NGHIÊN cứu đặc điểm mô BỆNH học và sự bộc lộ dấu ấn ALK TRONG UNG THƯ BIỂU mô TUYẾN của PHỔI tại BỆNH VIỆN k

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI


DƯƠNG MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC VÀ
SỰ BỘC LỘ DẤU ẤN ALK TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ
TUYẾN CỦA PHỔI TẠI BỆNH VIỆN K
Chuyên ngành : Giải phẫu bệnh
Mã số : CK 62720105
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP II
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Lê Trung Thọ

HÀ NỘI – 2019


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
UTPKTBN : Ung Thư Phổi Không Tế Bào Nhỏ.
BN

: Bệnh Nhân

PP

: Phương pháp

UTBMT

: Ung thư biểu mô tuyến

UTBMV

: Ung thư biểu mô vảy

TCYTTG

: Tổ chức y tế thế giới

UTP

: Ung thư phổi

KRAS

: Kirsten-ras/V-ki-ras 2 kirsten rat sarcomaviral oncogene
homolog

EGFR

: Epidermal Growth Factor Receptor

ALK

: Anaplastic lymphoma kinase

EML4

: Echinoderm microtubule associated protein-like 4

FISH

: Fluorescence in situ hybridization

PCR

: Polymerase chain reaction

HE

: Hematoxylin & Eosin

NSCLC

: Non small cell lung carcinoma


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................3
1.1. Vai trò của gen alk trong ung thư phổi và tình hình nghiên cứu..............3
1.1.1. Vai trò của gen ALK trong ung thư phổi..........................................3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới...................................................6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam..................................................11
1.2. Một số phương pháp xác định đột biến gen ALK....................................12
1.2.1. Xét nghiệm lai tại chỗ gắn huỳnh quang........................................12
1.2.2. Nhuộm hóa mô miễn dịch..............................................................13

1.2.3. Kỹ thuật PCR..................................................................................17
1.2.4. Các phương pháp phát hiện EML4-ALK khác trong UTPKTBN..18
1.2.5. Nghiên cứu về độ tương đồng của các phương pháp xét nghiệm
ALK...................................................................................................18
1.3. Phân loại MBH cho UTBMT theo WHO 2015........................................19
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............21
2.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................21
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu..........................................21
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ..........................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................21
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu........................................................................21
2.2.2. Cỡ mẫu và chọn mẫu nghiên cứu...................................................21
2.2.3. Biến số nghiên cứu.........................................................................22
2.2.4. Các bước tiến hành nghiên cứu......................................................23
2.3. Xử lý và phân tích số liệu.........................................................................24
2.4. Khống chế sai số......................................................................................24


2.5. Đạo đức trong nghiên cứu........................................................................24
Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU......................................25
3.1. Kết quả chung về đặc điểm BN, vị trí mẫu u làm XN và típ MBH.........25
3.1.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu....................................25
3.1.2. Tỷ lệ các thứ típ trong UTBM tuyến..............................................27
3.1.3. Các vị trí sinh thiết mẫu làm xét nghiệm........................................27
3.2. Kết quả xét nghiệm ALK.........................................................................28
3.3. Kết quả nhuộm ALK với các nhóm tuổi, giới, và típ MBH.....................28
3.3.1. Kết quả nhuộm ALK với đặc trưng cá nhân tuổi, giới...................28
3.3.2. Kết quả nhuộm ALK với các típ MBH...........................................29
CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN..........................................................30
DỰ KIẾN KẾT LUẬN..................................................................................31

KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU........................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢN


Bảng 1.1.

Biến thể ALK trong ung thư phổi không tế bào nhỏ.....................5

Bảng 1.2.

Các tiêu chí tính điểm để xác định tình trạng của ALK trong
UTPKTBN..................................................................................14

Bảng 2.1.

Biến số nghiên cứu......................................................................22

Bảng 3.1.

Phân bố bệnh theo tuổi................................................................25

Bảng 3.2.

Phân bố bệnh nhân theo giới.......................................................26

Bảng 3.3.

Tỷ lệ các bệnh nhân hút thuốc lá/không hút thuốc lá..................26

Bảng 3.4.

Tỷ lệ các thứ típ trong UTBM tuyến...........................................27

Bảng 3.5.

Các vị trí mẫu u làm xét nghiệm ALK........................................27

Bảng 3.6.

Tỷ lệ mẫu xét nghiệm nguyên phát hay di căn...........................28

Bảng 3.7.

Tỷ lệ kết quả ALK âm tính hay dương tính................................28

Bảng 3.8.

Tỷ lệ bộc lộ (âm tính/dương tính) trong nhóm tuổi....................28

Bảng 3.9.

