xây dựng phương án tách dòng gen shrunken 2 tổng hợp tinh bột từ dòng ngô h14

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

TIN SINH HỌC
XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG
GEN SHRUNKEN-2 TỔNG HỢP TINH
BỘT TỪ DÒNG NGÔ H14


Hướng lựa chọn đề tài
Ngày nay, con người ngày càng phát triển, dân số ngày
càng đông, nhu cầu lương thực cũng theo đó mà tăng lên.
Điều đó đã đặt ra thách thức cho giới nghiên cứu khoa học
làm như thế nào để làm tăng năng suất cây trồng đặc biệt
là các cây lương thực như ngô, lúa, lúa mì v.v.
Gen Shrunken 2 (Sh2) đã được chứng minh là gen mã hóa
cho tiểu phần lớn của enzyme ADP-glucose
pyrophosphorylase nội nhũ, một enzyme tham gia vào quá
trình tổng hợp tinh bột ở nội nhũ. Đoạn gen này đã được
nghiên cứu chuyển thành công vào cây ngô làm tăng hàm
lượng tinh bột lên đáng kể so với cây đối chứng không
chuyển gen.


Thực hiện tách dòng gen
shrunken-2 tổng hợp tinh bột từ
dòng ngô h14

01

Tìm kiếm thông tin về
gen Shrunken-2 trên

cơ sở dữ liệu NCBI

02

04

Thiết kế mồi nhờ
chương trình Primer BLAST

05

Tìm các trình tự mã
hóa tính trạng tăng
tổng hợp tinh bột của
các giống trên NCBI
Tiến hành PCR và so
sánh với cơ sở dữ
liệu nhờ chương trình
BLAST

03
06

Xác định vùng bảo
thủ bằng chương
trình
Clustal Omega
Tạo vector và tách
dòng gen

1. Tìm kiếm thông tin về gen
Shrunken-2 trên cơ sở dữ liệu NCBI
NCBI là một trung tâm
thông tin Ouốc gia về
Công nghệ sinh học của
Mỹ được thành lập vào
năm 1988. Đây là một
trong các cơ sở dữ liệu
sinh học lớn nhất thế giới
hiện nay.
Đường dẫn:
.
gov/


1. Tìm kiếm thông tin về gen
Shrunken-2 trên cơ sở dữ liệu NCBI

Công cụ PubMed- nơi tìm kiếm các
bài báo kết quả nghiên cứu khoa học
được công bố

Một bài báo điển hình nói về gen
Shrunken-2 trong tinh bột ngô là sản
phẩm do sự sắp xếp lại các NST phức
tạp


2. Tìm các trình tự mã hóa tính trạng

tăng tổng hợp tinh bột của các giống
trên NCBI
Sử dụng công cụ Nucleotide,
tìm kiếm bài báo về gen
Shrunken-2 ra kết quả như
trên.
Sau đó cho chạy Run BLAST
để tìm ra ít nhất 3 chủng hay
loài cùng biểu hiện tính trạng
tăng sinh tổng hợp tinh bột
mà có độ tương đồng về gen
cao nhất


2. Tìm các trình tự mã hóa tính trạng
tăng tổng hợp tinh bột của các giống
trên NCBI
Sau khi chạy Run BLAST, kết
quả ở dưới cho ra các bài báo
công bố các chủng loài có
trình tự gen có mức độ tương
đồng được xếp từ cao xuống
thấp. Ta ưu tiên chọn 3 bài
báo với 3 chủng khác nhau
có bộ gen hoàn thiện, được
ghi nhận và công bố khoa
học (comlete CDS).


2. Tìm các trình tự mã hóa tính trạng

tăng tổng hợp tinh bột của các giống
Ba giống loài thực vật có gen
tương đồng
nhất được lựa chọn là:
trên
NCBI
Loài 1: Oryza sativa Japonicamột giống lúa lùn có nguồn
gốc ở vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới khu vực đông nam
Á và châu Phi được công bố
vào tháng 4/2002


2. Tìm các trình tự mã hóa tính trạng
tăng tổng hợp tinh bột của các giống
Ba giống loài thực vật có gen
tương đồng
nhất được lựa chọn là:
trên
NCBI

Loài 2:Eleusine coracana, tên
Việt là Kê Chân Vịt, là một
loài thực vật có hoa trong họ
Thảo.


2. Tìm các trình tự mã hóa tính trạng
tăng tổng hợp tinh bột của các giống
Ba giống loài thực vật có gen

tương đồng
nhất được lựa chọn là:
trên
NCBI

Loài3: Zea mays cultivar
H14- một giống ngô ngọt H14
với lượng tinh bột tương đối
cao so với giống ngô trắng.


