Luận văn sư phạm Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh CELLULASE của một số chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất ở Vĩnh Phúc

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (764.37 KB, 47 trang )

TR

NG

A H C S PH M HÀ N I 2
KHOA SINH-KTNN


TR N TH LY

NGHIÊN C U

C I M SINH H C VÀ KH

N NG SINH CELLULASE C A M T S
CH NG X KHU N PHÂN L P
T

CT

T NH V NH PHÚC

KHOÁ LU N T T NGHI P

IH C

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH H C

Ng

ih

ng d n khoa h c

Ths. Nguy n Kh c Thanh

HƠ N i, tháng 5 n m 2010

L IC M N
Em xin bƠy t lòng bi t n sơu s c t i Ths. Nguy n Kh c Thanh
đã t n tình ch b o, h

ng d n em trong su t quá trình h c t p vƠ th c

hi n đ tƠi.
Em c ng xin chơn thƠnh c m n toƠn th các th y cô trong t vi
sinh đã ch b o vƠ giúp đ , đ em có th hoƠn thƠnh đ

c khóa lu n

t t nghi p nƠy.
Em xin chơn thƠnh c m n ban ch nhi m khoa Sinh- KTNN, ban
giám hi u nhƠ tr
đ

ng đã t o đi u ki n t t nh t đ em có th hoƠn thƠnh

c khóa lu n t t nghi p nƠy.
Cu i cùng em c m n gia đình vƠ b n bè đã đ ng viên giúp đ

em trong su t th i gian qua.
Em xin chơn thƠnh c m n!
Xuân Hòa , tháng 05 n m 2010
Sinh viên
Tr n Th Ly

L I CAM OAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên c u c a riêng tôi. Các k t
qu nghiên c u, s li u đ

c trình bày trong khóa lu n là hoàn toàn trung

th c và không trùng v i k t qu c a tác gi khác.
Tác gi
Tr n Th Ly

CÁC T

VI T T T

VSV

: Vi sinh v t

ISP

: International Steptomyces Project

CFU

: Colony Forming Unit

HSKS

: H s i khí sinh

HSCC

: H s i c ch t

DANH M C B NG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LU N
B NG
B ng
3.1

Tên b ng

Trang
ct đ t

22

ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase c a
các ch ng x khu n nghiên c u.

27

ng c a ngu n cacbon t nhiên đ n ho t tính

32

Các ch ng x khu n sinh cellulase phân l p đ
t nh V nh Phúc.

3.2
3.3

nh h
nh h

cellulase c a các ch ng x khu n nghiên c u.
3.4

nh h

ng c a ngu n nit đ n kh n ng sinh tr

ng và

33

ho t tính cenlulase c a các ch ng x khu n nghiên c u.

3.5

nh h

ng c a pH đ n kh ho t tính cellulase c a các
ch ng x khu n nghiên c u

34

HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

3.1

M t s hình nh v x khu n

24

3.2

Hình nh khu n l c và cu ng sinh bào t c a các ch ng

26

x khu n nghiên c u
3.3

nh h

ng c a th i gian nuôi c y đ n ho t tính cellulase

29

c a ch ng M10
3.4

Ho t tính cellulase c a các ch ng x khu n sinh tr
trong môi tr

ng

33

ng cacbon t nhiên

BI U
Bi u đ
1

Tên bi u đ
nh h

ng c a th i gian đ n kh n ng sinh cellulase

Trang
28

c a các ch ng x khu n nghiên c u
2

3

nh h
nh h

ng c a ngu n nit đ n ho t tính cellulase c a
các ch ng x khu n nghiên c u.

35

ng c a n ng đ pH đ n ho t tính cellulase

36

c a các ch ng x khu n nghiên c u.

M CL C
Ph n m đ u……………………………………………........................1
Ch

ng 1. T ng quan tƠi li u……………………………………………...4

1.1.

c đi m và phân lo i x khu n……………………………...…...…....4

1.1.1. M t s ph

ng pháp trong phân lo i x khu n………………..….….5

1.1.2. Vai trò c a x khu n……………………………………………...…..7
1.2. Nhu c u dinh d

ng c a x khu n……………………………………...8

1.2.1. Nhu c u cacbon...……………………………………………………..9
1.2.2. Nhu c u nit ...………………………………………………………..9
1.2.3. Nhu c u vitamin và khoáng…………………….............…………....10
1.3. Các y u t

nh h

ng đ n đ i s ng c a x khu n…………………….10

1.4. Cellulase và cellulose…………...……………………………………..12
1.4.1. Cellulose..……………………………………………………….…..13
1.4.1. Cellulase..……………………………………………………….…..14
1.5. Tri n v ng, ng d ng c a cellulase……………………..…………….14
Ch

ng 2. V t li u vƠ ph

ng pháp nghiên c u………………………..17

2.1. V t li u………………………………...………………………………17
2.1.1. Nguyên li u…………………………..……………………………..17
2.1.2. Hóa ch t…………………………………..…………………………17
2.1.3. D ng c và thi t b ……………………..…………………………...17
2.1.4. Môi tr