Tỷ lệ dương tính và âm tính trong các nhóm về giới tính...........29

Bảng 3.10. Tỷ lệ dương tính với ALK trong các nhóm chẩn đoán..............29
Y

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1.1. Tỷ lệ kháng thuốc điều trị nhắm trúng đích của bệnh nhân UTP...11
Biểu đồ 3.1. Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi...........................................25
Biểu đồ3.2. Phân bố bệnh nhân theo giới.....................................................26

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh bộc lộ ALK bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn huỳnh quang 13
Hình 1.2. Tiêu chuẩn đánh giá sự bộc lộ ALK bằng nhuộm HMMD...........15
Hình 2.1. Tiêu chuẩn đánh giá sự bộc lộ ALK bằng nhuộm HMMD...........24

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Sự hình thành đột biến ALK .......................................................4
Sơ đồ 1.1 (tiếp). Sự hình thành đột biến ALK .................................................5
Sơ đồ 1.2. Mô tả một số protein liên kết với ALK được xác định trong
UTPKTBN....................................................................................8


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi (UTP) là bệnh lý ác tính thường gặp và là nguyên nhân gây
tử vong do ung thư hàng đầu trên toàn thế giới. Thống kê cho thấy số trường
hợp UTP trên thế giới đã tăng xấp xỉ 104% kể từ năm 1985 tới 2012 (tăng
84% ở nam giới và tăng 166% ở nữ giới). Theo thống kê của American
Cancer Society năm 2016, dự tính toàn Hoa Kỳ có khoảng 224390 trường hợp
UTP mới mắc (117920 nam và 106470 nữ), trong đó có 158080 trường hợp tử
vong (85920 nam và 72160 nữ) [1]. Điều trị ung thư phổi có nhiều phương
pháp khác nhau. Phương pháp áp dụng cho giai đoạn sớm là phẫu thuật, giai
đoạn muộn hơn là hóa-xạ trị. Những thập niên gần đây, phương pháp điều trị
nhắm trúng đích trở nên quan trọng vì nhờ liệu pháp này thời gian sống thêm

không bệnh cho những bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột biến
được kéo dài. Hồ sơ phân tử, đặc biệt là đột biến EGFR hoặc KRAS và
EML4-ALK dung hợp đang và đã định hướng quyết định điều trị. Thuốc
kháng TKIs nhắm đích ở bệnh nhân có đột biến EGFR, ALK/ROS1 đã phát
triển mạnh và phổ biến trên thế giới [2]. Với các thế hệ thuốc điều trị khi có
đột biến EGFR thế hệ 1,2,3 như gefitinib, afatinib, osimetinib. Những bệnh
nhân không có đột biến EGFR sẽ được xét nghiệm làm đột biến ALK. Các thế
hệ thuốc điều trị đích cho đột biến ALK là Crizotinib, Ceritinib, Alectinib,
Brigatinib, Lorlatinib đã được đánh giá có hiệu quả trên các nghiên cứu thử
nghiệm lâm sàng và trên thực tế [3].
Gen anaplastic lymphoma kinase (ALK) mã hóa một loại protein thuộc
một phần của họ thụ thể insulin [4], [5]. Sự thay đổi trong gen ALK xảy ra ở
một số loại ung thư như nhóm u lympho tế bào lớn bất thục sản… bao gồm cả
ung thư phổi không tế bào nhỏ [6]. Sự tái sắp xếp gen ALK trên bệnh nhân
ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm tỷ lệ từ 4-7%. Tỷ lệ cũng tương tự hoặc


2

cao hơn trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi. Việc phát hiện các
đột biến gen ALK có thể được thực hiện bằng kỹ thuật lai tại chỗ (FISH) hoặc
hóa mô miễn dịch (HMMD). Một loạt các nghiên cứu trên thế giới so sánh giá
trị giữa các phương pháp đã chỉ ra sự tương đồng của phương pháp xét
nghiệm Ventana ALK (D5F3) có độ tương đồng cao với FISH [7],[8], [9],
[10]. Do vậy trong thực hành lâm sàng, lựa chọn kỹ thuật HMMD cho việc
phát hiện xắp xếp lại gen ALK đã được y giới toàn cầu thừa nhận và áp dụng
từ vài năm trở lại đây. Tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về mô bệnh học
UTP, nhiều nghiên cứu về đột biến gen EGFR nhưng còn rất ít nghiên cứu về
đột biến ALK trong ung thư tuyến phổi. Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học và sự bộc lộ dấu ấn ALK trên bệnh

nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi tại bệnh viện K” nhằm 2 mục tiêu:
1. Nhận xét các đặc điểm vi thể của các dưới típ ung thư biểu mô
tuyến của phổi tại bệnh viện K.
2. Xác định tỷ lệ bộc lộ dấu ấn ALK trên bệnh nhân ung thư biểu mô
tuyến của phổi và đối chiếu với một số đặc điểm bệnh học của bệnh.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Vai trò của gen alk trong ung thư phổi và tình hình nghiên cứu
1.1.1.Vai trò của gen ALK trong ung thư phổi
Năm 1990, hai tác giả Ullrich & Schlessinger phát hiện ra enzyme ALK
(Anaplastic Lymphoma Kinase) trong nhóm gia đình men tyrosine của
receptor insulin (Insuline Receptor Tyrosine Kinase Family: RTK) và được
mã hoá bởi gen ALK trên nhiễm sắc thể 2p23, được cấu tạo chính từ 2 introns
lớn và 26 exons. Đây là một trong những chuỗi biến đổi gen nằm trong nhóm
lymphoma tế bào lớn. ALK là một glycoprotein màng tế bào type I được biểu
hiện thông thường chỉ trong hệ thần kinh[11].Năm 2007, Soda và CS phát
hiện ra sự hoán đổi các vị trí gen tương tự protein 4 của ngoại bì phôi
(echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4) và gen ALK tạo
ra gen ALK-EML4, xuất hiện trong UTPKTBN. Sự tái sắp xếp gen ALK xuất
hiện ở 3-7% bệnh nhân có UTPKTBN và nhiều hơn phổ biến ở những bệnh
nhân có tiền sử không hút thuốc lá, mô học ung thư biểu mô tuyến, độ tuổi
trẻ, giới tính ở phụ nữ và ở các khối u có EGFR và KRAS (-) [4]. Sinh bệnh
học phân tử của ALK bắt đầu từ việc sắp xếp lại nhiễm sắc thể mà kết hợp với
chuỗi mã hóa 3’ cho miền tín hiệu nội bào với các phần tử hoạt hóa 5' và
chuỗi mã hóa của các gen khác. Một sự đảo ngược trong nhiễm sắc thể 2p, kết
quả là sự hình thành một sản phẩm gen hợp nhất bao gồm các thành phần gen

