Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia virus CIAV) lưu hành tại miền bắc việt nam (tt)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐÀO ĐOAN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ
CỦA VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM
Ở GÀ (CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA VIRUS- CIAV)
LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành

: Dịch tễ học thú y

Mã số

: 9.64.01.08

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2020


Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn:
PGS.TS. HUỲNH THỊ MỸ LỆ
TS. NGUYỄN VĂN GIÁP

Phản biện 1:

Phản biện 2:
nghiệp Việt Nam

Phản biện 3:

PGS.TS. Trương Văn Dung - Hội Thúy

PGS.TS. Nguyễn Hữu Nam - Học viện Nông

TS. Phan Quang Minh - Cục Thúy

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện
Họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi
giờ, ngày tháng
năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Chăn nuôi là một bộ phận quan trọng của nền nông nghiệp Việt Nam.
Bên cạnh nhiều cơ hội và thuận lợi, ngành chăn nuôi gia cầm đã và đang
phải đối mặt với không ít thách thức và khó khăn; trong đó, dịch bệnh
được xem là trở ngại lớn, gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi. Hiện
nay, một trong những bệnh ở gia cầm ít được quan tâm nghiên cứu ở nước

ta là tình trạng suy giảm miễn dịch, với vai trò lớn thuộc về các virus tác
động trực tiếp tới hệ miễn dịch của vật nuôi.
Từ khi CIAV (chicken infectious anemia virus) được phát hiện đến nay,
đã có nhiều công trình nghiên cứu về CIAV và bệnh do virus gây ra trên
phạm vi toàn cầu với kết quả thu được từ nhiều khía cạnh: đặc tính sinh
học, cơ chế sinh bệnh, cơ chế gây ức chế miễn dịch của virus; đặc điểm
dịch tễ học, triệu chứng, bệnh tích của bệnh và biện pháp can thiệp. Đáng
chú ý là cơ chế gây ức chế miễn dịch của virus bởi khả năng tấn công vào
các cơ quan miễn dịch, làm cạn kiệt các tế bào lympho của tuyến ức, túi
Fabricius vàtế bào tạo máu tiền thân (hemocytoblast) ở tủy xương (Adair,
2000; Dhama & cs., 2008).
Đến nay, vacxin phòng CIA đã được sử dụng phổ biến trên thế giới,
đặc biệt ở các nước có ngành chăn nuôi gàphát triển. Tuy nhiên, thông tin
về CIA cũng như sự hiểu biết về CIAV tại Việt Nam có phần hạn chế.
Tính đến thời điểm hiện tại, công bố về sự có mặt của kháng thể kháng
CIAV trong huyết thanh gà vào năm 2013 (Trinh & cs., 2015b) cũng như
kết quả phân loại phát sinh gen của các chủng CIAV tại miền Bắc Việt
Nam (Van Dong & cs., 2019) là hai nghiên cứu về CIAV với các mẫu
bệnh phẩm lấy tại Việt Nam nhưng được thực hiện ở nước ngoài. Vì vậy,
chúng tôi nhận thấy rằng nghiên cứu các đặc điểm sinh học phân tử của các
chủng CIAV lưu hành ở một số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam rất cần thiết, là
cơ sở khoa học của việc sử dụng các vacxin hiện có trên thị trường để phòng
CIA. Kết quả thu được sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về CIAV tại
Việt Nam, góp phần tiến tới kiểm soát và hạn chế ảnh hưởng của bệnh do virus
CIAV gây ra đối với ngành chăn nuôi gà của Việt Nam, giai đoạn hiện nay và
trong tương lai.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
* Mục tiêu tổng quát: trả lời câu hỏi có hay không có sự lưu hành gây
bệnh của CIAV ở đàn gà nuôi tại Việt Nam và nghiên cứu đặc điểm dịch
tễ học phân tử của virus làm cơ sở để đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu

1


quả giúp nâng cao năng suất, chất lượng đàn gà.
* Mục tiêu cụ thể:
- Xác định có sự lưu hành của CIAV và CIA ở đàn gà nuôi tại một số
tỉnh miền Bắc Việt Nam nhằm đề xuất việc sử dụng vacxin phòng bệnh;
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng
CIAV đang lưu hành tại miền Bắc Việt Nam để giúp lựa chọn loại
vacxin phù hợp.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Các trạng trại, gia trại nuôi gà tại một số tỉnh miền Bắc giai đoạn
2016-2019. Các tỉnh/ thành phố gồm Hòa Bì
nh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà
Nội, Bắc Ninh, Hải Dương, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng và Quảng Ninh;
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đãxác định được có sự lưu
hành của CIAV ở đàn gà trên địa bàn của 10 tỉnh/thành phố ở miền Bắc
Việt Nam: Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương,
Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng và Quảng Ninh;
- Kết quả nghiên cứu đã giải mã được 3 trình tự gen hoàn chỉnh và 52
trình tự gen ORF1 của các chủng CIAV lưu hành tại thực địa; cho thấy
virus thuộc 2 nhóm di truyền G2 và G3; có độc lực và không cùng nguồn
gốc với các chủng vacxin đang được sử dụng.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
- Nghiên cứu đã khẳng định sự lưu hành của CIAV cũng như sự
có mặt của CIA trong các đàn gà nuôi ở một số tỉnh phía Bắc của Việt
Nam. Biểu hiện lâm sàng, biến đổi bệnh lý của gà trong tự nhiên được
khẳng định bởi kết quả PCR đối với các mẫu bệnh phẩm và kết quả gây
bệnh thực nghiệm bởi chính các chủng CIAV lưu hành đã nhấn mạnh sự

cần thiết phải xem xét đến vai trò và ảnh hưởng của CIAV và CIA đối với
ngành chăn nuôi gà hiện nay.
- Nghiên cứu đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của
các chủng CIAV đã và đang lưu hành ở đàn gà nuôi tại 10 tỉnh/thành phố thuộc
miền Bắc Việt Nam: các chủng thuộc về 2 nhóm di truyền G2, G3; là các
chủng có độc lực và không cùng nhánh với các chủng virus vacxin. Từ thực tế
trên, việc sử dụng vacxin trở nên cần thiết để bảo vệ các đàn gà đối với bệnh do
CIAV gây ra.
- Kết quả là nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu về bệnh
(CIA) và virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm (CIAV); cũng như cho công
tác giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi- Thúy tại Việt Nam.
2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU VỀ CIAV VÀ BỆNH DO CIAV GÂY RA
2.1.1. Giới thiệu về CIAV
Virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious
anemia virus- CIAV) lần đầu tiên được phát hiện từ đàn gà thương phẩm
bị bệnh ở Nhật Bản (Yuasa & cs., 1979) với tên ban đầu làCAA (chicken
anemia agent- yếu tố gây thiếu máu ở gà) được xếp giống Gyrovirus vào
họ Anelloviridae (Rosario & cs., 2017). CIAV là một virus có cấu trúc
nhân là ADN đơn, dạng vòng không có vỏ bọc, đường kính trung bình từ
19,1 nm- 26,5 nm (Gelderblom & cs., 1989).
Trong số 3 protein virus, VP1 là protein cấu trúc duy nhất được biết
đến có vai trò tạo thành capsid, có thể được phát hiện trong các hạt virus
có độ tinh khiết cao (Todd & cs., 1990). Nó đóng vai trò quan trọng trong
việc tạo ra kháng thể trung hòa ở gà bị nhiễm bệnh. VP2 là protein không
cấu trúc, có thể hoạt động như một protein làm khung (scaffold) trong quá
trình lắp ráp virion (Noteborn & cs., 1998). VP2 còn có hoạt tính của

phosphatase (dual-specificity phosphatase) nhận biết đặc hiệu đồng thời
phân tử tyrosine, serine hoặc threonine ở vị trí cắt (Peters & cs., 2002).
VP3 là protein không cấu trúc hay là 1 apoptin gây ra cơ chế chết chương
trình hóa (apoptosis) cho các tế bào tiền thân ở vùng tủy của tuyến ức và
các tế bào hemocytoblasts trong tủy xương (Noteborn & cs., 1994).
2.1.2. Bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà
Bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (CIA) được đặc trưng bởi tình
trạng (i) thiếu máu không tái tạo (aplastic anemia) do sự phá hủy các tế
bào tạo máu (hematopoietic stem cell) ở tủy xương và (ii) thoái hóa các
mô lympho (lymphoid depletion) (Mcnulty, 1991). Do tình trạng tình
trạng ức chế miễn dịch (immunosuppression), gà mắc bệnh thiếu máu
truyền nhiễm dễ mắc các bệnh kế phát, giảm đáp ứng với các loại vacxin
phòng bệnh (Hagood & cs., 2000).
Triệu chứng lâm sàng của bệnh thiếu máu truyền nhiễm phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như: lứa tuổi, tình trạng miễn dịch; liều lượng và đường xâm
nhập của virus. Khi bệnh xảy ra ở thể cấp tính, thời gian ủ bệnh từ 1- 14
ngày. Ngoài các triệu chứng không điển hình (ủ rũ, xù lông, giảm ăn), gà
bệnh có biểu hiện thiếu máu như mào yếm nhợt nhạt (Yuasa & cs., 1979;
Adair, 2000). Tỷ lệ chết thường từ 5- 10% (trong 2- 4 tuần sau khi nhiễm)
nhưng có thể lên tới 60% trong trường hợp kế phát bệnh khác (Bulow,
1991; Dhama, 2002; Dhama & cs., 2002; Dhama & cs., 2004;
Balamurugan & Kataria, 2006). Nếu sống sót qua giai đoạn này, các gà sẽ
3