ng phân l p x khu n……………………..……………….17

2.1.5. Môi tr
2.2. Ph

ng th ho t tính cellulase c a x khu n……………………19

ng pháp nghiên c u……………………..……………………….20

2.2.1. Ph

ng pháp l y m u………..………………..…………………….20

2.2.2. Ph

ng pháp phân l p x khu n t m u đ t…….....…..…………...20

2.2.3. Ph

ng pháp b o qu n gi ng…………….………………………….21

2.2.4. Ph

ng pháp xác đ nh kh n ng sinh cellulase c a x khu n…..…..21

Ch

ng 3. K t qu vƠ th o lu n…………………………………………22

3.1. Phân l p, tuy n ch n x khu n sinh cellulase t đ t……………….....22
3.2.

c đi m hình thái c a các ch ng x khu n nghiên c u…………..…25

3.3. Nghiên c u nh h

ng c a các các y u t môi tr

ng và đi u ki n nuôi

c y đ n ho t tính cellulase c a m t s ch ng x khu n ………….……….27
3.3.1. nh h

ng c a th i gian nuôi c y…………………………..……...27

3.3.2. nh h

ng c a ngu n cacbon…………………..…………………..31

3.3.3. nh h

ng c a ngu n nit ……………………..…………………...34

3.3.4. nh h

ng c a pH………………………..………………………...35

K t lu n vƠ đ ngh ………………………………………………………..37

TƠi li u tham kh o………………………………………………………...38

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

M

U

Cellulose là lo i h p ch t h u c d i dào trong t nhiên, chi m t i 4050 % hydratcacbon. Cellulose là thành ph n ch y u t o lên b khung x
t bào th c v t. Trung bình m i n m
đ

ng

c tính có kho ng 30 t t n ch t h u c

c cây sinh t ng h p trên trái đ t trong đó có 30 % là thành t bào th c v t,

thành ph n ch y u c a thành t bào th c v t là cellulose. Hàng n m trái đ t
ph i nh n v m t l ng ch t th i kh ng l (ch t th i sinh ho t, ch t th i th c
v t nh lá, cành …ch t th i công nghi p).

phân gi i l ng l n cellulose

này khu h vi sinh v t (VSV) trong đ t đóng vai trò không nh . Mu n làm
đ

c đi u đó các vi sinh v t ph i s n sinh ra cellulase, enzyme cellulase này

đóng vai trò phân gi i cellulose.
Trong đ t có r t nhi u loài VSV có kh n ng sinh t ng h p cellulase,
x khu n là m t trong nh ng loài y. X khu n đóng vai trò quan tr ng trong
quá trình hình thành đ t, quá trình mùn hóa, tham gia vào vòng tu n hoàn
chuy n hóa các h p ch t h u c .
M c dù x khu n không có kh n ng sinh tr

ng nhanh b ng n m m c

tuy nhiên ho t tính cellulase c a x khu n m nh h n r t nhi u, bên c nh đó x
khu n có kh n ng thích ng t t v i môi tr
tr

ng không khí. N u n m m c c n đi u ki n đ

tri n thì x khu n sinh tr

ng ngay

đi u ki n đ

các nghiên c u cho th y r ng trong môi tr
tr

ng đ t, n

ng kém h n r t nhi u so v i môi tr

c và ngay c môi

m cao m i có th phát
m th p, nh ng m c dù v y

ng đ

ng l ng,

m th p x khu n sinh
m t s loài ho t tính

enzyme còn kém đi.
Ngày nay v i s phát tri n c a công ngh sinh h c, ngày càng nhi u
enzyme đ

c ng d ng trong đ i s ng nh : proteinase ng d ng trong công

nghi p ch bi n s a, amylase trong công nghi p r

TrÇn ThÞ Ly

1

u, cellulase ng d ng

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

trong s n xu t gi y, công nghi p may, s i, s n xu t th c n cho gia súc, x lý
ch t th i nông nghi p, s n xu t các lo i đ

ng probiotin…

Nh v y cellulase và x khu n đ u có vai trò quan tr ng trong đ i s ng
con ng

ó c ng là lý do tôi ch n và nghiên c u đ tài: “Nghiên c u đ c

i.

đi m sinh h c và kh n ng sinh cellulase c a m t s ch ng x khu n phân l p
đ

ct đ t

t nh V nh Phúc” nh m hi u rõ h n v kh n ng sinh cellulase

c a m t s ch ng x khu n, các y u t môi tr
h

ng và đi u ki n nuôi c y nh

ng nh th nào đ n kh n ng sinh cellulase và ho t tính cellulase t đó

đ a ra h

ng phù h p nh m thu đ

ch ng x khu n đ

c s n l ng cellulase cao nh t t các

c ch n, ph c v cho các ng d ng ti p theo.