echinoderm microtubule associated protein-like 4 (EML4) và gen ALK, đã
được phát hiện vào năm 2007 ở các dòng tế bào UTPKTBN và các mẫu bệnh
phẩm lưu trữ. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sự đảo ngược EML4-ALK bao
gồm ít nhất 9 biến thể hợp nhất, tất cả đều chứa cùng một phần của miền
kinase ALK C-terminal, cho chúng hoạt động xúc tác. Phù hợp với điều này,


4

biểu hiện EML4-ALK trong các tế bào biểu mô phế nang phổi ở chuột chuyển
gen là một yếu tố gây ung thư mạnh.
Hiện nay, ALK được ghi nhận như 1 gen chính thúc đẩy ung thư trong
UTPKTBN, và dù EML4 là một gen đồng hành phức hợp nổi trội, các gen
phức hợp với partner khác cũng được xác định[12], [13]. Tỉ lệ tái sắp xếp lại
gen ALK xuất hiện trong khoảng 2-7%, nghĩa là xấp xỉ 6,000 bệnh nhân có
ALK dương tính/năm tại Mỹ và xấp xỉ 40,000 bệnh nhân/năm trên toàn cầu
[14], [15], [16]. Tuy nhiên, có những hạn chế đối với ước tính này, bao gồm
một tập dữ liệu nhỏ (1.500 mẫu khối u) và các phương pháp ALK khác nhau
được sử dụng trong các nghiên cứu. Đáng chú ý là phần lớn các sự sắp xếp lại
gen ALK được quan sát thấy trong nhiều mẫu tế bào ung thư phổi tế bào
tuyến khi so với tế bào vảy hoặc tế bào nhỏ. Cũng có những bằng chứng cho
thấy rằng ALK có khuynh hướng liên quan đến những bệnh nhân ít hoặc
không bao giờ hút thuốc mặc dù điều này có thể không phải là một cofactor
đáng kể [14], [15], [16], [17]. Quan trọng, sự sắp xếp lại gen ALK hiếm khi
trùng hợp với đột biến EGFR, HER2, hoặc KRAS, chứng minh rằng ALK
dương tính là một loại phân nhóm bệnh riêng biệt.

Sơ đồ 1.1. Sự hình thành đột biến ALK [12].

5

Sơ đồ 1.1 (tiếp). Sự hình thành đột biến ALK [12].
Bảng 1.1. Biến thể ALK trong ung thư phổi không tế bào nhỏ
(Theo Heuckmann JM, Balke-Want H, Malchers F, et al. Differential protein stability and ALK
inhibitor sensitivity of EML4-ALK fusion variants. Clin Cancer Res. 2012;18:4682–90).
Biến thể
Danh pháp chuyển đoạn EMLĐặc tính Protein tổng hợp
Tần suất
ALK
ALK
trong
NSCLC
E13; A20 E13; A20 (biến thể 1), E13; ins69
Vị trí bào tương, protein dài
33%
A20
hơn t1/2, ức chế tăng trưởng tế
bào đòi hỏi nồng độ ức chế
ALK mức độ vừa
Vị trí bào tương và nhân,
protein dài hơn t1/2, ức chế tăng
E6a / b;
E6a / b; A20 (các biến thể 3a / b)
trưởng tế bào đòi hỏi nồng độ
29%
A20
chất ức chế ALK ở mức thấp
hoặc trung bình.
Vị trí bào tương, protein ngắn

E20; A20 (biến thể 2), E20;
hơn t1/2 , ức chế tăng trưởng tế
E20; A20
9%
ins18A20
bào đòi hỏi ở nồng độ chất ức
chế ALK ở mức cao.
E14; ins11del49A20 (biến thể 4 '),
E14; A20
Không có dữ liệu
3%
E14; del12A20 (biến thể 7)
E18; A20 E18; A20 (biến thể 5 ')
Không có dữ liệu
2%
E15; A20 E15 del19; del20A20 (biến thể 4)
Không có dữ liệu
2%
E 2; A20 & E2; ins117A20 (biến thể
E 2; A20
Không có dữ liệu
2%
5a / b)

Một số điểm lưu ý:


6

- Phần lớn sự sắp xếp lại gen ALK được quan sát thấy ở những mẫu bệnh

ung thư phổi biểu mô tuyến so với mẫu mô tế bào vảy hoặc tế bào nhỏ.
- Cũng có những bằng chứng cho thấy sự sắp xếp lại gen ALK có khuynh
hướng tương quan với những bệnh nhân không hoặc ít hút thuốc.
- Điều quan trọng là, sự sắp xếp lại gen ALK hiếm khi xảy ra cùng với đột
biến EGFR, HER2, hoặc KRAS, chứng tỏ là ALK là một phân týp bệnh khác biệt.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
- Những nghiên cứu trong quá khứ: Thập kỷ vừa qua đã chứng kiến
một sự thay đổi lớn trong việc điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ
(NSCLC). Mặc dù phân nhóm mô học rõ ràng là một yếu tố quan trọng trong
việc lựa chọn các hóa trị liệu độc tế bào tiêu chuẩn, nhưng hiện tại người ta
nhận ra rằng sự hiện diện của các thay đổi gây ung thư quan trọng, như kích
hoạt đột biến và sắp xếp lại nhiễm sắc thể là yếu tố quan trọng dự đoán khả
năng đáp ứng với các liệu pháp nhắm mục tiêu chọn lọc. Trong UTP, mô hình
này lần đầu tiên được thiết lập với việc phát hiện ra các đột biến của thụ thể
yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR ) có liên quan đến sự nhạy cảm với chất ức
chế tyrosine kinase (TKI) gefitinib. Gần đây, các UTPKTBN chứa chấp sự
chuyển đoạn trong anaplastic lymphoma kinase (ALK) đã chứng minh độ
nhạy đáng chú ý đối với chất ức chế ALK kinase crizotinib. Sự sắp xếp lại
gen ALK được báo cáo lần đầu tiên trong UTPKTBN vào năm 2007 [18],[19],
những tiến bộ đáng kể trong các kết quả nghiên cứu thử nghiêm lâm sàng đã
dẫn đến phê duyệt nhanh chóng gần đây cho thuốc ức chế ALK crizotinib của
Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) [20]. ALK lần đầu
tiên được phát hiện cách đây hơn 17 năm dưới dạng hợp chất oncogene với
nucleophosmin ( NPM ) trong một tập hợp các tế bào u lympho tế bào lớn mất
biệt hóa (ALCL) [21].NPM-ALK phát sinh từ sự chuyển đoạn liên quan đến
nhiễm sắc thể 2p, chứa ALK và nhiễm sắc thể 5q, chứa NPM . Các protein


7

tổng hợp ALK khác cũng đã được xác định trong ALCL, bao gồm TPM3ALK và TFG-ALK [22],[23].ALK được phát hiện tiếp theo khoảng 11 năm
trước trong một tập hợp các khối u nguyên bào cơ viêm (myofibroblastic
-IMTs) [22]. Tuy nhiên, phải đến gần 5 năm sau, mối quan tâm về ALK mới
tăng lên sau khi một ấn phẩm quan trọng của Hiroyuki Mano và CS mô tả về
việc phát hiện ra ALK liên kết với echinoderm microtubule-associated
protein-like 4 (EML4)-ALK-, một sự sắp xếp lại gen soma được tìm thấy trong
một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân UTP của Nhật Bản được công bố [18]. EML4-ALK
là kết quả của sự đảo ngược nhỏ trong nhiễm sắc thể 2p, hợp nhất các phần
khác nhau của gen EML4 với một phần của gen ALK . EML4-ALK là phản
ứng tổng hợp ALK chiếm ưu thế trong bệnh UTP, mặc dù hiện tại đã có một
số phản ứng tổng hợp ALK khác, bao gồm KIF5B-ALK, TFG-ALK và
KLC1-ALK (hình 1.1.) [19],[24],[25]. Trong hầu hết tất cả các sắp xếp
lại ALK đã biết, bao gồm EML4-ALK , điểm chuyển đoạn bộ gen trong
gen ALK được bảo tồn. Gen ALK kiểu hoang dã (hoặc không được sắp
xếp) mã hóa một thụ thể -receptor tyrosine kinase (RTK) đơn độc được cho là
có vai trò trong sự phát triển của hệ thần kinh [26]. Ở người trưởng thành,
biểu hiện của ALK bị hạn chế ở một số tế bào thần kinh nhất định. Ở cấp độ
tế bào, ALK điều chỉnh các con đường truyền tín hiệu chính thống được chia
sẻ với các RTK khác, bao gồm protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK),
phosphoinositide 3-kinase (PI3K) và AKAK STAT. Trong trường hợp sắp xếp
lại ALK, chuỗi kết thúc như NPM và EML4 được hợp nhất với miền tyrosine
kinase nội bào của ALK, dẫn đến biểu hiện bất thường của các liên kết ALK
trong bào tương tế bào, dẫn đến sự tăng sinh tế bào không kiểm soát được.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng protein tổng hợp bởi ALK là nguyên
nhân gây ung thư cả in vitro và in vivo. Trong báo cáo ban đầu mô tả sự sắp
xếp lại ALK trong UTPKTBN, các tế bào 3T3 của chuột được thay thế bằng
một đoạn mã hóa plasmid EML4-ALK đã hình thành khối u trong môi trường


