Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu đa hình gen TNF-α-308 và TGF-β1-509 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có HBsAg dương tính

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung   thư   biểu   mô   tế   bào   gan   (Hepatocellular   carcinoma   ­   HCC, 
UTBMTBG) là một trong những bệnh lý ác tính hay gặp hàng đầu thế giới. 
Bệnh đứng hàng thứ 6 trong 10 loại ung thư hay gặp, là nguyên nhân thứ ba  
gây tử  vong do ung thư. Theo GLOBOCAN  ước tính riêng năm 2018 đã có 
841.00 trường hợp mắc mới và 782.000 bệnh nhân tử  vong do UTBMTBG 
[1]. Các nghiên cứu đã ghi nhận nhiễm virus viêm gan B (HBV) mạn là 
nguyên nhân chính gây UTBMTBG. Việt Nam có tỷ  lệ  nhiễm HBV cao 
tương ứng có số người mắc UTBMTBG tương đối lớn. Đây là loại ung thư 
có tiên lượng xấu với thời gian sống thêm ngắn, liên quan đến khả  năng  
chẩn đoán sớm còn nhiều hạn chế. Do vậy, hiện nay trên thế  giới những 
nghiên cứu về  sinh bệnh học của UTBMTBG nhằm mục tiêu nhận diện 
những dấu  ấn sinh học có giá trị  trong chẩn đoán, điều trị  đã được tiến 
hành rộng rãi. 
Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, nhiều nghiên cứu đã 
ghi nhận vai trò kiểu gen, đặc biệt các đa hình gen (SNP: Single nucleotide 
polymorphism) của vật chủ  đóng vai trò quan trọng trong đáp  ứng miễn 
dịch của cơ thể khi nhiễm HBV,  ảnh hưởng đến quá trình hình thành viêm 
gan mạn, xơ gan, phát triển UTBMTBG. Như vậy, nghiên cứu đa hình gen  
giúp phân tầng đối tượng nguy cơ, cải thiện phát hiện sớm và kết quả điều 
trị bệnh [2], [3]. Gen TNF ­ α nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6  
(NST 6p21). Đây là một gen có nhiều điểm đa hình đơn, điểm đa hình tại vị 
trí ­308 được đánh giá có liên quan đến nguy cơ  UTBMTBG. Các nghiên 
cứu cho thấy alen A của điểm đa hình trên liên quan đến tăng cường sản  
xuất TNF –  α  trên cả  in vitro và  in vivo. Ngoài ra, người mang alen A có 


2

tăng nguy cơ  UTBMTBG cao hơn khi so sánh với người mang alen G [4],  
[5].  
Gen TGF – β1 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 19 (19q13.1­13.3),  
có nhiều điểm đa hình, trong đó điểm đa hình tại vị  trí ­509 C>T đã được 
đánh giá có liên quan đến nồng độ  TGFβ huyết tương. Hơn nữa, phân tích 
điểm đa hình TGF – β1­509 C>T thấy những cá thể có alen T tăng nguy cơ 
UTBMTBG so với những cá thể mang alen C [6].
Nhiều nghiên cứu cho thấy các điểm đa hình TNF ­  α  ­308 và TGF ­ 
β1­509  ảnh hưởng đến tiến triển của viêm gan mạn, xơ  gan, hình thành, 
phát triển và di căn của UTBMTBG thông qua việc kiểm soát nồng độ  các  
cytokine tương ứng [3], [7], [8]. TNFα và TGFβ là những cytokine đa chức 
năng, đóng vai trò kiểm soát nhiều quá trình của tế bào như tăng trưởng, biệt 
hóa, hình thành mạng lưới gian bào, đáp ứng miễn dịch, sinh mạch máu, chết  
theo chương trình. Bên cạnh đó, trong vi môi trường sinh u các cytokine này 
tương tác, hỗ  trợ lẫn nhau làm tăng cường quá trình hình thành và tiến triển 
UTBMTBG [5],[3],[9]. 
Việt Nam là quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV và mắc UTBMTBG cao với  
những hậu quả  vô cùng nặng nề. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có một  
nghiên cứu nào đánh giá ảnh hưởng của đa hình hai gen trên với nguy cơ bị 
UTBMTBG. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề  tài “Nghiên cứu đa hình gen  
TNF­α ­308 và TGF­β 1­509 ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có  
HBsAg dương tính” với 2 mục tiêu:
1. Xác định tỷ lệ kiểu gen và alen của 2 điểm đa hình gen  TNF ­ α ­ 308,  

TGF ­ β1 ­ 509 ở bệnh nhân UTBMTBG có HBsAg (+).


3

2. Phân tích mối liên quan của đa hình gen TNF­  α  ­ 308, TGF­  β1­ 509  

với nguy cơ UTBMTBG và một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng  
của bệnh nhân UTBMTBG có HBsAg (+).


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN
Ung thư  biểu mô tế  bào gan (UTBMTBG) là một bệnh ác tính khởi 
phát từ  tế  bào gan (HCC: hepatocellular carcinoma), chiếm đa số  các bệnh 
ác tính của gan (> 90%) [10].
1.1.1. Dịch tễ ung thư biểu mô tế bào gan trên thế giới
Ung thư biểu mô tế bào gan là loại ung thư đứng hàng thứ  6 trong 10 
loại ung thư phổ biến trên toàn cầu (thứ 5 với nam, thứ 9 đối với nữ). Đặc  
điểm dịch tễ  của UTBMTBG khác nhau  ở  các vùng trên thế  giới, những  
vùng có tỷ  lệ  mắc cao bao gồm Sahara châu Phi, Đông Á, Đông Nam Á, 
Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, do đây là nơi lưu hành dịch tễ 
của HBV, loại virus có mối liên quan chặt chẽ  với UTBMTBG [11]. Theo  
Tổ  chức Y tế  Thế giới,  ước tính riêng năm 2018 đã có tới 841.000 trường 
hợp   mắc   mới   UTBMTBG   trên   toàn   cầu,   chịu   trách   nhiệm   cho   782.000 
trường hợp tử  vong cùng năm. Số  trường hợp tử  vong gần bằng số  mới  
mắc, phản ánh UTBMTBG là một bệnh có tiên lượng nặng, thời gian sống 
thêm ngắn [12].
Nam giới có mắc bệnh cao hơn nữ, gấp từ  2­4 lần. Tỷ  lệ mắc tăng 
dần theo tuổi, cao nhất khoảng 65­70 tuổi, trong đó ở những vùng lưu hành 
dịch tễ HBV, đỉnh mắc bệnh thấp hơn chỉ từ 55­60 tuổi [10], [13], [14].