1. M c tiêu đ tƠi
Phân l p, tuy n ch n các ch ng x khu n có ho t tính cellulase cao t
đ t

t nh v nh phúc
Nghiên c u nh h

ng c a các y u t môi tr

ng và đi u ki n (th i

gian, pH, ngu n cacbon, ngu n nit ) đ n ho t tính cellulase c a các ch ng x
khu n.
2. N i dung c a đ tƠi
- Phân l p, tuy n ch n x khu n có ho t tính cellulase cao t đ t t i
Xuân Hòa – Phúc Yên – V nh Phúc.
- Nghiên c u đ c đi m hình thái c a m t s ch ng x khu n có ho t
tính cellulase cao.
- Nghiên c u nh h

ng c a các y u t môi tr

c y đ n ho t tính cellulase c a các ch ng x khu n đ

TrÇn ThÞ Ly

+ nh h

ng c a th i gian

+ nh h

ng c a ngu n cacbon
2

ng và đi u ki n nuôi
c ch n.

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

+ nh h

ng c a ngu n nit

+ nh h

ng c a pH

3. Ý ngh a c a đ tƠi
tài góp ph n đem l i cho con ng

i nh ng hi u bi t v đ i s ng t

nhiên c a VSV nói chung và c a x khu n nói riêng, t o c s khoa h c cho
các ph

ng th c canh tác (cày x i, c i t o đ t, bón phân…) theo h

d ng VSV phân gi i cellulose, t ng c
h u c đ làm giàu dinh d

ng l i

ng các quá trình phân gi i h p ch t

ng cho đ t, t ng n ng su t cây tr ng.

Tuy n ch n m t s ch ng x khu n có ho t tính cellulase cao ng d ng
các ch ng x khu n này vào đ i s ng ( ng d ng trong ch n nuôi, b o v môi
tr

ng…).
Vi c nghiên c u các y u t môi tr

vào tìm ra môi tr
hóa môi tr

th

ng và đi u ki n nuôi c y góp ph n

ng thích h p nh t cho x khu n phát tri n. T đó t i u

ng, ng d ng s n xu t m t l ng l n cellulase trên quy mô

ng m i.

TrÇn ThÞ Ly

3

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

CH
1.1.

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

NG 1: T NG QUAN TÀI LI U

c đi m vƠ phơn lo i x khu n
Krainki l n đ u tiên đ ra các ch tiêu m i trong vi c phân bi t các loài

khác nhau và đã s b phân lo i 17 ch ng thu c chi Actinomyces. Ông coi các

đ c đi m sinh lý, sinh hóa là m u ch t trong nguyên t c phân lo i x khu n [8].
Waksman và Curtis tìm ra 17 lo i, Jensen tìm ra hai lo i m i, Dutche
tìm ra 13 lo i m i [8]
Baldaci và c ng s đã nghiên c u x khu n đ a ra khóa phân lo i chi
Streptomyces d a trên h s i khí sinh (HSKS), h s i c ch t (HSCC) và m t
s đ c đi m trung gian khác [8].
Waksman và Henrici đã đ a ra h th ng phân lo i và đ 1961 đ
s a đ i l i. Trong h th ng phân lo i này x khu n đ

c

c x p thành 3 nhóm

g m 3 h , 10 chi và đã mô t h n 250 loài thu c Streptomyces [8].
Krassilnicov công b h th ng phân lo i n m tia m i d a trên h th ng
đã công b n m 1949, trong đó x khu n đ

c chia thành 6 h v i 26 chi [8].

Gause và c ng s đã công b h th ng phân lo i m i d a trên màu s c
HSKS, và HSCC, hình d ng bào t và chu i bào t , h th ng này đ

c h nh lí

và tái b n 1983 [8].
Nh ng n m g n đây các h th ng phân lo i này ngày càng nhi u, đ
th ng nh t trong cách mô t , ISP đã nêu ra các ph

ng pháp và môi tr

ng

mô t [8].
1.1.1. M t s ph

ng pháp trong phơn lo i x khu n

Nh vào s phát tri n c a khoa h c k thu t s l ng x khu n đ

c

miêu t ngày càng nhi u và chính xác d a trên c s phát tri n sinh h c phân

TrÇn ThÞ Ly

4

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

t , hóa sinh h c, lí sinh h c.

phân lo i nhanh chóng và chính xác ng

i ta

s d ng phân lo i s , nghiên c u các ch ng lo i phát sinh. Tuy nhiên hi n nay
trong th c nghi m ng

i ta v n ch y u d a vào đ c đi m hình thái, tính ch t

nuôi c y, đ c đi m sinh lí - sinh hóa, mi n d ch và sinh h c phân t .
Hi n nay có r t nhi u khóa phân lo i x khu n nh ng có th g p vào 2
h th ng sau đây:
+ H th ng phân lo i ch y u d a vào đ c đi m hình thái đ phân lo i
các nhóm l n h , gi ng. Các phân lo i th p h n nh loài thì dùng đ c đi m
nuôi c y, sinh lí, sinh hóa đ phân lo i.
+ H th ng phân lo i d a vào đ c đi m sinh lý nh màu s c h s i đ
phân nhóm, sau đó dùng đ c đi m nuôi c y đ phân lo i đ n loài, nhóm h
th ng này c a Waksman, Gause Flaig... các tác gi đ u th ng nh t l y đ c
đi m s d ng ngu n nit , cacbon làm y u t b sung cho phân lo i đ n loài.
Phơn lo i x khu n d a vƠo đ c đi m hình thái vƠ tính ch t nuôi c y
D a vào đ c đi m hình thái ng

i ta chia x khu n thành 4 nhóm chính.

