Phát hiện đột biến mất đoạn hai gen Alpha Globin (--SEA) gây bệnh Αlpha Thalassemia bằng kỹ thuật PCR

NGHIÊN CỨU

PHỤ SẢN/DI TRUYỀN

Phát hiện đột biến mất đoạn hai gen Alpha Globin (--SEA) gây bệnh Αlpha
Thalassemia bằng kỹ thuật PCR
Đào Thị Trang1, Hoàng Thị Ngọc Lan1,2, Nguyễn Thị Hảo1, Bùi Thị Lành1, Hoàng Thị Hải1, Đoàn Thị Kim Phượng1,3
1
Trường Đại học Y Hà Nội
2
Bệnh viện Phụ sản Trung ương
3
Bệnh viện Đại học Y Hà Nội
doi:10.46755/vjog.2020.1.790
Tác giả liên hệ (Corresponding author): Đào Thị Trang, email:
Nhận bài (received) 05/12/2019 - Chấp nhận đăng (accepted) 20/04/2020

Tóm tắt
Đặt vấn đề: Chẩn đoán xác định người mang đột biến dị hợp tử --SEA có ý nghĩa lớn với việc chẩn đoán trước sinh. Chẩn
đoán sớm thai bị Hb Bart’s có vai trò quan trọng cho tư vấn di truyền.
Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của việc phát hiện đột biến --SEA bằng phương pháp PCR.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 66 mẫu DNA tách chiết từ 31 mẫu máu và 35 mẫu ối tươi/ối nuôi cấy đã làm
xét nghiệm đột biến gen α globin bằng phương pháp lai phân tử ngược tại Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại
học Y Hà Nội. Các mẫu DNA được PCR bằng mồi đã thiết kế, sau đó điện di để xác định đột biến --SEA. So sánh kết quả
giữa hai phương pháp.
Kết quả: Đoạn mồi thiết kế đã khuếch đại thành công đoạn gen mang đột biến --SEA. 66/66 mẫu máu và mẫu ối có kết
quả 100% tương đồng giữa hai phương pháp.
Kết luận: PCR là một phương pháp chính xác, đơn giản, nhanh chóng và kinh tế trong chẩn đoán người mang gen cũng
như chẩn đoán thai thi mang đột biến --SEA.

Từ khóa: α-thalassemia, đột biến --SEA, PCR, kỹ thuật lai phân tử ngược.

Detection of the (--SEA) double αlpha-globin gene deletion by simple PCR
method
Dao Thi Trang1, Hoang Thi Ngoc Lan1,2, Nguyen Thi Hao1, Bui Thi Lanh1, Hoang Thi Hai1, Doan Thi Kim Phuong1,3
1
Ha Noi Medical University
2
National Hospital of Obstetrics and Gynecology
3
Hanoi Medical University Hospital

Abstract
Background: Detecting the carriers of SEA double deletion, as well as fetuses with Hb Bart’s syndrome is essential to
prenatal diagnosis. 
Objectives: Evaluating accuracy and the cost-effectiveness of a simple PCR method in determining --SEA mutation. 
Materials and methods: 66 DNA extraction products of 31 blood and 35 amniotic fluid samples were tested for --SEA
mutation by hybridization technique in Genetic Counseling Centre, Hanoi Medical University Hospital. These samples
were diagnosed --SEA mutation by the combined gap-PCR method (with the designed primers) and agarose gel electrophoresis. The results of this PCR assay were compared with that of the reserved hybridization method.
Results: These designed primers have made successful PCR to detect --SEA deletion. The results of the PCR assay
were completely in concordance with that of the reserved hybridization method. 
Conclusion: Application of PCR assay on detecting --SEA double alpha globin gene deletion is exact, simple, rapid (towards both blood and prenatal samples) and cost-effective in Vietnam.

Keywords: α-thalassemia, --SEA mutation, PCR method, reserved hybridization technique.

Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790

27


1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Αlpha thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm
sắc thể thường do đột biến gen α-globin, gây thiếu máu
tan máu mạn tính hoặc phù thai, thai chết lưu [1]. Xác
định người mang đột biến --SEA có vai trò quan trọng
trong tư vấn chẩn đoán trước sinh. Chẩn đoán sớm thai
nhi mắc hội chứng Hb Bart’s có ý nghĩa đối với việc tiên
lượng cho thai nhi, hạn chế những biến chứng nguy hiểm
cho thai phụ và cung cấp thông tin di truyền hữu ích cho
gia đình. Hiện nay, tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, các
phương pháp phát hiện đột biến --SEA chủ yếu dựa vào
kit thương mại với nguyên lý lai phân tử ngược. Phương
pháp này có thể phát hiện được nhiều đột biến cùng lúc
nhưng kỹ thuật phức tạp, tốn thời gian và giá thành cao.
Trong khi đó, nhiều nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy
đột biến mất đoạn lớn dạng SEA ở người có nguy cơ cao
mang gen α-thalassemia lên đến 87,35 - 95% [2,3]. Do đó,
trong nhiều trường hợp chỉ cần xác định đột biến SEA là
đủ ý nghĩa lâm sàng. Trên thế giới cũng như trong nước
đã có nhiều bệnh viện, trung tâm sử dụng phương pháp
PCR để phát hiện đột biến --SEA. Tuy nhiên, phần lớn các
tác giả sử dụng các cặp mồi giống nhau để khuếch đại
đoạn gen α globin bình thường và đột biến --SEA với kích
thước sản phẩm khá lớn, lần lượt là 1800 bp và 1349 bp,
dẫn tới khó thực hiện và kéo dài phản ứng khuếch đại [4].
Từ những vấn đề thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện
nghiên cứu nhằm mục tiêu: Phát triển kỹ thuật PCR với

các đoạn mồi tự thiết kế, nhằm rút ngắn thời gian cũng
như đơn giản hóa kỹ thuật xét nghiệm và tăng hiệu quả
về mặt chi phí. Đánh giá tính chính xác của xét nghiệm

PCR trong việc phát hiện người bệnh và thai nhi có đột
biến --SEA bằng việc so sánh kết quả với phương pháp
lai phân tử.
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: 66 mẫu DNA được tách chiết
từ 31 mẫu máu ngoại vi và 35 mẫu tế bào ối tươi/ối nuôi
cấy của người hoặc thai nhi có chỉ định xét nghiệm đột
biến gen α-thalassemia tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội từ
tháng 4/2019 đến 10/2019. Nghiên cứu có sử dụng DNA
của người bình thường và mẫu tế bào ối của thai không
có nguy cơ mang đột biến --SEA để làm mẫu đối chứng.
Phương pháp nghiên cứu: Mỗi mẫu DNA (tách chiết
bằng kít của hãng Qiagen, Đức) được xác định đột biến
gen bằng 2 phương pháp: lai phân tử ngược và PCR đột
biến --SEA. So sánh kết quả phát hiện đột biến của 2
phương pháp.
Thiết kế mồi:
Các cặp mồi cho phản ứng PCR được thiết kế để khuếch đại đoạn gen α-globin bình thường và trình tự gen liền
kề với đột biến --SEA. Sử dụng chương trình Primer-BLAST
( />để
thiết kế mồi. Trình tự mồi được trình bày trong Bảng 1.