Vài thập kỷ  gần đây, xu hướng mắc UTBMTBG thay đổi khá nhiều. 
Trong khi các vùng có tỷ lệ mắc thấp ( Mỹ, trung tâm châu Âu) bệnh có xu 
hướng gia tăng do liên quan đến béo phì và nhiễm HCV, các vùng trước đây 


5

có tỷ lệ mắc cao lại có xu hướng giảm vì áp dụng chương trình tiêm phòng 
HBV [2].

Hình 1.1. Tỷ lệ mắc ung thư biểu mô tế bào gan chuẩn 
theo tuổi và giới trên thế giới
* Nguồn: Singal, A.(2020) [15]

1.1.2. Dịch tễ ung thư biểu mô tế bào gan Việt Nam 
Nằm   trong   khu   vực   Đông   Nam   Á,   điểm   nóng   của   thế   giới   về 
UTBMTBG, Việt Nam có tỷ lệ mắc bệnh cao. Tổng kết một số nghiên cứu 
được tiến hành tại nhiều địa phương trên toàn quốc, ở  các thời điểm khác  
nhau cho thấy UTBMTBG thực sự là một gánh nặng với nền y tế. Báo cáo 
của Nguyễn Văn Vy và cs về công tác phòng chống ung thư kéo dài 10 năm  
tại Hải Phòng (2003) đã cho thấy  UTBMTBG  có mức độ  phổ  biến đứng 
hàng thứ 3 trong các loại ung thư [16]. Một nghiên cứu được khác tiến hành 
bởi Nguyễn Đình Tùng (2010) tại Thừa Thiên Huế trong thời gian từ 2001 – 
2009 với 7234 trường hợp mắc ung thư  mới, cũng ghi nhận trong 10 loại  
ung   thư   hay   gặp,  UTBMTBG  đứng   hàng   đầu   ở   nam   với   ASRI   (Age  


6

Standardised   Incidence   Rate   –   tỷ   lệ   mắc   chuẩn   hóa   theo   tuổi)/   100.000 

người  là 34,8 và đứng thứ 4 đối với nữ [17]. 
Năm 2018, GLOBOCAN   đã công bố  tỷ  lệ  mắc UTBMTBG chuẩn 
theo tuổi (ASIR) tính chung cho hai giới tại Việt Nam là 23,2 xếp thứ 4 trên  
toàn cầu sau Mông Cổ (93,7), Ai Cập (32,2) và Giambia (23,9) [1]. 
Theo Cơ  quan Nghiên cứu Ung thư  Quốc tế  (IARC), UTBMTBG là 
loại ung thư  phổ  biến nhất, có xu hướng phát triển nhanh là nguyên nhân  
chủ  yếu gây tử  vong do ung thư   ở  cả  hai giới tại Việt Nam. Dựa vào 
những   số   liệu   thống   kê   đã   được   công   bố   từ   2010   ­   2018   cho   thấy 
UTBMTBG có tốc độ  phát triển nhanh thứ 2 đối với nam và thứ 5 đối với  
nữ. Tính riêng năm 2018 tại Việt Nam, đã có tới 25.335 trường hợp mắc  
UTBMTBG mới và có tới 20.710 trường hợp tử vong cùng năm [18]. 
 Tương  ứng với tình trạng UTBMTBG có tỷ  lệ  mắc và tử  vong cao,  
thực trạng nhiễm HBV cũng rất đáng lo ngại, theo Robert G. và cs (2011) 
tiến hành nghiên cứu tại 12 bệnh viện trên toàn quốc từ  2005 – 2008 cho  
thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất  
thế  giới với gần 12% người có HBsAg (+), khoảng 10 triệu người chung  
sống với HBV mạn. Tình hình nhiễm HBV khác nhau giữa các vùng: như 
tại thành phố Hồ Chí Minh, Hà Nội khoảng 10­14%, Thái Bình, Thanh Hóa  
chiếm 18,8­19%. Tỷ  lệ  nhiễm HBV thậm chí còn cao hơn  ở  những bệnh 
nhân có biểu hiện bệnh lý gan,  ước tính lên tới 31,2 ­ 47%. Nhóm nghiên 
cứu đã tính toán và đưa ra  ước lượng với tình hình nhiễm HBV như  trên 
vào năm 2025, HBV sẽ  là nguyên nhân gây nên 56.650 bệnh nhân xơ  gan,  
25.000 người bị UTBMTBG và 40.000 người tử vong [19].


7

Rõ ràng tại Việt Nam, gánh nặng UTBMTBG do nhiễm HBV là rất 
lớn, do vậy thực sự cần có biện pháp hỗ trợ sàng lọc giúp chẩn đoán, điều 
trị sớm cho bệnh nhân, nhằm cải thiện tiên lượng bệnh.