Nhóm 1: G m các x khu n mang bào t rõ r t, sinh s n b ng bào t và
phân hóa thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: G m các x khu n có bào t nang, h s i phân chia theo
h

ng vuông góc v i nhau t o thành các c u trúc t

ng t nang bào t .

Nhóm 3: G m các x khu n có d ng Nocardia, sinh s n b ng phân đ t

h s i.
Nhóm 4: G m các x khu n có d ng Corynebacter và d ng c u, t bào
có hình ch V,T th

ng không có h s i.

D a vào nghiên c u các x khu n trên các môi tr
ng

ng khác nhau,

i ta chia d ng chu i bào t x khu n thành 6 ki u chính.

TrÇn ThÞ Ly

5

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

+ Ki u S: Type Spiria (chu i bào t xo n).
+ Ki u SRA: Type Spiria-Rectinaculum-Apertum (chu i bào t

có

xu n, móc câu, xo n không hoàn toàn)

+ Ki u SRF: Type Spiria-Rectus-Flexibilis (chu i bào t xo n, cong
đ n th ng).
+ Ki u RA: Type Rectinaculum- Apertum (chu i bào t móc, có khóa)
+ Ki u RA-RF: Type Rectinaculum Apertum- Rectus Fleixbilis (chu i
bào t d ng móc hay xo n không hoàn toàn.)
+ Ki u RF: Rectus-Fleixbilis (chu i bào t th ng đ n l n sóng)
Hóa phơn lo i
D a vào các d li u v đ nh tính đ nh l ng các thành ph n hóa h c
trong thành ph n hóa h c trong t bào VSV đ phân lo i ch y u là các đ c
đi m sau:
+ Type thành t bào
+ Type peptidoglucan
+ Axit mycolic
+ Axit béo
+ Menaquinon
+ Type photpholipid
Trong các đ c đi m đó thì tpye thành t bào là đ c đi m quan tr ng
nh t đ phân lo i x khu n. Ng

i ta chia thành t bào ra làm 4 d ng chính:

+ Type 1: Thành t bào có L-ADP và Glixin.
+ Type 2: Thành t bào có mDAP và Glixin.

TrÇn ThÞ Ly

6

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

+ Type 3: Thành t bào có mDAP.
+ Type 4: Thành t bào có mDAP, đ

ng arabinose, galactose.

Phơn lo i s
D a trên s a đánh giá v m c đ gi ng nhau gi a các VSV trong m t
s l n các đ c đi m ch y u là các đ c đi m hình thái, sinh lí, sinh hóa đ so
sánh các ch ng gi ng nhau t ng đôi m t theo công th c:
SAB = nS*100/ (nS+nd)
Trong đó:
SAB: M c đ gi ng nhau gi a 2 cá th .
nS: T ng s các đ c đi m d

ng tính c a 2 ch ng so sánh.

nd: T ng s các đ c đi m d

ng tính v i ch ng này mà âm tính v i

ch ng kia.
K t qu c a s so sánh này đ

c bi u hi n trên s đ nhánh và tùy

thu c vào m c đ gi ng nhau mà các VSV đ

c x p vào các nhóm .

Nghiên c u v phát sinh ch ng lo i
Nh s s p x p phát sinh ch ng lo i mà các sinh v t đ

c x p vào h

th ng phân lo i g n t nhiên h n.
Các nghiên c u v di truy n ph n t nh m xây d ng cây phát sinh
ch ng lo i b ng cách ti n hành các so sánh các cao phân t ADN, ARN,
protein, mà quan tr ng h n c là s s p x p các nucleotit c a rARN 16S. M c
đ gi ng nhau gi a 2 cá th so sánh th hi n m i quan h gi a chúng.
1.1.2. Vai trò c a x khu n.
X khu n có vai trò quan tr ng trong quá trình hình thành đ t và t o đ
phì nhiêu cho đ t. Chúng đ m nhi m nhi u ch c n ng khác nhau trong vi c

TrÇn ThÞ Ly

7

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

làm m u m cho đ t b ng cách tham gia tích c c vào các quá trình chuy n

hóa và phân gi i nhi u h p ch t h u c ph c t p và b n v ng nh cellulose,
mùn, kitin, keratin, lignin…[6]
H u h t x khu n thu c gi ng Actinomyces có kh n ng hình thành
ch t kháng sinh nh streptomycine, oreomixine, tetraxicline…
trong nh ng đ c đi m quan tr ng nh t c a x khu n đ

ây là m t

c s d ng r ng rãi

trong y h c, thú y h c, b o v th c v t. Bên c nh đó trong quá trình trao đ i
ch t x khu n có th s n sinh ra nhi u h p ch t h u c . Trong đó đi n hình là
các enzym ngo i bào (cellulase…), vitamin nhóm B (B1, B2…B12), m t s
acid h a c (acid lactat, acid axetat…)[6].
Ngày nay x khu n còn đ

c ng d ng r ng rãi trong các ngành công

nghi p lên men, ch t o các ch ph m enzyme, ng d ng các ch ph m này
vào đ i s ng do m t s x khu n có kh n ng sinh ra nhi u nh : proteinase,
amylase, cellulase, kitinnase. M t s khác còn có kh n ng t o thành ch t
kích thích sinh tr

ng c a th c v t.

