xây dựng phương án tách dòng gen mã hóa nattokinase từ chủng bacillus subtilis phân lập được

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC

XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA
NATTOKINASE TỪ CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP
ĐƯỢC
Họ và tên: Bùi Thị Kim Loan
Lớp: KTSH.02 – K62
MSSV: 20174889
GVHD: GS. Nguyễn Văn Cách.


Nội dung
1.
Nattokinase

2.
Quy trình và phương pháp thực hiện tách dòng gene.


Nattokinase
-Nattokinase là một enzyme được chiết xuất từ một món ăn Nhật gọi
là natto. Nattō được làm từ đậu nành lên men và được tiêu thụ tại Nhật
Bản cách đây khoảng 1000 năm. Protein này gồm có 362 axit amin
-Mặc dù tên gọi là thế nhưng nattokinase không phải là một enzym kinase,
mà là một serine protease thuộc nhóm subtilisin, chiết xuất từ trực
khuẩn Bacillus subtilis. Nó thể hiện một hoạt tính tiêu fibrin (làm tan cục
máu đông) mạnh. Nattokinase hiện nay có thể được sản xuất bằng các
phương pháp gen tái tổ hợp và nuôi cấy từng đợt, thay vì dựa vào việc
chiết xuất từ Nattō.

Tìm kiếm thông tin bằng cơ sở dữ liệu NCBI
Để có thêm nhiều
thông tin, hiểu biết về
nattokinase, ta truy
cập vào cơ sở dữ liệu
để tìm các bài báo.
Tìm các bài báo có
nghiện cứu về
B.Subtilis có khản
năng sản xuất
nattokinase.
-Đường link:

m.nih.gov/?term=gene
%20nattokinase


Tìm kiếm thông tin bằng cơ sở dữ liệu NCBI

Bài báo 1: Nattokinase
– enzyme làm tan máu
đông phòng ngừa bệnh
tim mạch.
-Đường link:
.
nih.gov/28264497/

/>

Tìm kiếm thông tin bằng cơ sở dữ liệu NCBI

Bài báo : Sàng lọc từ đậu
nành lên men truyền
/>thống và cảm ứng sản
xuất nattokinase ở
B.subtilis MX-6
-Đường link:
.n
ih.gov/29411244/


Quy trình và phương pháp
Bước 1: Tìm thông
tin về đoạn gen mã
hóa nattokinase
trên ít nhất 3 chủng
B.subtilis để chạy
Clustal Omega
chọn vùng bảo thủ
-Truy cập:
NCBI/Nucleotide/gene
nattokinase
-Đường link:
.g
ov/nuccore/?term=gene%2
0nattokinase

/>

Tìm thông tin về gene mã hóa nattokinase

/>
1.Locus: KJ174339 – độ dài: 1151 bp
Chủng: B.subtilis MTCC – 1427
Chọn FASTA để thấy được cấu trúc nucleotide.
-Đường link: />

Tìm thông tin về gene mã hóa nattokinase

2.Locus: KY576911 – độ dài: 1473 bp
-Chủng: B.subtilis MX6
-Đường link: />

Tìm thông tin về gene mã hóa nattokinase

3.Locus: JN392072 – độ dài: 1146 bp
-Chủng: B.subtilis LSSE-22
-Đường link: />

Tìm thông tin về gene mã hóa nattokinase

3.Locus: FJ374767 – độ dài: 1146 bp
-Chủng: B.subtilis MBS 04-6
-Đường link: />

Tìm thông tin về gene mã hóa nattokinase

3.Locus: KJ205600 – độ dài: 1150 bp
-Chủng: B.subtilis KK-2B10
-Đường link: />

Tìm thông tin về gene mã hóa nattokinase

3.Locus: KJ205599 – độ dài: 1152 bp
-Chủng: B.subtilis S1
-Đường link: />

Chạy Clustal Omega tìm đoạn bảo thủ

Bước 2:
Chạy
chương trình
Clustal
Omega chọn
vùng bảo thủ
-Đường link:

.uk/Tools/msa/clus
talo/

Chọn DNA
Dán các đoạn fasta đã chọn
vào ô dưới


Chạy Clustal Omega tìm đoạn bảo thủ
Sau khi ấn Submit, chờ
vài phút kết quả chạy sẽ
xuất hiện trên màn hình.
Thấy có xuất hiện vùng

bảo thủ là vùng có nhiều
dấu ***. Đây là so sánh
cấu trúc dạng local. Ta
chọn những vùng bảo
thủ dài để thiết kế mồi


Thiết kế mồi
Bước 3: Thiết kế mồi
Giả sử KJ174339 là mẫu
gần với chủng cần tách
dòng. Chọn KJ174339 là
khuôn để thiết kế mồi.

-Lựa chọn vùng từ nu
thứ 3 đến nu thứ 62 để
thiết kế mồi xuôi
-Lựa chọn vùng từ nu
1110 đến nu thứ 1148
để thiết kế mồi ngược.


Thiết kế mồi bằng BLAST - primer
Sử dụng
chương trình
Primer –
BLAST để thiết
kế mồi
Đường link:

bi.nlm.nih.gov/t
ools/primerblast/

Lựa chọn
cùng tạo
mồi

Lựa chọn độ dài của sản phẩm
PCR, ở đây ta bỏ trống.
Lựa chọn nhiệt độ gắn mồi


Thiết kế mồi bằng BLAST – primer - Kết quả


Thiết kế mồi bằng BLAST – primer - Kết quả


Chạy PCR ảo bằng Sequence Manipulation Suite: PCR products
Bước 4: Chạy
PCR ảo.
Chọn mồi 1 để
chạy PCR ảo
cho mạch
khuôn là
KJ174339 và
KY576911


Chạy PCR ảo bằng Sequence Manipulation Suite: PCR products

KJ174339


Chạy PCR ảo bằng Sequence Manipulation Suite: PCR products

KY576911


Kiểm tra kết quả chạy PCR ảo
Bước 5: Kiểm tra
đặc tính của kết
quả PCR ảo bằng
BLAST
-Đường
link:https://blast.n
cbi.nlm.nih.gov/Bl
ast.cgi?PROGRAM
=blastx&PAGE_TY
PE=BlastSearch&L
INK_LOC=blastho
me

Kết quả chạy PCR ảo


Kiểm tra kết quả chạy PCR ảo bằng cách BLAST từ
nucleotide -> protein
Vậy kết quả
chạy PCR ảo

có độ tương
cao với
enzyme
nattokinase


Kết luận

Như vậy, kết quả chạy PCR ảo cho thấy có thể biểu hiện tính trạng
sinh được enzyme nattokinase. Tuy nhiên, các chương trình chạy
trên chỉ mang tính dự đoán thiết kế đoạn mồi để phục vụ cho thí
nghiệm trên thực tế. Trên thực tế làm thí nghiệm có thể đoạn mồi
sẽ không cho ra kết quả chạy khi chạy PCR thật.