1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của ung thư biểu mô tế bào gan
Các yếu tố  nguy cơ  chủ  yếu của UTBMTBG bao gồm nhiễm HBV,  
HCV, bệnh gan do rượu, bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu, xơ  gan. Các 
yếu tố nguy cơ khác ít gặp hơn như ứ sắt huyết thanh di truyền, thiếu hụt  
alpha 1­ antitrypsin, bệnh gan tự miễn, nhiễm aflatoxin B (AFB1), đái tháo  
đường typ 2, béo phì...Trong các yếu tố  nguy cơ gây UTBMTBG, HBV và 
HCV là nguyên nhân hàng đầu chiếm tới 80% các trường hợp, trong đó 
nguyên nhân do HBV chiếm 75­80%, HCV chiếm 10­20%. Yếu tố nguy cơ 
chính  ở  những vùng có tỷ  lệ  bị  UTBMTBG cao như  các quốc gia châu Á, 
châu Phi là nhiễm HBV và tiếp xúc với aflatoxin, ngược lại các vùng có tỷ 
lệ bị UTBMTBG thấp gồm Mỹ, châu Âu lại là nhiễm HCV, nghiện rượu, 
đái tháo đường và béo phì. Nhiễm HBV  chiếm khoảng 60% các nguyên 
nhân gây  UTBMTBG  ở  các nước đang phát triển, trong khi đối với các 
nước phát triển tỷ lệ này chỉ khoảng 23% [20].
1.1.4. Chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan
Chẩn đoán xác định 
Trên thế giới các khuyến cáo chẩn đoán UTBMTBG chủ yếu dựa vào 
kích thước khối u và tính chất ngấm thuốc, thải thuốc của khối u trên các  
phương pháp chẩn đoán hình ảnh [21]
­

Khuyến cáo của AASLD, EASL khối u có kích thước khối u (>1cm),  

cần tiến hành chụp CT hoặc MRI có tiêm thuốc. Nếu khối có hình  ảnh  
điển hình của UTBMTBG là ngấm thuốc nhanh, hiện rõ thì động mạch và  
thải thuốc nhanh  ở  thì tĩnh mạch và thì muộn thì có thể  khẳng định chẩn 


8

đoán. Sinh thiết chẩn đoán mô bệnh học được đặt ra nếu phương pháp 
chẩn đoán hình ảnh không thấy hình ảnh điển hình. 
­

Khuyến cáo APASL và JSH khối tăng sinh mạch  ở  pha động mạch  

sau đó  thải  thuốc nhanh  ở  pha tĩnh mạch  được chẩn đoán UTBMTBG. 
Những khối tăng sinh mạch ở pha động mạch nhưng không có thải thuốc ở 
pha tĩnh mạch hoặc pha muộn cần đánh giá thêm bằng SPIO­MRI hoặc  
MRI sử  dụng chất đặc hiệu với tế  bào, hoặc siêu âm sử  dụng Levovist  
hoặc Sonazoid. Trường hợp những tổn thương ít mạch máu trên pha động 
mạch của CT hoặc MRI, theo APASL cần đánh giá thêm bằng SPIO­MRI  
hoặc siêu âm cản âm như trên để khẳng định chẩn đoán, trong khi JSH cần  
thêm cả Gd­EOB­DTPA­MRI để chẩn đoán xác định, nếu  kết quả chỉ có 1 
trong 2 phương pháp điển hình cần thêm sinh thiết để chẩn đoán. 
Tại Việt Nam, năm 2012 Bộ Y tế đã đưa ra hướng dẫn chẩn đoán xác 
định UTBMTBG khi có 1 trong 3 tiêu chuẩn sau: [22]
­ Có bằng chứng giải phẫu bệnh 
­ Hình ảnh điển hình trên chụp CT có tiêm thuốc cản quang hoặc MRI  
có thuốc cản từ + αFP ≥ 400 ng/ml
­ Hình ảnh điển hình trên chụp CT ổ bụng có cản quang hoặc MRI có 
cản từ +  αFP tăng cao hơn bình thường (< 400 ng/ml) + nhiễm HBV hoặc  
HCV
Chẩn đoán giai đoạn 
Hiện nay, trên thế  giới có nhiều bảng phân loại giúp đánh giá giai  
đoạn UTBMTBG như phân loại TNM, CLIP, Barcelona, Okuda. Trong đó, 
phân loại Barcelona được sử  dụng rộng rãi do tính  ưu việt trong lựa chọn  
phương pháp điều trị và tiên lượng thời gian sống cho bệnh nhân [21]. 
1.1.5. Mối liên quan giữa nhiễm HBV và ung thư biểu mô tế bào gan

9

UTBMTBG có mối liên quan chặt chẽ với nhiễm HBV, các nghiên  
cứu dịch tễ cho thấy những vùng có tỷ  lệ  dân số  bị  nhiễm HBV mạn tính 
> 8% như  châu Á, Sahara, châu Phi song hành với tỷ  lệ  mắc UTBMTBG  
cao [20]. Hơn nữa, khoảng 80% các trường hợp UTBMTBG trên thế  giới 
xẩy ra  ở  các nước đang phát triển, nơi có tỉ  lệ  nhiễm HBV cao nhất [23].  
Trên thực tế nguy cơ UTBMTBG tăng cả đối với những trường hợp nhiễm  
HBV   không   hoạt   động.   Một   nghiên   cứu   trên   20.000   người   mang   HBV 
không hoạt động thấy nguy cơ tương đối bị ung thư tăng với RR 4,6, nguy  
cơ tử vong liên quan đến bệnh gan tăng với RR là 2,1 [24]. 
HBV gây UTBMTBG qua cả  cơ  chế trực tiếp và gián tiếp, trong khi 
cơ  chế  gián tiếp gây tổn thương gan kéo dài, tăng tái tạo tế  bào gan dẫn 
đến tích lũy các đột biến, thì hiện tượng HBV có khả năng tích hợp vào bộ 
gen người, gây giảm hoạt động methyl hóa DNA, kết quả làm mất ổn định  
về nhiễm sắc thể của vật chủ, từ đó phát triển ung thư là cơ chế chính của 
con đường trực tiếp [25]. Tổng kết các nghiên cứu cho thấy những bệnh  
nhân nhiễm HBV có nguy cơ  UTBMTBG cao hơn khi có kèm một hoặc  
nhiều các yếu tố  sau: HBeAg (+) kéo dài, nồng độ  HBV DNA tăng cao (≥ 
104 copies/ml), HBV genotype C (gấp 2­3 lần so với genotype B), xu ất hi ện  
các đột biến của virus viêm gan B như  các đột biến tiền nhân, vùng nhân  
hay mất đoạt pre S [13], [24], [26].   