1.2. Nhu c u dinh d

ng c a x khu n

Theo Nguy n Thành

t trong quá trình ti n hóa các VSV có quan h

m t thi t đ i v i các y u t c a đi u ki n s ng. VSV c n
tr

ng nuôi c y nhân t o ch t dinh d

t nhiên hay môi

ng đ xây d ng nên các h p ch t c a

t bào và nh ng h p ch t dùng đ trao đ i n ng l ng[3].
Nhu c u dinh d

ng

các loài VSV r t khác nhau. Ngay trong cùng

m t loài VSV nhu c u này c ng không có s th ng nh t. Gi ng nh các loài
VSV khác nhu c u dinh d

ng

các loài x khu n c ng khác nhau. Trong

công nghi p tùy thu c vào m c đích mà ng
d

ng thích h p nh m thu đ

enzyme cellulase ng

TrÇn ThÞ Ly

i ta s d ng các ngu n dinh

c n ng su t cao nh t. Ví d nuôi c y thu

i ta quan tâm đ n ngu n cacbon. Nh ng n u m c đích

8

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

s n xu t là làm th nào đ thu đ
ng

c m t l ng l n ch t kháng sinh nào đó thì

i ta l i quan tâm đ n ngu n nit .

1.2.1. Nhu c u cacbon
Cacbon chi m 50% v t ch t khô c a vi sinh v t, là y u t quan tr ng
trong t t c các h p ch t h u c có m t trong t bào. Các h p ch t cacbon là

ngu n nguyên li u cho cho ho t đ ng s ng [6].
Trong t nhiên có 2 d ng h p ch t cacbon c b n là cacbon vô c và
cacbon h u c , m i sinh v t khác nhau s d ng ngu n cacbon khác nhau. D a
vào ngu n dinh d

ng cacbon mà ng

+D d

ng cacbon

+T d

ng cacbon

X khu n là VSV d d

i ta chia VSV thành hai nhóm chính:

ng cacbon, x khu n có kh n ng phân gi i các

h p ch t hydratcacbon khác nhau t d ng đ n gi n (acetat, lactat, các lo i
đ

ng đ n) đ n các d ng ph c t p (oligosaccharid, polisaccharid). Các h p

ch t h u c này ngoài vi c cung c p ngu n cacbon còn cung c p ngu n n ng
l

ng cho các ho t đ ng s ng.

Ph n l n x khu n có đ i s ng d d

ng hi u khí, quá trình oxi hóa thu

n ng l ng x y ra kèm theo vi c liên k t v i oxi không khí. X khu n có kh
n ng phát tri n đ

c trong nh ng môi tr ng ch a m t ngu n cacbon duy nh t.

1.2.2. Nhu c u nit
Nit có ý ngh a quan tr ng đ i v i s phát tri n c a VSV. Trong đó
ngu n nit d h p th nh t là ngu n NO 3- và NH4+. Chúng thâm nh p vào t
bào d dàng

đó chúng t o nên các nhóm imin và amin.

Các mu i amôn h u c thích h p đ i v i dinh d

ng VSV h n là các

mu i amôn vô c . Các mu i NO 3- không có đ chua sinh lí nên sau khi s d ng
d ng này d còn l i các ion K+, Na+, Mg+ các ion này làm ki m hóa môi tr ng.

TrÇn ThÞ Ly

9

K32D – Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

Ngu n nit khú h p th h n c l nit khớ tr i. M t s loi VSV cú th
s d ng ngu n ny nh kh n ng c inh nit (chuy n húa N--->NH3). Ph n
l n cỏc loi x khu n u cú i s ng d d

ng nit . Ch m t s loi thu c

chi Frankraceae cú kh n ng c nh nit nh c ng sinh v i r cõy h u.
1.2.3. Nhu c u vitamine v ch t khoỏng
Vitamine v ch t khoỏng úng vai trũ khụng nh trong quỏ trỡnh s ng
c a VSV. Trong t bo VSV ngoi n
l n cỏc vitamine v ch t khoỏng. L

c, cỏc ch t h u c cũn cú m t l ng
ng ch t ny trong t bo thay i theo

tựy loi. Tựy giai o n, i u ki n sinh tr

ng m i y u t u cú tỏc ng nh t

nh i v i s phỏt tri n c a t bo VSV m cỏc nhõn t khỏc khụng th thay
th

c.
Nguyờn t khoỏng

c chia lm hai lo i:

- Nguyờn t a l ng: P, K, Ca, Mg, Fe, Na, Cl
- Nguyờn t vi l
1.3. Cỏc y u t

nh h

ng: Mn, Cu, Co, B
ng n ho t tớnh cellulase c a x khu n

Kh n ng sinh t ng h p cellulase c a cỏc loi VSV l r t khỏc nhau.
Mu n cú

c ch ng VSV cú kh n ng t ng h p m t vi lo i enzyme no ú

c n ph i phõn l p t t, n c, khụng khớ hay t m t s b ph n c a ng th c v t ho c l y t m t b s u t p gi ng vi sinh v t cú s n. Tuy n ch n
ch ng VSV cú kh n ng sinh tr

ng, phỏt tri n nhanh, sinh t ng h p enzyme

cao, n nh
C u trỳc c a m i protein enzyme

c t o thnh trong t bo u

c

xỏc nh b i tớnh ch t di truy n c a t bo, do ú cú th dựng tỏc nhõn t
bi n tỏc ng lờn b mỏy di truy n c a VSV nh m t o ra cỏc d ng t bi n cú
kh n ng sinh t ng h p c bi t cao m t lo i enzyme no ú.

Trần Thị Ly

10

K32D Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

Sau khi ó ch n
c u thỡ ng

c m t gi ng VSV cú kh n ng ỏp ng y nhu

i ta b t u ti n hnh nuụi VSV trờn quy mụ l n thu enzyme. V

nguyờn t c cú 2 ph
+ Ph

ng phỏp nuụi VSV thu ch ph m enzyme.

ng phỏp nuụi c y b m t (ph

ng phỏp r n, ph

ng phỏp

n i)[7].
Vi sinh v t phỏt tri n

b m t mụi tr

c lm m v vụ trựng. Mụi tr

ng dinh d

ng dinh d

ng

ng ny th

th r n ó
ng g m cỏc

nguyờn li u t nhiờn nh cỏm, g o, ngụ b sung thờm tr u nh ho c mựn c a
giỳp lm x p mụi tr

ng khi n oxi khụng khớ d xõm nh p t o i u ki n

cho VSV phỏt tri n t t. v c b n cỏc nguyờn li u trờn cung c p dinh
d

ng nh : nit , cacbon, vitamine, mu i khoỏng cho VSV phỏt tri n. N u

mu n cú mụi tr

ng dinh d

ng t t h n cú th b sung nit vụ c ho c h u

c v cỏc c m ng tựy t ng lo i enzyme. Ph
enzyme cao h n ph

ng phỏp nuụi c y ny cho n ng

ng phỏp chỡm, mụi tr

ng sau khi s y khụ v n

chuy n d dng, trỏnh nhi m trựng ton b mụi tr

ng nuụi c y, ớt t n i n

n ng tuy nhiờn cú tớnh giỏn o n, chi m nhi u di n tớch nuụi c y, khú c gi i
húa v t ng húa vỡ th n ng su t th p t n nhi u lao ng th cụng. Tuy
nhiờn ph
tr

ng phỏp ny ch ỏp d ng

c v i nh ng VSV cú kh n ng sinh

ng v phỏt tri n m nh, thớch nghi v i mụi tr

ng r n th

ng

c ng

d ng cho cỏc gi ng n m m c, h u nh khụng ỏp d ng i v i x khu n.
+ Ph
ph
dinh d

ng phỏp nuụi chỡm [7]
ng phỏp ny ng

i ta cho VSV sinh tr

ng l ng cú s c khớ liờn t c.

vo mụi tr

ph

ng

trong mụi tr

ng

ng phỏp nuụi chỡm s ti t enzyme

ng di n ra trong su t quỏ trỡnh sinh tr

ng.

a s cỏc enzyme

th y phõn c a n m m c, x khu n, vi khu n l nh ng enzyme ngo i bo do
ú sau khi k t thỳc quỏ trỡnh lờn men cú th l c b sinh kh i thu l y d ch
enzyme em cụ c

Trần Thị Ly

c ch ph m thụ ho c tinh s ch ti p theo. Tuy nhiờn
11

K32D Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

i v i enzyme ngo i bo mu n thu sinh kh i c n ph i phỏ v t bo tỏch
enzyme ra kh i ph n sinh kh i t bo.
Ph

ng phỏp ny ti t ki m di n tớch s n xu t, d c gi i húa v t ng

húa, n ng su t cao, s d ng h p lý cỏc ngu n dinh d

ng cú trong mụi tr

ng

nuụi c y, enzyme thu

c ớt nhi m t p ch t. Tuy nhiờn t n i n n ng, n ng

enzyme trong canh tr

ng th p ph i cụ c nờn giỏ thnh cao. Mụi tr

ng

ny r t thớch h p v i cỏc gi ng x khu n.
Nhu v y thnh ph n dinh d
tr c ti p n kh n ng sinh tr
Ngoi cỏc y u t v dinh d