8

thạch nuôi cấy và khối u lớn dưới da ở chuột. Ngược lại, phiên bản chết của
kinase của EML4-ALK, K589M đã thất bại trong việc tạo ra các khối u, điều
này cho thấy hoạt động kinase của EML4-ALK rất quan trọng đối với tiềm
năng gây ung thư của nó [18]. Trong các báo cáo tiếp theo, các nhà nghiên
cứu đã tạo ra chuột biến đổi gen biểu hiện EML4-ALK dưới sự kiểm soát của
một đoạn khởi đầu (promoter) đặc hiệu phổi. Kết cục, tất cả các động vật
chuyển gen đã hình thành nhiều ung thư biểu mô tuyến phổi có biểu hiện
protein liên kết ALK [27],[28]. Điều đó đã chứng minh EML4-ALK là đủ để
gây ra khối u phổi trong cơ thể. Các nghiên cứu tiền lâm sàng đã chứng minh
rằng các bệnh ung thư với chuyển đoạn ALK là yếu tố liên quan tăng trưởng
và sống thêm [29]. Sự phụ thuộc này thường được gọi là phụ thuộc oncogene
và trong hình thành phụ thuộc RTK, điều này xảy ra khi tín hiệu RAS-MAPK
và PI3K-AKT được điều khiển bởi RTK như ALK hoặc EGFR. Sự ức chế
RTK dẫn đến việc ngăn chặn các con đường truyền tín hiệu này, dẫn đến việc
ngừng tăng trưởng tế bào và tế bào sẽ chết theo chương trình.

Sơ đồ 1.2. Mô tả một số protein liên kết với ALK được xác định trong
UTPKTBN [20].


9

- Những nghiên cứu trong thời điểm hiện tại: Các nghiên cứu về
crizotinib giai đoạn đầu đã xác nhận ALK là mục tiêu điều trị. Hầu hết các kết
quả lâm sàng với crizotinib trong nghiên cứu của Alice và CS (2013) bắt
nguồn từ những bệnh nhân bị UTP tiến triển có đột biến ALK. Những bệnh
nhân này chiếm khoảng 4% tổng số bệnh nhân mắc UTPKTBN, đại diện cho
40.000 trường hợp mới trên toàn thế giới mỗi năm [20]. Sắp xếp lại ALK đã
được liên kết với một số đặc điểm lâm sàng đặc biệt [30],[31]. Một trong

những điều quan trọng nhất là không có tiền sử hút thuốc. Tại Bệnh viện Đa
khoa Massachusetts, gần 15% bệnh nhân UTP từ bệnh nhân có tiền sử không
bao giờ hút thuốc có ALK dương tính. Trong số những bệnh nhân có tiền sử
hút thuốc, chỉ có 2% dương tính với ALK. Ngược lại, trong số những bệnh
nhân mắc ung thư phổi do ALK , hơn 90% là những người không bao giờ hút
thuốc hoặc hút rất ít (hút thuốc ít được định nghĩa là ≤ 10 gói/năm). Các đặc
điểm quan trọng khác liên quan đến ung thư phổi do ALK bao gồm tuổi trẻ
hơn trong chẩn đoán, tip ung thư biểu mô tuyến và không có các đột biến gây
ung thư khác.Vai trò của crizotinib trong ung thư phổi do đột biến ALK lần
đầu tiên được đánh giá trong một nghiên cứu quốc tế, đa trung tâm [32].
Crizotinib ban đầu được sản xuất tại Pfizer dưới dạng phân tử nhỏ TKI nhắm
mục tiêu c-MET [33].Sau đó, Crizotinib được phát hiện là tác dụng mạnh nhất
đối với c-MET nhưng cũng hoạt động chống lại một số RTK khác bao gồm
ALK và ROS1. Một cách ngẫu nhiên, phần tăng liều trong giai đoạn nghiên
cứu về crizotinib đã được tiến hành ở bệnh nhân UTP có đột biến EML4-ALK
và đã được báo cáo lần đầu tiên. Trong vòng vài tháng, phương pháp lai tại
chỗ (FISH) đã được phát triển và ngay sau đó, hai bệnh nhân đầu tiên bị UTP
do ALK đã được ghi danh vào việc tăng liều. Cả hai bệnh nhân đều có một sự
cải thiện đáng kể về các triệu chứng liên quan đến bệnh. Tiếp theo nhiều bệnh
nhân khác bị UTP do ALK sau đó đã được ghi danh vào một nghiên cứu mở


10

rộng liều với liều dung nạp tối đa [32]. Trong số 143 bệnh nhân được đánh
giá, tỷ lệ đáp ứng khách quan (ORR) là 60,8%. Thời gian đáp ứng trung bình
là 49,1 tuần và thời gian sống thêm không tiến triển trung bình (PFS) là 9,7
tháng [34] trong khi những bệnh nhân được sử dụng phác đồ hóa chất tiêu
chuẩn đơn thuần thì tỷ lệ đáp ứng khách quan chỉ <10% và PFS trung bình từ
2 đến 3 tháng[35],[36].Nhiều nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu

quả điều trị của crizotinib có thời gian đáp ứng khách quan trung bình là
59,8% và PFS trung vị là 8,1 tháng [37]. Trong các nghiên cứu cho thấy
crizotinib được dung nạp tốt, các tác dụng không mong muốn là nhẹ, chủ yếu
là độ 1, bao gồm rối loạn thị giác, buồn nôn/nôn, tiêu chảy, táo bón, mệt mỏi
và phù ngoại biên. Trên cơ sở tỷ lệ đáp ứng được thể hiện trong các nghiên
cứu pha I và II, cùng với tính an toàn của nó, crizotinib đã được FDA chấp
thuận vào tháng 8 /2012, 4 năm sau báo cáo đầu tiên về vai trò của sắp xếp
lại gen ALK trong ung thư phổi [30].
- Tương lai: Mặc dù crizotinib có hoạt tính chống ung thư rõ rệt nhưng
các bệnh ung thư do xắp xếp lại ALK luôn luôn trở nên kháng với
crizotinib. Trong trường hợp UTP do ALK , cũng như UTP đột biến EGFR ,
thời gian hình thành kháng thuốc xuất hiện trung bình trong vòng một hoặc
hai năm đầu của liệu pháp TKI và đó là những thách thức cấp bách nhất trong
lĩnh vực trị liệu nhắm mục tiêu.