3. Xác định vùng bảo thủ bằng chươ
Clustal Omega
Chương trình CLUSTAL OMEGA là phần mềm
phân tích kết quả thí nghiệm về cấu trúc
chuỗi DNA, RNA hay protein, bằng phương
pháp so sánh đồng thời giữa các chuỗi đã lựa
chọn cung cấp cho chương trình, để tìm kiếm
phát hiện ra những đặc điểm đồng nhất, đặc
điểm gần gũi hay phân ly giữa chúng. Qua đó,
chương trình sẽ xây dựng cây tiến hóa và
cung câp thông tin liên quan để dự đoán đặc
tính của chuỗi phân tích.
Đường dẫn:
/>

3. Xác định vùng bảo thủ bằng chương trình Clusta
Omega
Copy 3 đoạn gen thuộc 3 loài thực vật trên trong FASTA vào khung dưới ở STEP 1, chọn điều kiện
chạy là RNA rồi ấn Submit

4. Thiết kế mồi nhờ chương trình Primer BLAST
Chọn ra các vùng bảo thủ là các đoạn có nhiều sự tương đồng ( lựa chọn khoảng từ
30-50 nucleotide)
Gen làm khuôn ảo: Zea mays cultivar H14
Mã hiệu: JX462603.1
Chọn 2 vùng bảo thủ:
+ Vùng bảo thủ đầu từ nucleotit 274- đến nucleotit 314
+ Vùng bảo thủ cuối từ nucleotit 1500 đến nucleotit 1540


4. Thiết kế mồi nhờ chương trình Primer BLAST
Sử dụng phần mềm
PRIMER BLAST để thiết
kế mồi. Copy trình tự
gen FASTA của
JX462603.1 vào khung,
số vị trí nucleotide của
2 vùng bảo thủ đã
chọn.
Điều chỉnh các thông
số trong PRIMER BLAST
( kích thước sản phẩm
PCR, nhiệt
độ,...) cho phù hợp như
hình bên:
Đường dẫn:

.

nih.gov/tools/primerblast/


4. Thiết kế mồi nhờ chương trình Primer BLAST
Kết quả chạy PRIMER BLAST tạo ra được 10 đoạn mồi khác nhau như hình sau:


5. Tiến hành PCR và so sánh với cơ sở
dữ liệu nhờ chương trình BLAST
Yêu cầu về đoạn mồi:
+ Độ dài từ 18-24bp
+ Nhiệt độ bắt mồi của hai mồi không chênh lệch quá 5 độ C
+ Tỉ lệ GC: 40-60%, tối ưu là 50-55%
+ Hạn chế khả năng tự liên kết của mồi và liên kết các mồi với nhau: hạn chế
các
đoạn lặp hoặc những đoạn từ 4 nucleotide trùng nhau trở lên .
+ Đặc hiệu đối với gen cần khuếch đại, không đặc hiệu đối với các vùng khác
trong bộ gen hoặc ở sinh vật khác.
Thông thường cặp mồi đầu tiên là tối ưu nhất vì cặp mồi đầu phù hợp nhất với
yêu cầu đầu vào, các cặp mồi sau kém hơn, xếp theo thứ tự chất lượng giảm
dần.
Để kiểm tra xem cặp mồi 1 có phù hợp không ta thực hiện quá trình PCR ảo.
Ta sử dụng phần mềm SMS PCR.


5. Tiến hành PCR và so sánh với cơ sở
dữ liệu nhờ chương trình BLAST
Ta copy trình tự gen
FASTA của JX462603.1
vào khung và lần lượt

cho các đoạn mồi xuôi
và mồi ngược như sau:
Sử dụng cặp mồi là:
T7: 5’
GGCACTGGATCTCAGCT
CTT 3’
T3: 5’
GCATTCTTCAAGATCAC
CACGA 3’


5. Tiến hành PCR và so sánh với cơ sở
dữ liệu nhờ chương trình BLAST
Ta được kế quả PCR


5. Tiến hành PCR và so sánh với cơ sở
dữ liệu nhờ chương trình BLAST
Ta tiến hành BLAST
sản phẩm PCR thu
được nhằm so sanh
cấu trúc chuỗi DNA
phân tích với các chuỗi
tương ứng lưu giữ
trong ngân hàng giữ
liệu, nhằm tìm kiếm
chuỗi của giống loài
khác tương đồng nhất
với chuỗi phân tích và
dự đoán đặc tính của

sản phẩm dựa vào mối
tương quan giữa cấu
trúc và tính trạng.


5. Tiến hành PCR và so sánh với cơ sở
dữ liệu nhờ chương trình BLAST
Copy toàn bộ sản
phẩm PCR vào khung
rồi ấn BLAST.
Ta được kết quả như
sau:


5. Tiến hành PCR và so sánh với cơ sở
dữ liệu nhờ chương trình BLAST
Kết quả cho thấy sản
phẩm PCR có cấu trúc
tương đồng với Zea
mays shrunken 2, số
hiệu NM_001127632.1
với mức độ tương đồng
tới 99,12%. Như vậy có
thể dựa vào
NM_001127632.1 để
dự đoán tính chất của
loài mà mình đang
nghiên cứu.

6. Tạo vector và tách dòng gen
- Sau khi tách dòng, gen Sh2-TD được gắn với vector biểu
hiện pCambia1301 cùng với promoter Ubi để tạo vector
chuyển gen mang gen Sh2-TD.
- Toàn bộ cấu trúc pCambia 1301-Ubi-Sh2 được chuyển
vào vi khuẩn E. Coli DH5α và A. tumerfaciens cho mục
đích chuyển gen vào cây ngô.


Thu hoạch kiến thức
Nắm được cách tra
cứu kiến thức về Công
nghệ sinh học trên
các cổng thông tin
Quốc tế

Nắm được quy trình
tách dòng gen khi
chưa biết trước cấu
trúc gen

Nắm được quy trình
chọn chủng, so sánh,
PCR và kiểm tra chức
năng gen

Biết cách làm khuôn
ảo phù hợp và các
loài, chủng phải gần
gũi, có tính trạng

tương đồng với loài
mà mình nghiên cứu.


THANK YOU