ng trong mụi tr

ng nuụi c y nh h

ng

ng, kh n ng sinh t ng h p enzyme c a VSV.
ng thỡ nhi t ,

m, pH c ng l nh ng y u t

quan tr ng cú kh n ng tỏc ng n quỏ trỡnh sinh t ng h p enzyme c a cỏc

ch ng x khu n.
pH
ch t dinh d

c o b ng n ng cỏc ion H+ v OH-. Khi s d ng m t s

ng cú b thay i do s cõn b ng ion, s t ng h p ATP ph

thu c nhi u vo dũng ion. Quỏ trỡnh sinh tr
n pH c a mụi tr

ng c a VSV c ng nh h

ng

ng nuụi c y. Cỏc nghiờn c u cho th y r ng ho t tớnh

enzyme r t nh y c m v i s thay i c a pH.
Nh v y, mụi tr

ng dinh d

ng bao gi c ng ph i cỏc thnh ph n

chớnh sau: ngu n nit , cacbon, vitamine, mu i khoỏng, cỏc thụng s v t lý,
thụng s sinh lý (cõn b ng n ng l ng, ỏp su t CO 2, O2). Cỏc y u t ny
nh h

ng tr

c ti p n kh n ng sinh t ng h p enzyme c a ch ng nuụi c y.

1.4. Cellulase v cellulose
Enzyme l ch t xỳc tỏc sinh h c, cú b n ch t protein, hũa tan trong
n

c v trong dung d ch mu i loóng. Enzyme cú phõn t l ng l n t 20000-

1000000 dalton nờn khụng qua

c mng bỏn th m. T t c cỏc y u t t lm

bi n tớnh protein nh acid c, ki m c, mu i kim lo i c u cú th lm
enzyme b bi n tớnh v m t ho t tớnh xỳc tỏc.

Trần Thị Ly

12

K32D Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

Enzyme có nhi u tính ch t u vi t h n h n các ch t xúc tác hóa h c và
có c

ng l c xúc tác r t l n, có tính đ c hi u cao. M i enzyme đ u tác đ ng

nên m t c ch t nh t đ nh. M t đi u đang l u ý là t t c các enzyme có ngu n
g c t nhiên không đ c.

i u này có ý ngh a quan tr ng trong công nghi p

th c ph m và y h c.
1.4.1. Cellulose
Cellulose là lo i h p ch t h u c d i dào trong t nhiên, chi m t i 4050 % hydratcacbon. Cellulose và hemicellulose là thành ph n ch y u t o lên
b khung x
ra môi tr
-

ng t bào th c v t. Hàng n m có hàng t t n cellulose đ

c th i

ng thông qua rác th i mà ch y u là xác th c v t…
c đi m c u t o

Cellulose là m t polysaccharide m ch th ng g m t 1400 đ n 12000
g c ß-D-Glucose liên k t v i nhau b i các liên k t ß-1,4-Glucozide. Trong
phân t cellulose các phân t

ß-D-Glucose có c u trúc không gian d ng gh

bành. Hai phân t khác nhau quay góc v i nhau 1800.
Cellulose có c u t o d ng s i song song dài kho ng 5µm v i đ

ng

kính kho ng 3nm. Các s i này liên k t v i nhau b i các liên k t hydro và các
liên k t Vandervan, t o thành các bó s i nh có đ

ng kính 10 - 40nm g i là

vi s i. Các vi s i này có c u trúc không đ ng nh t t o nên c u trúc mixen c a
cellulose. Cellulose d ng mixen g m 2 vùng:
+ Vùng k t tinh: vùng này có c u trúc ch t ch , đ m đ c ng n c n s
h p th n

c và ít ch u tác đ ng phân gi i. Vùng này chi m 3/4 c u trúc

cellulose.
+ Vùng vô đ nh hình: có c u trúc kém ch t ch , d b tr

ng lên, d b

phân gi i.

TrÇn ThÞ Ly

13

K32D – Sinh

Khóa luận tốt nghiệp

Tr-ờng ĐHSP Hà Nội 2

Trong t nhiờn cellulose khỏ b n v ng, khụng tan v b tr
h p th n

ng lờn khi

c. Cellulose b th y phõn khi un núng v i axit hay ki m

n ng

khỏ cao ho c b phõn gi i b i cỏc cellulase sinh ra t nhi u lo i sinh v t.
1.4.2 Cellulase
Cellulase xỳc tỏc cho quỏ trỡnh chuy n hoỏ cellulose thnh cỏc s n
ph m ho tan, d s d ng (h p th ). H th ng cellulase bao g m:
+ Cellobihydrolase.
Enzyme ny cú tỏc d ng c t t liờn k t hidro, bi n cellulose t nhiờn cú
c u hỡnh khụng gian thnh d ng cellulose vụ nh hỡnh khụng cú c u trỳc l p.
+ Endoglucanase
Enzyme ny c t t kiờn k t -1,4-Glucozide t o thnh nh ng chu i
di, nh cú kh n ng t n cụng vo cỏc i m khỏc nhau trờn chu i cellulose
c a CMC. Chỳng phõn c t cỏc chu i cenlulose m t cỏch ng u nhiờn, s n
ph m t o thnh l glucose v cỏc oligosaccharide. S phõn cỏch ny hỡnh
thnh cỏc u kh t do t o i u ki n cho exoglucanase ho t ng. B i v y
cellulose vựng k t tinh

c phõn gi i tri t , hi u qu .