11

Biểu đồ 1.1. Tỷ lệ kháng thuốc điều trị nhắm trúng đích của bệnh nhân
UTP [20].
(Dấu hỏi là chưa biết rõ cơ chế kháng thuốc/dấu * là bệnh nhân có nhiều hơn 1 cơ chế kháng thuốc)

Điều này thúc đẩy nghiên cứu các chất ức chế ALK thế hệ tiếp theo có
cấu trúc khác biệt với crizotinib, nói chung mạnh hơn crizotinib và hiện đang
được thử nghiệm để khắc phục tình trạng kháng crizotinib. Cho đến nay, ít
nhất bốn chất ức chế ALK mới hiện đang được nghiên cứu, bao gồm LDK378
(Novartis, Thụy Sĩ), AP26113 (ARIAD, Cambridge, MA), AF802 (Chugai,
Nhật Bản) và ASP3026 (Astellas Pharma, Nhật Bản) [20].Các thử nghiệm
lâm sàng về các thuốc ức chế ALK thế hệ tiếp theo cũng như các liệu pháp
nhắm mục tiêu ALK khác là bước đầu tiên trong việc khắc phục tình trạng

kháng crizotinib, nhưng liệu pháp tác nhân đơn lẻ không có khả năng làm
thay đổi tiến trình bệnh cho phần lớn bệnh nhân bị tái phát với crizotinib. Một
số nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều cơ chế kháng thuốc có thể hoạt động ở một
bệnh nhân và đó là những thách thức thực sự trong điều trị UTP do ALK.
1.1.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Tại Việt nam hiện xét nghiệm về ALK bằng HMMD đang bắt đầu được
triển khai trên các bệnh viện đầu ngành. Bước đầu có những nghiên cứu về
ALK nhưng về công bố số liệu chưa có.
1.2. Một số phương pháp xác định đột biến gen ALK
Kể từ khi giới thiệu trị liệu UTP bằng crizotinib, xét nghiệm đột biến
ALK được khuyến nghị cho tất cả các UTPKTBN [38]. Có một số phương
pháp kiểm tra đột biến phân tử ALK; phổ biến nhất là nhuộm hóa mô miễn
dịch (HMMD), lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH) và kỹ thuật dựa trên phản
ứng chuỗi polymerase (PCR).


12

1.2.1. Xét nghiệm lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH)
Kỹ thuật FISH được coi là Tiêu chuẩn Vàng cho thử nghiệm đột biến
ALK của các UTPKTBN. Năm 2011, FDA đã phê duyệt bộ kit xét nghiệm
FISH cho chẩn đoán đột biến ALK của Abbot Vysis ALK Break Apart [39],
[40]. Đối với quy trình Vysis ALK, mô không nhuộm được lai qua đêm với
đầu dò ALK và được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh quang [39],[41]. Xác
định một sự chuyển vị ALK có mặt khi đầu dò ALK cho thấy các điểm phát
quang- fluorophores màu đỏ và màu xanh lá cây tách biệt hoặc mất tín hiệu
màu xanh lá cây trong 15% hoặc nhiều hơn các tế bào được kiểm
tra. Fluorophore màu xanh lá cây liên kết vùng 5 'với ALK, trong khi màu đỏ
liên kết với vùng mã hóa 3' ALK kinase [39],[40]. Phân tích FISH cho các
chuyển đoạn EML4-ALK có thể khó khăn vì: 1) Nó có chi phí cao, 2) Việc

giải thích chính xác đòi hỏi phải có chuyên môn và kinh nghiệm, 3) Nó không
xác định các loại chuyển đoạn cụ thể và 4) Thường cần thời gian dài [39],
[41],[42]. Ưu điểm của FISH là nó sẽ phát hiện tất cả các sắp xếp lại ALK bất
kể phần liên kết, đạt độ chính xác và đáng tin cậy cao.
Yêu cầu kỹ thuật giải phẫu bệnh cho kỹ thuật nhuộm FISH chẩn đoán
ALK .