Bảng 1. Trình tự mồi, nồng độ mồi và kích thước sản phẩm sau PCR
Tên mồi

Trình tự (5’ - 3’)

α/SEA(F)

CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC

α(R)

TGAAGAGCCTGCAGGACCAGGTCAGT

α/SEA(F)

CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC

SEA(R)

ATATATGGGTCTGGAAGTGTATCCCTC

Phản ứng PCR:
Mỗi phản ứng 20 µl bao gồm: 8 µl PCR Master mix 2X
(0,8 U/µl, ThermoFisher Scientific), 0,5 µl mỗi loại primer,
10 - 100 ng DNA (thể tích cho vào tùy thuộc nồng độ
mẫu, không quá 20% thể tích phản ứng PCR), DMSO 0,5%
0,5 µl, Betaine 0,5M 2,5 µl, nước cất vừa đủ 20 µl. Chu
trình nhiệt: 980C x 10s; 30 chu kỳ: 980C x 1s; 660C x 5s;

28

Kích thước sản phẩm (bp)
1019

669

720C x 23s; 720C x 60s. Tổng thời gian PCR khoảng 31
phút. Sau khi PCR, điện di sản phẩm trên thạch agarose

1,5%, trong 35 phút.
Kỹ thuật lai phân tử ngược:
Sử dụng bộ kít Thalassemia Gene Diagnostic (Hybribio)/Thalassemia α-Globin StripAssay (ViennaLab)
đã có chứng chỉ CE/IVD.

Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790


3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU



A

B

Hình 1. Hình ảnh điện di phát hiện đột biến --SEA bằng kỹ thuật PCR và hình ảnh kết quả lai phân tử
Hình 1.A. Điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi thiết kế. Chú thích: L: Thang chuẩn; 1: mẫu chứng không đột biến
--SEA, 2: mẫu chứng đồng hợp tử đột biến -- SEA, 3: mẫu chứng dị hợp tử đột biến --SEA (mẫu máu), 4 (mẫu tế bào ối
tươi): đồng hợp tử đột biến --SEA; 5 (mẫu tế bào ối tươi): dị hợp tử --SEA; 6 (mẫu tế bào ối tươi): không đột biến --SEA.
Hình 1.B. Hình ảnh kết quả lai tương ứng kết quả PCR 1 --> 6; Màng lai 1: Không phát hiện đột --SEA và các đột biến
gen thalassemia khác được khảo sát. Màng lai 2: Đồng hợp tử đột biến --SEA. Màng lai 3: Dị hợp tử đột biến -- SEA.
Thanh lai 4: Đồng hợp tử đột biến --SEA. Thanh lai 5: Dị hợp tử đột biến --SEA. Thanh lai 6: Không phát hiện đột --SEA
và các đột biến gen α-thalassemia khác được khảo sát.
Bảng 2. So sánh kết quả phát hiện đột biến --SEA trên mẫu máu, mẫu ối tươi và mẫu ối nuôi cấy
Loại mẫu

Mẫu máu

Mẫu ối tươi/ối nuôi cấy

Tỷ lệ phù hợp
kết quả

Phương pháp
Kết quả

Lai phân tử
n (%)

PCR
n (%)

Lai phân tử
n (%)

PCR
n (%)

Không đột biến

13 (41,9%)

13 (41,9%)

15 (42,9%)

15 (42,9%)

100%

Dị hợp tử

17 (54,8%)

17 (54,8%)

14 (40%)

14 (40%)

100%

1 (3,2%)
(máu cuống rốn)

1 (3,2%)

6 (17,1%)

6 (17,1%)

100%

Đồng hợp tử

Trong 31 mẫu máu và 35 mẫu ối, tỷ lệ phát hiện đột biến --SEA cho kết quả hoàn toàn trùng khớp với phương pháp
lai phân tử ngược.

Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790

29


Bảng 3. So sánh kết quả phát hiện đột biến --SEA trên 16 mẫu ối tươi
Phương pháp

Lai phân tử
(ối nuôi cấy)
n (%)

PCR
(ối tươi)
n (%)

PCR
(ối nuôi cấy)
n (%)

Tỷ lệ phù hợp
kết quả

Không đột biến

6 (37,5%)

6 (37,5%)

6 (37,5%)

100%

Dị hợp tử

6 (37,5%)

6 (37,5%)

6 (37,5%)

100%

4 (25%)

4 (25%)

4 (25%)