10

Hình 1.2. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B và 
ung thư biểu mô tế bào gan
                                      * Nguồn: Kew M.C. (2010) [23]

Tuy nhiên, trên thực tế  lâm sàng  không phải bệnh nhân nhiễm HBV 
nào cũng phát triển thành UTBMTBG. Do đó, cả  bản thân HBV và cơ  thể 
vật chủ  đều có vai trò quan trọng, tương tác với nhau gây nên bệnh cảnh  
cuối cùng. 
Tổn thương gan do HBV được cho là thông qua đáp  ứng miễn dịch  
trung gian chủ yếu do hoạt động đặc hiệu của tế bào lympho T với HBV.  
Khi cơ  thể bị  nhiễm HBV, vi môi trường viêm có thể  làm tăng tần số  đột 
biến của virus thông qua tác dụng cảm  ứng tế  bào.  Tính nhạy cảm di 
truyền được quy định bởi các yếu tố viêm, các cytokine và chemokin do các 
tế  bào viêm tiết ra kèm theo đó là sự  mất cân bằng giữa các cytokine của  
Th1 và Th2 góp vai trò quan trọng vào phản  ứng viêm, hoại tử, tái tạo tế 
bào gan và phát triển ung thư. Bên cạnh đó, các con đường gây viêm bao  
gồm  các  đường dẫn tín hiệu NF­κB, STAT3, Wnt/β  catenin và TGF­β1 
cũng góp phần vào sự hình thành ung thư. Nghiên cứu những yếu tố trên có 
ý nghĩa đối với việc giám sát tích cực các đối tượng nhiễm HBV, những 
người có nhiều khả  năng phát triển UTBMTBG, từ  đó giúp phân tầng đối 


11

tượng nguy cơ, phục vụ chẩn đoán sớm, cải thiện hiệu quả điều trị bệnh. 
Do vậy, cho đến nay trên thế  giới đã có rất nhiều  nghiên cứu  tiến hành 
đánh giá sự di truyền đa hình quy định các cytokine như TNF­α, TGF­  β1, 
IL­6, IL­10 ...với nguy cơ UTBMTBG [26].
1.2.   GEN  TNFα ,   TGFβ  VÀ   ĐIỂM   ĐA   HÌNH   GEN  TNFα ­308   G>A,  
TGFβ 1­509 C>T
1.2.1. Khái niệm đa hình nucleotide đơn (SNP)
Bộ gen người, phần lớn được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, ít nhất 
99,5% số  gen giữa hai cá thể  bất kỳ  sẽ  giống hệt nhau, như  vậy sự  khác 

biệt chỉ chiếm 0,1% ­ 0,5%. Đây là điểm mấu chốt tạo ra mỗi cá thể là duy 
nhất do có các đặc điểm, tính trạng khác nhau (hình dạng, bệnh di truyền  
…). Nhiều yếu tố  trong hệ  gen góp phần tạo nên khác biệt trên, trong đó 
SNP   đóng   vai   trò   quan   trọng.   Thuật   ngữ   polymorphisms   nghĩa   là   nhiều 
dạng   (poly:   nhiều,   morphisms:   dạng).   Single   nucleotide   polymorphism  
(SNP) đọc “snip”, được định nghĩa là sự  thay đổi base đơn lẻ  trên một 
chuỗi trình tự DNA, thay đổi này chiếm tỉ lệ ≥ 1% trong cộng đồng lớn và 
được tiếp tục di truyền [27]. 
Do có 4 loại nucleotide nên mỗi một vị  trí SNP của gen có thể  có tối 
đa 4 đa hình tương  ứng với bốn loại nucleotide A, C, G và T. SNP có thể 
xẩy ra trong cả bộ gen của ngườ i với tần số  1/250 đôi nucleotide. Điều 
này có nghĩa là có khoảng 11 tri ệu SNP  trong 3 tỷ nucleotide c ủa b ộ gen  
ngườ i. Hầu hết, SNP không ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc sự phát triển của 
cơ  thể. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu đã thấy một số  SNP có thể  giúp dự 
đoán ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và nguy cơ phát triển bệnh. SNP  
cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của các gen bệnh trong gia  
đình [28], [29], [30]. 


12

Hình 1.3. Đa hình gen thay thế nucleotid
* Nguồn: Aguiar­Pulido V. và CS (2010) [31]

Cơ chế tác dụng của các SNP
SNP có thể  nằm  ở  các vùng khác nhau của gen như  vùng khởi động, 
exon, intron hoặc  ở  vùng không phiên mã (UTR: untranslated regions) 5’và 
3’. Các điểm đa hình này  ảnh hưởng đến hoạt động của gen bằng những 
cơ chế khác nhau, phụ thuộc vào vị trí của chúng trên gen. 

