xây dựng phương án tách dòng gen gmexp1 chịu hạn từ cây đậu tương

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
TIN SINH HỌC


XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN
TÁCH DÒNG GEN
GmEXP1 CHỊU HẠN TỪ
CÂY ĐẬU TƯƠNG


TỔNG QUAN VỀ GmEXP1

XÁC ĐỊNH GEN ĐÍCH

XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN VÀ BIỂU HIỆN


TỔNG QUAN VỀ GmEXP1
 Expansin có vai trò quan trọng trong pha giãn
thành tế bào ở miền sinh trưởng của hệ rễ cây
đậu tương.
 Hai vùng chức năng (DPBB và Pollen allerg)
xác định cho protein expansin có khả năng
tác động phá vỡ liên kết phi hoá trị giữa
polysaccharide với vi sợi cellulose giúp thành
tế bào dễ dàng giãn nở (cả chiều ngang và
chiều dọc) dưới tác động của sức trương nước.
 Hoạt động của gen GmEXP1 (xác định protein
expansin) liên quan đến sự kéo dài rễ cây đậu
tương, làm tăng cường khả năng chịu hạn của
cây đậu tương

TỔNG QUAN VỀ GmEXP1
 Sản phẩm phiên mã của gen GmEXP1 có nhiều
trong các tế bào biểu bì và các lớp tế bào miền
sinh trưởng của cả rễ cọc và rễ bên, rất hiếm ở
vùng trưởng thành . Qua đó có thể thấy vai trò
quan trọng của expansin trong việc phát triển kéo
dài của hệ rễ đậu tương.
 Expansin được chia thành ba phân họ α, β và γexpansin dựa trên mối quan hệ nguồn gốc của
chúng .
 Gen expansin (EXP1) từ mARN của cây đậu tương
với kích thước 1089bp


CÁC BƯỚC TÁCH DÒNG
GEN
Xác định
gen đích và
tách RNA
tổng số

Lựa chọn
vecto tách
dòng

Biến nạp
vào TB chủ

Tạo vecto

tách dòng
tái tổ hợp

Lựa chọn
chủng tái tổ
hợp


TẠO GEN ĐÍCH
 Truy cập vào trang NCBI để xác định các đoạn gen
cần tách: từ cây đậu tương
 Truy cập trang Clustal Omega so sánh sự tương
đồng của các gen GmEXP1 để tìm ra vùng bảo thủ.
 Tạo mồi ảo
 Chạy PCR test
 Chạy Blast tìm ra các tính trạng tương đồng


Truy cập trang web NCBI/
Nucleotide/ 
Nhập từ khóa GmEXP1
Link NCBI: 

v/


•Truy cập NCBI, đánh tìm kiếm trong mục Nucleotide tìm
GmEXP1 =>Hiện ra hàng loạt kết quả

 
Tìm vùng bảo thủ
Tìm bài báo liên quan (ít nhất là 
3 bài) 
Copy đoạn gen bằng ngôn ngữ F
ASTA vào chương
 trình Clustal Omega
Link: 
/>clustalo/


Bài báo 1: 
Locus: KF761297
Version: KF761297.1
Organism: Glycine max
PLN: 22-JAN-2014


Bài báo 2: 
Locus: HG792075
Version: HG792075 .1
Organism: Glycine max
PLN: 10-JAN-2014


Bài báo 3: 
Locus: AF516879
Version: AF516879.1
Organism: Glycine max
PLN: 19-MAR-2003

3 đoạn gen liên
quan

Chạy chương
trình


Kết quả

Chọn mạch 1 làm khuôn ( bài báo số 3)


Chọn khuôn và 
vùng bảo thủ
Sử sụng chương
trình Primer –
BLAST để thiết kế 
mồi
Link: 
.g
ov/tools/primer-blast/

Yêu cầu của mồi:
 Độ dài 18-24 bp
 Nhiệt độ ko quá 50
C
 Tỷ lệ GC: 40-60%, tối ưu 50-55
 5 nu cuối cùng đầu 3’ cần có ít nhất 2G

hoặc C
 Những nu ở đầu 3’ phải bắt cặp chính
xác với đoạn gen cần khuếch đại
 Hạn chế khả năng tự lien kết của mồi
và liên kết các mồi với nhau: tránh đoạn
lặp và những đoạn có cùng 4 nu cùng
nhau trở lên.
 Tránh vùng có cấu trúc bậc 2
 Đặc hiệu vùng cần khuếch đại và ko
đặc hiệu với vùng genome khác.



Từ những thông tin về trình tự gen GmEXP1 của đậu tương đã công
bố tại Ngân hàng gen Quốc tế có mã số AF516879, thiết kế cặp mồi
đặc hiệu để tách đoạn mã hoá protein của gen GmEXP1 với kích
thước ước tính khoảng 600 bp.


Chạy được mồi xuôi và mồi ngược, sản phẩm PCR dự kiến
có 600 bp . Lý do chọn mồi 2 này là do mồi có tỷ lệ GC
cao và kích thước sản phẩm PCR tạo thành phù hợp .


Chạy PCR
Test


Chạy Blast
Xác định các tính trạng của đoạn protein

Kết quả chạy Blast:
Total score = max score: chỉ có 1 vùng bảo thủ duy nhất
E value: rất nhỏ nên sự khác biệt không lớn
Per Ident: 100%, nghĩa là sự tương đồng là 100% về tính
trạng


Chọn các Description có Per.Ident (Giống nhau bao nhiêu %) càng
gần 100%
càng tốt, E.value càng về ) càng tốt, Query Cover càng cao càng tốt.
- Theo quy định: có trình tự giống nhau thì chức năng tương tự nhau.
- Chọn cái số 1 lấy protein để chạy


Chọn được đoạn protein


Dự đoán pI, khối lượng phân tử:
Dùng Expasy: />=> Proteomics => Compute pI/MW
pI = 9,03
M = 27108,71 Da


Chức năng: Vào trang: />Ấn BLAST  />Dự đoán chức năng :
- Truy cập: />- BLAST trình tự PCR ảo => Chọn Protein có độ tương đồng
cao