc tố, phụ
thuộc vào nồng độ cà hoạt lực (nồng độ cao, hoạt lực thấp thì không có khả năng ngộ
độc và ngược lại ).