100%

Kết quả

Đồng hợp tử

Trong 35 mẫu ối của nghiên cứu, có 16 mẫu được thực hiện kỹ thuật PCR phát hiện đột biến --SEA trên cả hai loại
mẫu (của cùng một bệnh nhân) là tế bào ối tươi và tế bào ối qua nuôi cấy. Kết quả phát hiện đột biến --SEA bằng
PCR trên 16 mẫu ối tươi, cho kết quả phù hợp với ối nuôi cấy bằng cả hai phương pháp, lai phân tử ngược và PCR.
Bảng 4. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp PCR với đột biến --SEA
PCR
Lai

Có đột biến (n,%)

Không đột biến (n,%)

Tổng số

38 (57,6)

0 (0%)

38

0 (0,0)

28 (42,4%)

28

38 (57,6)

28 (42,4%)

66

Có đột biến
Không đột biến
Tổng số

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR trong xét nghiệm xác định đột biến --SEA là 100% khi so với phương

lai phân tử ngược.
4. BÀN LUẬN
Mồi thiết kế đã khuếch đại được đoạn gen mang đột
biến --SEA cũng như đoạn gen α-globin bình thường. Các
cặp mồi được thiết kế lại giúp giảm nhiệt độ nóng chảy
của mồi (Tm), tăng khả năng gắn mồi chính xác; cùng
với việc sử dụng master mix phù hợp, thời gian khuếch
đại chuỗi khi so với các phương pháp PCR, gap-PCR
hoặc multiplex PCR trước đây, đã giảm từ hơn 2,5 giờ
[6,7] xuống chỉ còn khoảng 30 phút. Phương pháp PCR
trong nghiên cứu này cho thấy tính chính xác với độ nhạy
và độ đặc hiệu là 100% khi so với kỹ thuật lai phân tử
ngược (đã có chứng nhận CE/IVD). Theo nghiên cứu tại
Trung tâm Chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện Phụ sản
Trung ương năm 2018 cho thấy tỷ lệ gặp đột biến dị hợp

tử --SEA ở người có sàng lọc mang gen α-thalassemia
lên đến 95% khi sử dụng phương pháp lai phân tử ngược.
91,5% trường hợp đột biến dị hợp tử --SEA nằm trong
nhóm công thức máu có MCV và MCH giảm nhiều (MCV
≤ 75 fl và MCH ≤ 24 pg) [5]. Như vậy, với những trường
hợp bệnh nhân có MCV, MCH giảm nhiều và HbA2 < 3,5%
(không có Hb bất thường khác), việc thực hiện phương
pháp PCR cho thấy hiệu quả về mặt chi phí, kỹ thuật và
thời gian xét nghiệm (so sánh chi tiết được nêu trong
Bảng 5). Trong các trường hợp phương pháp PCR không
phát hiện đột biến --SEA hoặc nghi ngờ dị hợp tử kép, có
thể thực hiện các phương pháp chẩn đoán phát hiện đa
đột biến sau đó.