+Exoglucanase
Enzyme ny t n cụng vo u khụng kh c a cellulose k t qu t o ra
cỏc cellobiose.

+ -Glucosidase
Enzyme ny ti n hnh th y phõn cellobinose v m t vi
oligosaccharide thnh glucose. Ho t tớnh c a

-Glucozidase m nh nh t trờn

cellobiose v gi m d n theo chi u di c a chu i.
1.4.3 Tri n v ng, ng d ng c a cellulase
Trong vi th p k tr l i õy cựng v i s phỏt tri n m nh m c a cụng
ngh sinh h c, cỏc ch ph m enzyme

c s n xu t ngy cng nhi u v

s d ng h u h t trong cỏc l nh v c kinh t . Enzyme ó t ng b

c

c lm thay i

v nõng cao m t s quỏ trỡnh cụng ngh trong ch bi n th c ph m, nụng
nghi p, ch n nuụi, y t

Trần Thị Ly

14

K32D Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

Các protease là các enzyme đ

c s d ng nhi u nh t hi n nay, ng

d ng trong ch bi n th c ph m (ví d : đông t s a, làm phomat, làm m m
th t), s n xu t các ch t t y r a, thu c da. Ti p đ n là các hydratcacbonase
trong s đó cellulase là m t trong nh ng enzyme đáng l u ý, đ

c ng d ng

trong k ngh ch bi n th c ph m, công ngh d t nhu m, công nghi p gi y,
ch bi n th c n gia súc nh , x lý môi tr

ng…

Trong công nghi p th c ph m các ch ph m enzyme đ
nhi u m c đích và tác đ ng

nhi u m c đ khác nhau. Ng

c s d ng v i
i ta có th s

d ng tác đ ng c a enzyme đ đi u ch nh nh ng khi m khuy t t nhiên c a
nguyên li u. Enzyme có th tham gia c i thi n ho c tiêu chu n hóa các quá
trình chuy n hóa, cho phép nh n các s n ph m m i hay s n ph m có ch t
l

ng cao h n.

c bi t enzyme có th can thi p vào chính qua trình ch bi n

và đóng vai trò công c công ngh . Nh tác d ng c a enzyme chúng ta có th
nh n các s n ph m trung gian hay cu i cùng khác nhau. Trong th c t s n
xu t các ch ph m đ

c s d ng nhi u trong hay cu i quá trình ch bi n nông

s n nh m nâng cao ch t l ng s n ph m cu i cùng đ c bi t trên khía c nh
c m quan.

i v i m t s

nguyên li u nông s n th c ph m, ho t đ ng

enzyme trong nguyên li u đ

c coi là m t trong nh ng ch tiêu đánh giá ch t

l

ng chính. Ngày nay cellulase đ

c ng d ng r ng rãi trong công nghi p

ch bi n và b o qu n nông s n, ch bi n các lo i đ

ng và các lo i m t tinh

b t, công ngh ch bi n cá, bánh k o đ c bi t ng d ng s n xu t các lo i
đ

ng ch c n ng, s n xu t probiotin dùng trong ch n nuôi…
Bên c nh vi c ng d ng ch ph m cellulase vào công nghi p th c

ph m ngày nay cellulase còn đ

c

ng d ng trong nhi u l nh v c khác

nh : công nghi p d t nhu m, công nghi p s n xu t gi y và b t gi y, công
nghi p thu c da…

TrÇn ThÞ Ly

15

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2

M t trong nh ng ng d ng quan tr ng n a c a cellulase là ng d ng
cellulase vào bi c b o v môi tr

ng. Hi n nay cellulase đ

c s d ng trong

vi c x lý rác th i nông nghi p, rác th i đô th , rác th i c a các nhà máy gi y,
thu c da... x lí ngu n n

TrÇn ThÞ Ly

c ôi nhi m đem l i hi u qu cao.

16

K32D – Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp

Tr-êng §HSP Hµ Néi 2
CH

PH

NG 2

NG PHÁP VÀ V T LI U NGHIÊN C U

2.1. V t li u
2.1.1. Nguyên li u

Các m u đ t l y t các lo i đ t thu c ph

ng Xuân Hòa – Phúc Yên –

V nh Phúc.
2.1.2. Hóa ch t
Các hóa ch t: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NH4Cl, KNO3, KNO2,
NaNO3, (NH4 )2SO4, NaCl, FeSO4…..
Tinh b t tan, saccharose, th ch agar, CMC (Cacboxyl Methyl
Cenlulose), b t gi y…
2.1.3. D ng c vƠ thi t b nghiên c u
- D ng c : h p petri, ng nghi m, bàn trang, que c y, đèn c n, bình
tam giác, giá đ ng ng nghi m.
- Thi t b : t

m vi sinh (Heraeus –

c), t s y (Heraeus –

c), n i

h p (Tomy – Nh t B n), cân Sartorius, t c y vô trùng, t l nh.
2.1.4. Môi tr

ng phơn l p x khu n

- Môi tr

ng 1: Gause I, pH = 7,0