dần hồi phục sau 4- 5 tuần nhiễm bệnh.
Bệnh tích đại thể: teo cơ quan lympho nói chung, đặc biệt là tuyến ức
và biểu hiện tủy xương nhạt màu được xem là bệnh tích đại thể đặc trưng
nhất, hình 2.8 (Yuasa & cs., 1979; Mcnulty, 1991; Pope, 1991; Smyth &
cs., 1993; Dhama & cs., 2002). Ngoài ra, còn một số biến đổi khác như

xuất huyết và tụ máu ở tổ chức liên kết dưới da, gan sưng, nhạt màu hoặc
vàng nhạt (Dhama, 2002).
2.2. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CIAV
2.2.1. Mối quan hệ di truyền giữa các chủng CIAV
Bộ gen của CIAV có tính bảo thủ tương đối cao (Schat, 2009) nên sự
khác biệt giữa các chủng virus là thấp. Gen mã hóa protein VP1 có vùng
mang nhiều biến đổi (amino acid 139- 151) (Renshaw & cs., 1996). Do đó,
từ trước đến nay, trình tự gen mã hóa capsid protein của CIAV thường
được dùng để nghiên cứu mối liên hệ di truyền giữa các chủng virus
(Islam & cs., 2002; Ducatez & cs., 2006; Eltahir & cs., 2011; OlszewskaTomczyk & cs., 2016; Ou & cs., 2018). Từ 2002 cho đến nay đã có hơn
30 công bố về kết quả nghiên cứu mối liên hệ di truyền giữa các chủng
CIAV. Tuy nhiên, do phân tích với số lượng trình tự gen khác nhau, tiêu
chí phân loại không thống nhất đã dẫn tới đồng thời tồn tại nhiều phân
loại nhóm di truyền của CIAV (Ducatez & cs., 2006), (Islam & cs., 2002).
Nhìn chung, cách phân loại CIAV thành 3 genogroup (I, II, III) được
nhiều nhà khoa học trên thế giới sử dụng (Ducatez & cs., 2006;
Olszewska-Tomczyk & cs., 2016; Ou & cs., 2018).
Các kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy: ít có sự khác biệt trình tự
gen của CIAV phân lập từ các vùng địa lý khác nhau (Ducatez & cs., 2006;
Ducatez & cs., 2008; Hailemariam & cs., 2008). Mức tương đồng trình tự
nucleotide giữa các chủng phân lập ở mỗi nước mặc dù có khác nhau, nhưng
thường ở mức tương đồng cao, ví dụ như 93% (CIAV phân lập tại Alabama,
Mỹ) (Van Santen & cs., 2001) hoặc 94,7% - 99,8% (CIAV phân lập tại Ba
Lan) (Olszewska-Tomczyk & cs., 2016). Nhì
n chung, sự sai khác di truyền
giữa các chuỗi nucleotide của CIAV thường dưới 5% và là khoảng cách lớn
nhất được tìm thấy giữa các chủng CIAV trên thế giới (Ducatez & cs., 2006;
Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013).
2.2.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Có ít tài liệu về CIAV cũng như CIA tại Việt Nam. Công bố đầu tiên

tại Việt Nam là báo cáo sự có mặt của kháng thể kháng CIAV trong huyết
thanh gà được lấy mẫu năm 2013 (Trinh & cs., 2015b). Nghiên cứu đã
giải trình tự gen và kết quả thu được: 6 trình tự gen CIAV thu được từ gà
4