Hình 1.4. Các vùng của gen
* Nguồn: Huang W.L. và CS (2014) [32]

Vùng khởi động gen (promoter) đóng vai trò quan trọng giúp kiểm soát 
sự bắt đầu và mức độ sao chép gen, các SNP tại vùng này tác động đến gen  
thông qua hai cơ  chế. Thứ  nhất là  ảnh hưởng đến hoạt động vùng khởi 
động do tác dụng lên hộp chức năng TATA (một đoạn DNA nằm cách vị trí 
phiên mã khoảng 30 nucleotid có trình tự  phổ  biến là TATAAAT) và hoạt 
động gắn các yếu tố  sao chép. Thứ  hai chúng tác động đến biểu hiện gen  


13

thông qua tác động lên quá trình methyl hóa DNA như thay đổi số lượng vị 
trí methyl hóa, ảnh hưởng đến hoạt động gắn yếu tố sao chép gen với các  
đảo CpG, hoạt hóa các enzyme của quá trình sao chép và gây thay đổi các 
histon. 
SNP  ở  vùng exon có thể   ảnh hưởng đến gen bằng cách  ức chế  quá  
trình dịch mã, phiên mã của gen. 
SNP  ở  vùng intron có những  ảnh hưởng khác nhau với quá trình sao 
mã như thúc đẩy hoặc ức chế khả năng kéo dài RNAs không mã hóa. 
SNP ở vùng 5’­UTR ảnh hưởng đến dịch mã, trong khi ở vùng 3’­UTR 
lại ảnh hưởng đến khả năng gắn microRNA [28].

Hình 1.5. Vùng khởi động của đa hình gen và sự nhạy cảm 
phát triển ung thư
* Nguồn: Deng N. và CS (2017) [28]

TF:(Transcription   factor   ­   yếu   tố  phiên  mã),   TFBS:(Transcription   factor  
binding site ­ vị trí gắn yếu tố phiên mã). 

Cytokine 
Cytokine là một nhóm các phân tử  protein truyền tin phức tạp. Các 
phân tử truyền tin này có thể được tiết vào huyết tương hay gắn ở màng tế 


14

bào, cho phép thực hiện sự  truyền tin giữa các tế  bào, các mô khác nhau. 
Các cytokine có tác dụng phức tạp, thậm chí đối ng hịch nhau trong hệ 
thống   miễn   dịch   tùy   vào   vị   trí   tác   dụng   và   nồng   độ.   V í   dụ  IL­1β, 
TNFα...vừa có tác dụng như yếu tố tiền viêm, vừa có tác dụng như yếu tố 
chống viêm. Các cytokine kích thích đáp  ứng của vật chủ  để  hạn chế  tổn 
thương tế  bào, do dó duy trì sự   ổn định nội môi. Mặt khác, chúng cũng 
đóng góp vai trò quan trọng trong sự  hình thành, phát triển ung thư  do tác 
động lên các tế  bào miễn dịch, kiểm soát sự  phát triển, biệt hóa và di căn 
của tế  bào, đặc biệt khi có hiện tượng mất cân bằng về  nồng độ  hay rối  
loạn quá trình truyền tin của các cytokine [33].
Nồng độ  cytokine có vai trò quan trọng trong quá trình đáp  ứng miễn 
dịch, phụ  thuộc vào hoạt động các gen tổng hợp chúng. Tính đa hình của  
các gen quy định cytokine chủ  yếu là SNP, các microsatellite  nằm  ở  vùng 
khởi động hay các vùng kiểm soát sẽ ảnh hưởng đến quá trình sao chép, từ 
đó quy định nồng độ cytokine ở các cá thể khác nhau. Như vậy, bằng việc 
cho phép sản xuất các cytokine với các mức độ  khác nhau, đa hình của các 
gen sẽ quyết định các hoạt động đáp ứng miễn dịch. Đây là lý do tại sao sự 
hiện diện một số các alen của các SNP nhất định có thể ảnh hưởng đến hậu  
quả  của quá trình nhiễm virus, vi khuẩn và tiến trình hình thành bệnh lý  ở 
người.
1.2.2. Gen TNFα  và điểm đa hình TNF­α –308 G>A 
1.2.2.1. Gen TNF­α  và một số điểm đa hình 
Gen TNF­α 

Gen TNF­α (Tumor necrosis factor ­ alpha) nằm ở locus 21.3 của nhánh 
ngắn nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), thuộc vùng III của phức hợp hòa hợp mô 
chủ yếu (MHC: Major Histo Compatibility complex)


15

Hình 1.6. Vị trí gen TNF­α trên nhiễm sắc thể số 6
* Nguồn: Berlingerio M. và CS (2009) [34]

Gen  TNF­α  có chiều dài khoảng 3kb gồm 4 exon, ch ứa 2770 c ặp  
bazơ, từ  cặp bazơ 31 .575.567 đến 41.578.336. Gen trên mã hóa cho phân 
tử  TNF­α  với 157 amino acid polypeptid, có khối lượ ng phân tử  25.644 
Da [35], [36], [37], [38].

Hình 1.7. Sơ đồ gen TNF­ α và một số điểm đa hình
* Nguồn: Pujhari S.K. và CS (2012) [36]

Các nghiên cứu đã ghi nhận gen TNF­α có rất nhiều điểm đa hình, đặc 
biệt tại  vùng khởi động như: ­1031 (T>C), ­863 (C>A), ­857 (C>A), ­851  
(C>T), ­419 (G>C), ­376 (G>A), ­308 (G>A), ­238 (G>A), ­162 (G>A), và 
­49 (G>A). Trong đó, những vị trí đột biến tại điểm ­149, ­163, ­ 49 ít gặp ở 