Bảng 5. So sánh phương pháp lai và phương pháp PCR
Phương pháp

Phương pháp PCR

Tiêu chí

Trên thanh

Trên màng

Thời gian

7 - 8 giờ

4,5 - 5 giờ

70 phút

5.000.000 đồng

3.500.000 đồng

Khoảng 500.000 đồng

Số đột biến phát hiện

21 đột biến
α-thalassemia

5 đột biến α
16 đột biến β

1 đột biến --SEA

Nồng độ DNA yêu cầu

2 - 20 ng/µl

~ > 50 ng/µl

≥ 2,5 ng/µl

Mẫu thực hiện được

Máu, tế bào ối nuôi cấy

Máu, tế bào ối nuôi
cấy

Máu, tế bào ối nuôi cấy, tế
bào ối tươi

Trang thiết bị yêu cầu

Máy PCR, buồng điện di,
bể ổn nhiệt, máy ủ lắc

Máy PCR, bể ổn nhiệt,
máy lai của hãng

Hybribio

Máy PCR, buồng điện di

Chi phí

30

Phương pháp lai

Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790


Trong các trường hợp chẩn đoán trước sinh, kỹ thuật
PCR thực hiện trên mẫu ối tươi và ối nuôi cấy cũng
cho thấy kết quả hoàn toàn phù hợp với phương pháp
lai phân tử ngược trên mẫu ối nuôi cấy. Một số nghiên
cứu cũng cho thấy giá trị của phương pháp PCR trong
chẩn đoán trước sinh hội chứng Hb Bart’s [7,8]. Nghiên
cứu này bước đầu cho thấy ưu điểm của việc sử dụng kỹ
thuật PCR trong chẩn đoán trước sinh ở những đối tượng
có nguy cơ sinh con bị Hb Bart’s, đặc biệt có thể thực
hiện trên mẫu ối tươi không cần nuôi cấy tế bào (nồng độ
thấp nhất chúng tôi làm trong nghiên cứu này là 2,5 ng/
µl). Phát hiện đột biến --SEA từ mẫu ối không cần nuôi
cấy bằng phương pháp PCR cho kết quả sớm trong vòng
24 giờ sau khi nhận mẫu, là ưu điểm thiết yếu trong chẩn
đoán di truyền trước sinh.

7. Jomoui, W., et al. Genetic origin of α(0)-thalassemia

(SEA deletion) in Southeast Asian populations and application to accurate prenatal diagnosis of Hb Bart’s
hydrops fetalis syndrome. Journal of Human Genetics.
2017; 62(8): 747-754.
8. Karnpean, R., et al. Accurate Prenatal Diagnosis of
Hb Bart’s Hydrops Fetalis in Daily Practice with a Double-Check PCR System. Acta Haematol. 2009; 121(4):
227-33.

5. KẾT LUẬN
Thiết kế mồi đã khuếch đại thành công được đột biến
mất đoạn --SEA. Phương pháp PCR phát hiện đột biến
--SEA cho kết quả chính xác, nhanh chóng, kỹ thuật đơn
giản, hiệu quả về chi phí, và có độ nhạy, độ đặc hiệu là
100% khi so với phương pháp lai phân tử ngược. Kỹ thuật
này cho thấy tiềm năng phát hiện đột biến trên cả mẫu
tế bào ối không cần thời gian nuôi cấy trong chẩn đoán
trước sinh.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Weatherall, D.J. Thalassemia as a global health problem: recent progress toward its control in the developing
countries. Ann N Y Acad Sci. 2010; 1202: 17-23.
2. Bui Thi Kim L., D. Phu Chi, C. Hoang Thanh. Spectrum
of Common alpha-Globin Deletion Mutations in the
Southern Region of Vietnam. Hemoglobin. 2016; 40(3):
206-7.
3. Nguyễn Thị Vân Anh, Vũ Hương Ly, Lê Phương Thảo, Trần
Danh Cường. Đặc điểm đột biến gen globin của những đối
tượng nguy cơ cao sinh con mắc thalassemia tại Trung
tâm chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản Trung ương
năm 2018. Tạp chí Phụ sản. 2019; 16(3): 22-27.
4. Chong, S.S., et al. Single-tube multiplex-PCR screen

for common deletional determinants of α-thalassemia.
Blood. 2000; 95(1): 360-362.
5. Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vân Anh, Lê Phương
Thảo, Đoàn Thị Kim Phượng, Phan Thu Giang. Giá trị của
MCV, MCH trong sàng lọc bệnh alpha-thalassemia của
các thai phụ tại Trung tâm chẩn đoán trước sinh - Bệnh
viện Phụ sản Trung ương. Tạp chí Phụ sản. 2019; 16(3):
28-34.
6. Liu, Y.T., et al. Rapid detection of alpha-thalassaemia
deletions and alpha-globin gene triplication by multiplex polymerase chain reactions. Br J Haematol. 2000;
108(2): 295-9.
Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790

31