Tham số
Mô tả/Yêu cầu
Thời gian tới khi bệnh phẩm được cố Ngắn nhất có thể, không vượt quá 1
định
Cố định
Thời gian cố định
Sự chuẩn bị mẫu
Lưu trữ mẫu

giờ
Dung dịch formalin trung tính 10%
6-48 giờ
Các lát cắt từ khối nến, độ dày 5±1 µm
Mô vùi trong nến (lý tưởng nhất)


13

Thời gian lưu trữ các nến
Điều kiện lưu trữ nến
Thời gian lưu trữ các lát cắt
Khử canxi

Trong thời lượng thích hợp
Tránh ánh sáng, nhiệt độ cao, độ ẩm
4-6 tuần, các tiêu bản cũ hơn tùy chỉnh
EDTA, nếu cần thiết

Hình 1.1. Hình ảnh bộc lộ ALK bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn huỳnh quang
[26].
1.2.2. Nhuộm hóa mô miễn dịch
Hóa mô miễn dịch dễ dàng xác định ALK trong u lympho tế bào lớn
mất biệt hóa [43],[44]. Tuy nhiên, mức protein ALK trong các UTPKTBN có
xắp xếp lại gen ALK là tương đối thấp, khiến các phương pháp phát hiện
ALK bằng HMMD được sử dụng như cho u lympho tế bào lớn mất biệt hóa là
không đầy đủ [45]. Ngoài ra, hiện tại không có quy trình chuẩn nhuộm
HMMD để phát hiện ALK trong NSCLC [46]. Các kháng thể được sử dụng
trong nhuộm HMMD đã đạt được thành công là D5F3 (Cell Signaling
Technology, Danvers, MA, USA), 5A4 (Novocastra, Newcastle, UK) và ALK
đơn dòng ZAL4 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)[47],[48]. Thunnissen và CS
[49] chỉ ra rằng những thách thức hiện tại trong việc phát triển HMMD để
phát hiện ALK trong UTPKTBN là: 1) Việc chuẩn bị mô, 2) Việc lựa chọn
kháng thể, 3) Hệ thống tăng cường tín hiệu và 4) Hệ thống tính điểm tối
ưu. Những ưu điểm chính của HMMD là: 1) Chi phí thấp, 2) Dễ thực hiện, 3)


14

Dễ giải thích bởi nhà nghiên cứu bệnh học nói chung, 4) Có khả năng lưu giữ
thông tin mô học và 5) Thời gian có kết quả ngắn. Hiện tại ứng dụng lâm sàng
nhuộm HMMD phát hiện ALK trong NSCLC vẫn cần yêu cầu phân tích và
xác nhận thêm[41],[42],[46],[50].
Bảng 1.2: Các tiêu chí tính điểm để xác định tình trạng của ALK trong NSCLC

Kết quả

Mô tả nhuộm màu
Có sự hiện diện của bắt màu mạnh hạt tế bào chất trong các tế bào

Dương

u (bất kỳ tỷ lệ phần trăm của các tế bào khối u dương tính). Một

tính với

số yếu tố nhuộm cần được loại trừ, bao gồm:

ALK

- Các chấm nhạt tế bào chất trong các đại bào phế nang,
- Tế bào có nguồn gốc thần kinh (tế bào thần kinh và hạch), biểu
mô tuyến, tế bào lympho rải rác trong các phần thâm nhiễm tế bào
lympho.
- Nhuộm nền (bao gồm chất nhầy và trong các khu vực khối u

hoại tử)
Âm tính Không hiện diện bắt màu mạnh tế bào chất trong các tế bào bướu.
với ALK

Âm tính -Không bắt màu

Âm tính khi bắt màu khuếch tán không đặc hiệu

15

Dương tính khi một số tế bào

Dương tính khi tất cả tế bào u bắt mầu mạnh ở bào tương

u bắt mầu mạnh ở bào tương

Hình 1.2. Tiêu chuẩn đánh giá sự bộc lộ ALK bằng nhuộm HMMD [42].


16

Quy trình phân tích mẫu mô và phân tích kết quả xét nghiệm


17

1.2.3. Kỹ thuật PCR
Các kỹ thuật dựa trên PCR có thể phát hiện biểu hiện ALK trong
NSCLC với các phương pháp bao gồm PCR ghép đa phiên mã ngược và phân
tích biểu hiện tương đối của các phần 5 'và 3' của bản sao gen ALK bằng RTPCR [41],[42].
a. PCR sao chép ngược (RT-PRC)
RT-PCR là một kỹ thuật chính xác, độ nhạy cao và có thể tái tạo, có thể
phát hiện các bản sao hợp nhất EML4-ALK. Ngoài ra, các bộ khuếch đại có
thể được giải trình tự để xác định các biến thể hợp nhất cụ thể [41],[42].Trong
sản phẩm này, RNA được chuyển đổi thành cDNA bằng cách sao chép ngược
và cDNA được khuếch đại PCR với các đoạn mồi cụ thể. Kỹ thuật khuếch đại
yêu cầu các bộ mồi cụ thể cho từng chuyển vị [41],[42],[51].Các bộ kit
thương mại có sẵn thường có các đoạn mồi cho hầu hết hoặc tất cả các bản

sao hợp nhất EML4-ALK[51],[52],[53]. Các bộ khuếch đại được xác định
bằng nhiều phương pháp, bao gồm giải trình tự, suy giảm đầu dò huỳnh
quang, điện di và công nghệ chụp NanoString nCount [39],[42],[51],[54].
b. Khuếch đại nhanh 5'- của cDNA đầu cuối (RACE)
Tất cả các protein tổng hợp EML4-ALK đều mang miền tyrosine
kinase được mã hóa bởi exon 20 và theo sau 3'exon [55]. Wang và CS [56] đã
sử dụng phân tích RACE để định lượng mức mRNA tương đối 5 'và 3' ALK
trong các NSCLC. mRNA EML4-ALK được sao chép ngược thành cDNA và
các phần khác nhau của cDNA được khuếch đại với các bộ mồi đặc trưng cho
các exon giữa E13-E18 và E22-E27. Các miền E22-E27 tăng 22,6% (40/177)
trong các NSCLC, mức tăng dao động từ 32,2 đến 1573,7 lần khi được chuẩn
hóa thành mRNA 5’ ALK. Ưu điểm của phân tích PCR ALK trong NSCLC:
1) Đặc hiệu và độ nhạy cao 2) Có thể phát hiện bản phiên mã EML4-ALK
được pha loãng trong hơn 90% RNA loại hoang dại và 3) Ít tốn kém hơn