16

người da trắng. Các SNP khác như  thêm một cytosine tại vị  trí +70 của 
exon đầu tiên, hay G>A tại vị trí +488 của intron đầu tiên...[4].
Điểm đa hình gen TNF­α – 308 G>A
Những điểm đa hình nucleotid đơn của gen   TNF­α  có tác dụng trực 

tiếp đến khả năng sản xuất TNFα huyết tương do chúng thường nằm ở vị 
trí khởi động của gen. Trong đó điểm đa hình tại vị trí ­308 có vai trò quan 
trọng được ghi nhận qua nhiều nghiên cứu. SNP này có 2 alen bao gồm:  
loại chứa   ­308G (còn được gọi là  TNFA*1), loại còn lại hiếm gặp hơn, 
chứa  ­308A (còn được gọi là TNFA*2). Tổng kết các nghiên cứu dịch tễ 
thấy tần suất  xuất  hiện kiểu  gen và alen của   đa hình  đơn  TNF­α  308  
(G>A) có độ đa dạng cao, khác nhau ở từng quần thể [5], [37].
1.2.2.2. Tỷ lệ alen và gen TNF­ a – 308 G>A
Tỷ lệ đa hình gen và alen của TNF­α – 308 G>A  ở các quần thể khác 
nhau khá đa dạng, nhìn chung alen G xuất hiện  ưu thế, alen A xuất hiện  
với tần suất ít hơn. Sookoian S. và cs (2005) tiến hành phân tích dựa trên 
824 tài liệu tham khảo và 31 nghiên cứu đã công bố tần suất mang kiểu gen  
GA + AA đối với kiểu gen  TNF­ α – 308 G/A ở quần thể Trung Quốc 18%,  
Nhật Bản 3%, người da trắng 45%, Phần Lan 36%  và Brazil 23% [39]. Tỷ 
lệ  kiểu gen này rất khác nhau giữa các quần thể, với p < 0,001 [40], [41],  
[42].  
Bảng 1.1. Tỷ lệ kiểu gen TNF­α – 308 G>A ở một số quẩn thể 
STT

Quần thể

Nam Ấn Độ [37] 
Tây Ban 
2
Nha [37] 
3
Phần Lan [37]
1

N

250
313
490

TNF­α  ­ 308 genotype
GG (%)
GA (%)
AA (%)
2
94
4
86
74

14
25

1


17

4
5
6
7
8
9
10

Úc [37]
Đài Loan [37]
Đức [37]
Hồng 
Công [37]
Nhật [37]
Pháp [37] 
Ai Cập [43]

170
246
176

31
84,2
67

64
15,4
30

5
0,4
2,84

121

92,6

7,4

177
710
150

97,2
85
68,8

2,8
15
25,3

6

Tỷ lệ alen A TNF­α­308A ở các quần thể khác nhau rất đa dạng [41], [44].


18

Bảng 1.2. Tỷ lệ alen A của TNF­α­308 G>A ở một số quần thể  
STT
1
2
3
4
5
6

Quần thể

Ireland (n=100) [45]
Macedonia (n=250) [44]
Đài Loan (n=246) [37]
Ấn Độ (n=216) [46]
Brazil (n=200) [46]
Việt Nam (n = 2350) [47]

Alen A TNF­α  ­ 308 (%)
23,0
13,2
15,8
6,0
14,0
7,0

1.2.3. Gen TGF­β 1 và điểm đa hình TGF­β 1 – 509 C>T
Gen TGF­β1
Gen  TGF­β1  (Transforming   Growth   Factor,   Beta   1)   là   gen   mã   hóa 
protein, nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 19 (19q13.1­13.3) 

Hình 1.8. Gen TGF­β 1 trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 19
  * Nguồn: Lister Hill National Center for Biomedical Communications (2017)[48] 

Gen TGF­β1 có chiều dài 23,56 kB, gồm 7 exon, 6 intron, chứa 52 .347 
đôi bazơ, bắt đầu từ  đôi bazơ  41.301.587 đến 41.353.933. Gen TGF­β1 mã 
hóa cho phân tử  protein là TGFB1, đây là một cytokine đa chức năng chứa 
390 acid amin, khối lượng phân tử là 44.341 Da [6], [49], [50].  


19

Hình 1.9. Gen TGF­β 1 và một số điểm đa hình 
* Nguồn: Heidari Z. và CS (2013) [51]

Điểm đa hình TGF­β1­509 C>T
Cho đến nay các nhà khoa học đã xác định được hơn 147 điểm đa hình  
đơn nằm trên gen  TGF­β1. Một vài điểm đa hình đơn đáng lưu ý gồm 3 
điểm  nằm ở vùng upstream ­988 (C>A), ­800 (G>A) và ­509 (C>T), 1 điểm 
đa hình nằm  ở  vùng không sao mã thêm C tại vị  trí   +72, 2 điểm nằm  ở 
vùng exon 1 tại codon 10 (+869 C>T) và codon 25 (+915 G>C), 263 (C>T)  
và 1 ở vùng exon 5, codon 629 [52], [53], [54].
1.2.3.1. Gen TGF­β 1 và điểm đa hình TGF­β 1­ 509 C>T
Trong các SNP nói trên, SNP tại vị trí C­509T nằm tại vùng khởi động 
của gen là một điểm đa hình quan trọng liên quan đến khả  năng sao chép  
gen và sản xuất TGF – β huyết tương [55].
1.2.3.2. Tỷ lệ kiểu alen và kiểu gen của TGF­β 1­509 C>T
Tỷ  lệ  kiểu alen và gen của   TGFβ1 – 509   khá đa dạng  ở  các quần 
thể khác nhau, trong đó tỷ lệ alen C và T của gen  TGF­β1­509 xuất hiện 
với tỷ lệ khá cân bằng, nhưng không thấy sự nhất quán về  kiểu alen  ưu  
thế [50], [52], [56].  


20

Bảng 1.3. Tỷ lệ kiểu gen, alen của TGF­β 1­509 ở một số quần thể 

TT

1.
2. 

