nuôi cấy tế bào thụ tinh in vitro (ivf)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP
CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC


Phần I: Nuôi Cấy Tế Bào


Đặt vấn đê
Nuôi cấy tế bào động vật là một trong những kĩ
thuật cơ bản, được ứng dụng rộng rãi trong
nhiêu lĩnh vực.

Mục đích:
- Làm quen với các thao tác thu nhận tế bào
tủy xương chuột , phân lập, nuôi cấy và đánh
giá tế bào.


Nội dung cơ bản
Nuôi cấy sơ cấp
Nuôi cấy thứ cấp
Đông lạnh và giải đông


Nuôi cấy sơ cấp:
Thu nhận tế bào tủy xương chuột

Thu
nhận
đùi

Giết chuột
Kéo giãn đốt sống cổ
Mổ chuột

Kết quả: Đùi không dính máu, nên hạn chế được việc nhiễm một số tb
khác không phải từ tủy xương


Thu nhận quần thể tế bào trong tủy xương chuột
Xương đùi chuột +
PBS kháng sinh 5X +
rửa bằng PBS kháng
sinh 1X (2 lần)
Chuyển huyên
phù vào bình
roux đi nuôi cấy
ở 37oC, 5%CO2

Loại bỏ hoàn
toàn phần cơ
còn lại
Tế bào tủy
xương được
huyên phù

Cắt rời các đoạn

xương đùi ra
khỏi xương
cẳng chân
Hút 1ml MTNC (DMEM/F12,
10%FBS, 1% kháng sinh)
bơm vào tủy xương để dội
rửa (2 lần)
 Thu tế bào tủy xương

Tế bào tủy
xương được
huyên phù kỹ

Đếm tế bào


Xác định tỷ lệ sống chết trong tế bào tủy xương chuột
Trộn huyên phù tế bào: Pha loãng tiếp 10 lần
Trypan blue (1:1)  pha loãng 2 lần
Pha loãng 20 lần
Chuyển mẫu lên buồng đếm và đếm 5 ô
34

31

 Tổng số tế bào z = 186 (tế bào)
51

35

35

 Số tế bào trung bình trên 1 buồng đếm
a = z/5 = 186/5 = 37.2 (tế bào)

Xác định mật độ tế bào:
A = a x d / V= 37.2 x 20 x104 = 7,4 x 106 (tế bào/ml)
Với: Thể tích buồng đếm V=10-4 ml, độ pha loãng d = 20 lần.


Thay môi trường
• Đối tượng: hUCB-MSC (tế bào máu cuốn rốn)
• Mục đích: Loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình nuôi cấy tế bào và cung cấp thêm
nguồn dinh dưỡng cho tế bào phát triển.
• Vật liệu: dd môi trường nuôi cấy, PBS, ống
bóp, becher.
• Các bước thực hiện:
Hút bỏ môi
trường cũ

Bổ sung PBS
Lắc nhẹ

Bổ sung
môi trường
mới
3ml, lắc
nhẹ

Thay môi trường
Hình ảnh sau khi thay môi trường ở các độ phóng đại

5x


10x


20x


Nuôi cấy thứ cấp
Trước cấy chuyền
Quan sát màu môi trường
Kết quả: màu môi trường chuyển từ màu hồng sang
màu vàng cam.
Giải thích: Khi tế bào sinh trưởng sẽ sản sinh acid
lactic làm pH môi trường giảm  phenol red có trong
môi trường chuyển từ màu hồng sang màu vàng cam.


Trước cấy chuyên
Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, kết quả: Các tế bào có hiện tượng
bám dính trên bê mặt bình Roux, một số tế bào vẫn trôi lơ lửng trong dịch
huyên phù tế bào.

Hình dạng Kích
thước

Dự đoán
Mật đô
loại tế bào

1. Tế bào bám
dính hình thoi

60um(dài),
10um(rộng)

Tế bào gốc trung
mô

2. Tế bào bám
dính hình tròn

20um

Tế bào gốc trung
mô chưa trải dài

3. Tế bào hình
tròn

10 um

Hơn 80%

Tế bào máu

trưởng thành, tế
bào gốc tạo máu

Cơ sở dự đoán Vì hỗn hợp tế bào có trong tủy xương gồm có tế bào máu
trưởng thành, tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô. Tuy nhiên, chỉ có
tế bào gốc trung mô mới có khả năng bám dính vào bê mặt nhựa của bình
Roux. Do đó, các tế bào bám dính quan sát được khả năng cao là tế bào
gốc trung mô.