18

FISH. Nhược điểm của kỹ thuật PCR là: 1) Nó bỏ sót các chuyển đoạn hiếm
hoặc mới, 2) Nó có thể có vấn đề về ô nhiễm và 3) Suy giảm RNA/ chất
lượng mẫu kém có thể ngăn chặn khả năng phát hiện [39],[41],[42].
1.2.4. Các phương pháp phát hiện EML4-ALK khác trong NSCLC
Chuyển đoạn EML4-ALK đã được phát hiện bằng các phương pháp
chẩn đoán phân tử ít được sử dụng khác, bao gồm:
a. Giải trình tự thế hệ tiếp theo
Peled và CS [57] đã sử dụng hồ sơ genome toàn diện bằng giải trình tự
thế hệ thứ hai để xác định sự sắp xếp lại ALK hỗn hợp trong ung thư biểu mô
tuyến phổi trước đây được phát hiện là EML4-ALK âm tính bằng xét nghiệm
Vysis FISH. Kết quả cho thấy một sự sắp xếp lại ALK hỗn hợp liên quan đến
ít nhất năm locus gen khác nhau. Các tác giả đã đưa ra giả thuyết rằng các gen

EML4 và ALK được phân tích là các trường hợp có sắp xếp lại nhỏ nên ngăn
cản sự phát hiện bằng xét nghiệm FISH. Các tác giả cho rằng giải trình tự thế
hệ thứ hai có thể hữu ích cho bệnh nhân NSCLC với khả năng gây đột biến
trình điều khiển cao mà không được phát hiện bằng các phương pháp khác.
b. Xắp xếp dãy Exon cho các cấu trúc EML4-ALK
Lin và CS [58] đã sử dụng xắp xếp dãy exon (Affymetrix Human Exon
1.0 Arrays) để phát hiện sắp xếp lại ALK ở mô ung thư vú, đại trực tràng và
NSCLC. Việc kiểm tra các mẫu này cho thấy các cấu trúc EML4-ALK ở
2,4% bệnh ung thư vú (5/209), 2,4% của đại trực tràng (2/83) và 11,3%
NSCLCs (12/106). Tuy nhiên đây là một phương pháp phức tạp, tốn kém và
đầy thách thức về mặt kỹ thuật để phát hiện các cấu trúc EML4-ALK[59].
1.2.5. Nghiên cứu về độ tương đồng của các phương pháp xét nghiệm ALK
Nghiên cứu của tác giả Cristina Teixido, Niki Karachaliou và cộng sự
đã đưa kết luận phù hợp của HMMD, FISH và RT-PCR cho sự tái sắp xếp gen
EML4-ALK [16].


19

Một nghiên cứu của các tác giả người Pháp Anne McLeer – Florin,
PhD, Denis Moro – Sibilot, MD và cs đưa đến kết luận có thể về thực hành
xét nghiệm thường quy bằng phương pháp HMMD và phương pháp FISH cho
UTBMT của phổi [17].
Qua nghiên cứu thuật toán điểm số HMMD so với FISH về xét nghiệm tái
sắp xếp gen ALK trong UTPKTBN của tác giả Eunhee S. Yi, MD, Jennifer M.
Boland, MD và cs đã chỉ ra có mối liên quan HMMD và FISH [60].
1.3. Phân loại MBH cho UTBMT theo WHO 2015 [61]
UTBMT:U thể hiện sự biệt hóa tuyến với một hay nhiều dạng phát triển
gồm lepidic (trước đây là UTBM tiểu phế quản phế nang), túi tuyến, nhú, vi
nhú hoặc dạng đặc.

Tổn thương lepidic : là sự phát triển không điển hình các tế bào vuông
đơn dọc theo thành phế nang có đặc điểm :






Duy trì cấu trúc phế nang
Không có sẹo xơ trung tâm hay lan rộng
Thường có dày thành phế nang
Không có hoặc ít phát triển dạng tầng
Không tạo cấu trúc nhú

Nếu trên mảnh sinh thiết chỉ thấy phát triển đơn thuần thành phần lepidic
thì không loại trừ u có thành phần xâm nhập.
UTBMT chùm nang (Acinar adenocarcinoma): u có dạng nang, túi
tuyến hoặc ống với tế bào hình trụ hoặc hình khối vuông, nhân lệch đáy, chế
nhày, gợi tuyến của phế quản.
UTBMT nhú (Papillary adenocarcinoma):u thường đơn độc bao gồm
cấu trúc nhú được phủ bởi tế bào kích thước lớn, không điển hình với nhân
lớn, tăng sắc, hạt nhân rõ, nhiều nhân chia.
UTBMT vi nhú: cấu trúc u gồm các tế bào phát triển tạo các búi nhú
không có trục liên kết xơ mạch. U có thể liên tục với thành phế nang hoặc