3. 
4. 
5. 
6. 

Quần 
thể

N

Trung Quốc
230
(2015) [57]
Ấn Độ 
250
(2017) [50]
Tây Ban Nha 
185
(2005) [56]
Iran 
140
(2012) [58]
Nữ
Mexico
253
(2013) [52]
Nữ
Nhật Bản
297
(2004) [59]

TGF­
β 1­509 
Alen

TGF­β 1­509 Gen

C (%)

T (%)

198
(43,04)
441 
(88,2)
243
(65,68)
132
(47,1)
238
(47,04)
309
(52)

262
(56,96)
59
(11,8)
127
(34,32)

248
(52,9)
268
(52,96)
285
(48)

CC 
(%)
67
(29,13)
193 
(77,2)
79 
(43)
35
(25)
56 
(22,13)
76
(25,6)

CT
 (%)
64
(27,83)
55
(22)
85
(46)

62
(44,3)
126
(49,80)
157
(52,9)

TT
 (%)
99
(43,04)
2
(0,8)
21
 (11)
43
(30,7)
71
(28,07)
64
(21,5)

1.2.4. Phương pháp xác định điểm đa hình gen
Phương pháp giải trình tự  trực tiếp hiện đang được sử  dụng rộng rãi 
để xác định trình tự nucleotid của các gen [60]
Phương pháp Sanger 
­ Enzyme DNA polymerase tổng hợp sợi DNA bổ sung từ sợi đơn với là 
nucleotide.   Nguồn   nguyên   liệu   cung   cấp   cho   phản   ứng   trên   ngoài   các 
nucleotide cơ bản (A, T, G, C) có thêm 1% ddNTP (dideoxynucleotide) gồm 
ddCTP, ddATP, ddGTP, ddTTP có đánh dấu đồng vị phóng xạ hoặc huỳnh  

quang. Khác với phân tử  nucleotide thông thường, ddNTP thiếu nhóm 3’­
OH do vậy nó không tạo được liên kết với nucleotide mới. 
­ Khi men DNA polymerase kéo một ddNTP vào chuỗi, sợi bổ sung sẽ bị 
chặn lại, kết quả  tạo các sợi bổ  sung với độ  dài khác nhau. Do có nhiều  


21

copy của DNA đích được tạo ra đồng thời nên các sản phẩm DNA được 
tổng hợp mới (tận cùng là dd NTP) có tất cả các kích thước.
­ Dùng gel polyacrylamide biến tính (có độ phân giải cao) giúp phân biệt 
các đoạn ADN khác nhau 1 nucleotide
­ Sản phẩm PCR được phân loại kích thước (khác nhau 1 nucleotide) sẽ 
được phân tích bằng tia laser đánh giá cường độ  huỳnh quang và màu sắc  
của mỗi đoạn DNA. Trình tự đoạn DNA đọc theo chiều 5’ đến 3’[61].

Hình 1.10. Nguyên lý giải trình tự trực tiếp
*  Nguồn: Dey P. (2018) [61]

Giải trình tự bằng máy tự động
Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc  
sử  dụng ddNTP do Sanger phát minh. Hệ  thống  điện di là điện di mao 
quản. Khi có một vạch điện di đi qua, phân tử  ddNTP cuối cùng  ở  đầu 3’  
của đoạn DNA phát ra màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu 
sắc và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang, máy nhận 


22

diện được các nucleotide khác nhau, từ đó xác định được trình tự của DNA 

đích [62]. 
1.3.  MỐI LIÊN QUAN GIỮA  ĐIỂM ĐA HÌNH  TNF­α –308 G>A  VÀ 
NGUY CƠ  UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN
1.3.1.   Liên   quan   điểm   đa   hình  TNF­α –308  G>A  và   nồng   độ   TNFα  
huyết tương 
1.3.1.1. Cytokine TNFα  và tác dụng hình thành u 
Cytokine TNFα 
Yếu tố hoại tử u  α (TNFα Tumor necrosis factor  α ) là một cytokine 
đa chức năng thuộc siêu họ TNF, phát huy tác dụng khi kết hợp với hai loại 
receptor (TNFR­1: TNF­ alpha receptor 1, TNFR­2: TNF­ alpha receptor 2). 
TNFα  là một protein chứa 157 acid amin,  được tổng hợp dưới dạng gắn 
protein màng (pro – TNF) sau đó được giải phóng bằng enzyme chuyển  
TNF (TACE).  Bình thường trong cơ  thể  nhiều loại tế  bào tham  gia  sản 
xuất cytokine trên như đại thực bào, bạch cầu mono, lympho bào T, tế bào 
gan... Được xác định lần đầu vào năm 1970, những hiểu biết về  cytokine  
này khá đơn giản như được sản xuất bởi các tế bào miễn dịch, có khả năng 
ức chế tế bào u tăng sinh và gây thoái triển khối u. Tuy nhiên , sau khi được 
phân lập vào năm 1984, hàng loạt các nghiên cứu đã phát hiện vai trò to lớn  
của TNFα đối với đáp ứng miễn dịch của cơ thể cũng như ảnh hưởng đến  
tình trạng nhiễm virus, vi khuẩn và  nguy cơ  phát triển nhiều bệnh [63], 
[64].   
Trong cơ  thể, TNFα vừa có tác dụng chống ung thư, vừa có tác dụng 
kích thích hình thành khối u, phát huy  ưu thế tác dụng nào là tùy thuộc vào 
nồng độ  và tương tác của cytokine này với vi môi trường xung quanh. Tác 
dụng chống ung thư  của TNFα được thực hiện thông qua hoạt động kích 