Tế bào bám dinh hình dài
Tế bào hình cầu
Tế bào chuẩn bị bám dính


Nuôi cây thứ cấp

(1) Hút bỏ môi trường cũ
(2) Rửa PBS 1X 2 lần
(3) Tách tế bào bằng cell scraper
Tế bào mBM-MSC
(4) Chụp hình
sau khi nuôi cấy
(5) Thêm 3ml môi trường nuôi cấy,
huyền phù
(1)
(6) Chuyển vào falcon, huyền phù
(7) Ly tâm 2000 rpm, 5min, 22oC
(2)
(8) Thu cặn

(3)
(9) Thêm 3ml môi trường nuôi cấy,
huyền phù.
(10) Chia làm 2 roux, nuôi cấy ở
(4)
KHV soi 37oC, 5% CO2.
nổi

(9)

(6)

(10)
(8)

2000
rpm
5’

(7)

(5)

Biện luận: Vì tế bào chuột nhạy
cảm với trypsin nên dùng cell
scraper để tách tế bào


Kết quả phân tách tế bào

Cụm tế bào lơ lửng
Tế bào hình trơn lơ lửng

Giải thích: tế bào sau khi nuôi cấy ở là ở dạng bám dính, liên kết với nhau.
Sau khi phân tách bằng cell scraper thì các tế bào mất dạng bám dính
 dạng hình cầu + lơ lửng trong môi trường để chịu áp lực tốt hơn
khi không ở dạng bám.


Kết quả sau 3 ngày nuôi cấy

Roux 1

Roux 2

Tế bào bám dính dạng dài (dài 60um + rộng 20um)

Các tế bào sau 72h nuôi cấy tiếp tục bám dính và trải rộng, có hình
dạng hình thoi đặc trưng và bắt đầu tăng sinh  Dự đoán là tế bào gốc
trung mô.


Giải thích kết quả sau nuôi cấy

Vùng tế bào mọc
dày, bám dính

 Dự đoán là vùng tế bào mọc dày, không có đủ diện tích bê mặt để bám dính
nên tế bào không thể kéo dài thành tế bào bám dính hình dài. Và do tế bào
mới được thu nhận để nuôi cấy từ tủy xương nên chưa thế phát triển ở mật

độ 2 lớp tế bào.


Đông lạnh tế bào
Tế bào
hUCB- MSC
(1)

Môi
trường
cũ

(2)
PBS

(3)
(4)
Trypsin
Môi trường
đông lạnh

(5)
1500
rpm
5’
Ly tâm

(6)

(7)

(1) Hút môi trường cũ
(2) Rửa bằng PBS
(3) Tách tế bào bằng
Trypsin
(4) Bất hoạt trypsin bằng
môi trường cũ
(5) Ly tâm thu cặn tế bào
(6) Hòa với môi trường
đông lạnh
(7) Đông lạnh 3 bước


Giải thích các thao tác đông lạnh tế bào
Tế bào mBM-MSC (tủy xương chuột) chưa tăng sinh kịp nên sử dụng tế
bào hUCB-MSC (gốc máu cuống rốn) do cô cung cấp để đông lạnh.

• Bất hoạt môi trường cũ bằng trypsin vì trong môi trường nuôi
cấy có FBS (huyết thanh bò) chứa các protein ức chế trypsin
• Môi trường đông lạnh có chứa DMSO (Dimethyl sulfoxide)
giúp giảm sự hình thành tinh thể nước đá và rút nước ra
khỏi tế bào, cô lập nước. Vì dung dịch này có khả năng gây
độc tế bào nên phải pha loãng trước.
• Đông lạnh 3 bước là quy trình đông lạnh phù hợp để DMSO
có thể rút nước từ từ ra khỏi tế bào nhưng không thể hình
thành tinh thể đá phá vỡ tế bào.


Giải đông tế bào hUCB - MSC
Cho từ từ

Ống đông lạnh
lấy từ Nito lỏng
-80C

Ngâm vào bể ổn
nhiệt ở 37C

Biện luận: Ôn định lại nhiêt đô môi
trường. Cho dung dịch giải đông từ
từ vì màng tế bào lúc này rất yếu.

Cho 1ml dd
giải đông

Roux (chụp hình)

Đếm tế bào sống
chết

huyên
phù thật
nhẹ

Chuyển vào
falcon 15ml
đem li tâm
trong môi
trường giải
đông (500800 vòng)
Bỏ dịch

nổi, thu
cặn
Cho 2,5ml
dd nuôi cấy
vào huyên
phù nhẹ


Tế bào sau khi giải đông

5x


Tế bào sau khi giải đông

10x


Tế bào sau khi giải đông

Tế bào chết,
màng bị hỏng,
tế bào chất
tràn ra ngoài
Tế bào còn
sống, màng
nguyên vẹn

20x

Tỉ lệ sống chết:

Tế
  bào chết: 3
Tế bào sống:22
Tổng số tế bào: 25
Tỉ lệ sống:

Biện luận: tỉ lê sống cao vì thao tác
đông lạnh và giải đông tốt nên ít tế
bào chết

Buồng đếm hồng cầu