23

hoạt các con đường dẫn truyền trong tế bào, kiểm soát quá trình sống sót, 

tăng sinh và chết của tế bào. TNFα gây trình diện các phân tử kết dính trên  
thành mạch, cho phép các tế  bào miễn dịch như  bạch cầu trung tính, đại 
thực bào đến tập trung  ở  các mô tổn thương, thực hiện chức năng chống 
nhiễm trùng hay hoạt động dọn vi khuẩn và virus. Mặt khác, TNFα lại kích 
thích sự tăng sinh, sống sót, di cư và tăng sinh mạch ở phần lớn các tế bào 
và mô ung thư. Tác dụng này xẩy ra khi xuất hiện những tế  bào có khả 
năng kháng với tác dụng diệt tế  bào của TNFα, từ  đó hình thành và phát 
triển u [65], [66].  
Tác dụng của TNFα đối với sự hình thành khối u 
Kou và cs (2013) nghiên cứu ở chuột thấy TNFα kích hoạt con đường 
NF­κB làm thúc đẩy quá trình hình thành UTBMTBG. Tác giả đã tiến hành 
thực nghiệm trên 2 dòng tế bào Hep3b và SMMC ­7721, ghi nhận việc dùng 
liều cao TNF­α  (100­1000 ng/ml) gây tăng  hiện tượng  chết theo  chương 
trình nhưng dùng liều thấp (0,1; 1 và 10ng/ml) lại làm giảm quá trình này. 
Kết quả trên cho thấy TNFα đóng vai trò quan trọng trong hình thành, phát 
triển UTBMTBG [67]. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu khác cũng ghi nhận 
có hiện tượng tăng nồng độ  TNFα   ở  huyết tương của các bệnh nhân ung 
thư, các tổn thương tiền ung thư, ung thư, hay hiện tượng nồng độ  TNFα 
giảm khi điều trị ung thư có hiệu quả [63]. Lý giải điều này các tác giả cho  
rằng TNFα kích thích phát triển khối u bằng nhiều cơ chế khác nhau như:
TNFα  gây tăng sản xuất các gốc tự  do (ROS) trong tế  bào góp phần 
tạo ra những phân tử DNA mất ổn định làm xuất hiện các đột biến gen.
TNFα tham gia vào quá trình hình thành, phát triển khối u do gây tăng 
cường   sự   chuyển   dạng   biểu   mô   thành   trung   mô   (EMT:   epithelial  
mesenchymal transition). Trong quá trình này liên kết giữa các tế bào bị phá 


24

vỡ, đó là điều kiện tiên quyết gây nên sự xâm nhập và di căn. Cơ chế chính 

của sự  mất liên kết trên là hiện tượng mất E­cadherin (chất gây kết dính 
các tế  bào).  Ảnh hưởng  đến giảm và mất E­cadherin có sự  tham gia của 
nhiều yếu tố  như  Snail/slug, Twist, ZEB1...Trong đó Snail là yếu tố  được 
phát hiện đầu tiên, có tác dụng ức chế E­cadherin nhiều nhất. Mức độ biểu 
hiện Snail được kiểm soát bởi hệ thống truyền tin bao gồm ILK ( Integrin ­ 
Linked Kinase), PI3­K (Phosphatidylinositol 3 ­ Kinase), MAPKs (Mitogen – 
Activated  Protein  Kinases), GSK ­ 3β  (Glycogen  Synthase  Kinase) và con 
đường truyền tin NF­κB. Khi rối loạn các hệ  thống truyền tin có sự  tham  
gia của TNFα, Snail được tăng cường biểu hiện, hậu quả thúc đẩy khối u 
phát triển [68].
TNFα   gây   kích   thích   tế   bào   khối   u   sống   sót   thông   qua   hoạt   động 
chống lại quá trình chết theo chương trình. Ngoài việc tác dụng như  một 
yếu tố tăng trưởng nội sinh, cytokine này còn gây tăng cường biểu hiện các  
yếu tố  tăng trưởng khác như  EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor ­ 
thụ  thể yếu tố tăng trưởng biểu bì), TNFα... dẫn đến hoạt động tăng sinh  
khối   u,   tăng   các   yếu   tố   tăng   sinh   mạch   như   IL   8   ( Interleukin),VEGF 
(Vascular Endothelial Growth Factor – yếu tố  tăng trưởng mạch máu nội 
mô), HGF (Hepatocyte Growth Factor ­ yếu tố tăng trưởng tế bào gan) [68].


25

Hình 1.11. Vai trò của TNF­α  qua con đường NF­κ B và Akt 
     * Nguồn: Wu Y. và CS (2010) [68]

Sơ  đồ  trên cho thấy TNF­α  thông qua con đường NK­κB và Akt gây  
tăng Snail  và  β–catenin bằng cách  ức chế  GSK­3β  phosphoryl hóa. Bên 
cạnh đó, TNFα/NF­κB gây tăng cường biểu hiện CSN2 (có tác dụng  ức  
chế phosphosryl hóa của Snail do phá vỡ liên kết của Snail với GSK3­β và 
β­Trcp) kết quả làm tăng Snail. Phối hợp hai hiện tượng trên góp phần làm 

tăng EMT và khả năng xâm nhập của các tế bào ung thư.
 Nhận thấy vai trò quan trọng của TNFα  trong sự  hình thành và phát  
triển ung thư, hiện nay các nhà nghiên cứu đã áp dụng phương thức điều trị 
ung thư  bằng cách dùng kháng thể  antiTNFα  trung hòa TNFα, giúp giảm 
tình trạng di căn. Điều này mang lại tương lai đầy hứa hẹn đối với liệu  
pháp chống ung thư [69]. 
Tóm lại, TNFα  có vai trò quan trong sự  hình thành và phát triển ung 
thư do cytokine này giúp phát triển cấu trúc các mô cần thiết cho quá trình 
hình thành và di căn khối u, góp phần vào xâm nhập và di căn của các tế