ở Việt Nam ở địa bàn lấy mẫu thuộc 2 nhóm di truyền G2 vàG3. Trong
đó, 4 trình tự gen thuộc nhóm G3 có nguồn gốc ở 3 tỉnh (Hà Nam, Hà Nội
và Bắc Ninh) và 2 trình tự thuộc nhóm G2 chỉ tìm thấy ở tỉnh Vĩnh Phúc.
Kết quả đã gợi ý về sự lưu hành phổ biến của nhóm di truyền G3 trong
một số đàn gà ở miền Bắc Việt Nam. Nghiên cứu thứ hai mới được công bố
gần đây về CIAV dựa trên kết quả phân tích các mẫu bệnh phẩm thu thập
tại miền Bắc Việt Nam ở cấp độ phân tử cũng đã chứng minh sự lưu hành
phổ biến của CIAV, đặc biệt ở giai đoạn gànhỏ (61,43% gà ở giai đoạn 23 tuần tuổi và 44,83% gà ở giai đoạn 4-11 tuần tuổi) dương tính với CIAV
khi kiểm tra bởi kỹ thuật real-time PCR (Van Dong & cs., 2019). Hai
nghiên cứu này được thực hiện phần lớn ở nước ngoài và thông tin về tính
khả năng gây bệnh của CIAV cũng như đánh giá hiệu quả sử dụng vacxin
phòng bệnh trong chăn nuôi gà chưa được làm rõ. Vì vậy, nghiên cứu của
chúng tôi được thực hiện sẽ cùng hai công trình kể trên nhằm cung cấp
thông tin một cách đầy đủ và toàn diện hơn về CIAV ở đàn gà nuôi tại
Việt Nam, góp phần trong công tác phòng chống bệnh hiệu quả.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Mẫu của gà nghi mắc bệnh được thu thập tại 64 trang trại chăn nuôi gà
thuộc 10 tỉnh/thành phố miền Bắc: Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội,
Bắc Ninh, Hải Dương, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng và Quảng Ninh;
- Nghiên cứu được thực hiện tại bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm,
Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đề tài nghiên cứu được triển khai từ tháng 11/2016 đến tháng 9/2019.

3.3. ĐỐI TƯỢNG/ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
(i) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV lưu hành ở miền Bắc,
(ii) Bệnh do CIAV gây ra ở gà trong tự nhiên và trong điều kiện thí
nghiệm.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
+ Gà nghi ngờ mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở các đàn gà chưa
được tiêm vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm, thu thập ở 10 tỉnh/
thành phố thuộc phạm vi nghiên cứu;
+ Mẫu bệnh phẩm: gộp phủ tạng của gà ốm (tuyến Harder, tuyến ức,
túi Fabricius, tủy xương, hạch lympho manh tràng; tim, gan, lách, thận);
+ Huyễn dịch virus dùng gây nhiễm (do bộ môn VSV - TN, khoa Thú
5


y, HVNNVN cung cấp): CIAV được phân lập từ gà mắc bệnh tự nhiên
trên môi trường tế bào MSB1, theo phương pháp được công bố trước đây
(Yuasa, 1983). Huyễn dịch bệnh phẩm 10% dùng phân lập virus là mẫu
gộp phủ tạng (gan, lách, thận, tuyến ức, tủy xương và túi Fabricius) đã được
bất hoạt virus có vỏ bọc (nếu có) bằng chloroform (tỷ lệ 1ml huyễn dịch và
50ml chloroform) ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Huyễn dịch virus phân
lập được khẳng định là CIAV bằng phản ứng PCR (van Santen & cs, 2001)
với cặp mồi đặc hiệu. CIAV phân lập được kiểm tra âm tính với virus
Newcastle, cúm gia cầm, Gumboro, IB, ILT (kết quả không trình bày);
+ Gà thí nghiệm để gây nhiễm: trứng gà có phôi được lấy từ đàn gàâm
tính CIAV, chưa từng được tiêm vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền
nhiễm. Trứng được ấp nở tại phòng thí nghiệm của bộ môn VSV – TN,
khoa TY, HVNNVN, gà con 1 ngày tuổi được kiểm tra âm tính CIAV
bằng phản ứng semi-nested PCR;
+ Hóa chất dùng để thực hiện các chẩn đoán, giải trình tự gen...

+ Mồi đặc hiệu (bảng 3.1) dùng phát hiện và giải trình tự gen VP1/
genome của CIAV được tham khảo theo nghiên cứu trước đây (Van
Santen & cs., 2001; Li & cs., 2016).
+ Các trình tự gen: (i) 58 trình tự được tạo ra trong nghiên cứu này (mã
số MH536104- MH536106 vàMF611928- MF611982) và(ii) các trình tự
gen của CIAV được công bố ở GenBank (phụ lục 1). Có 984 trình tự gen,
của 30 quốc gia (châu Á, châu Âu, châu Mỹ, châu Phi và châu Úc) được
thu thập từ năm 1974 - 2018 được dùng trong nghiên cứu này.
Bảng 3.1. Trình tự mồi đặc hiệu dùng trong nghiên cứu
Tên mồi
CAVVP3F
CAV1
CAV2
F1
R1
F2
R2
F3
R3

Trình tự (5’-3’)
TTAAGATGGACGCTCTCCAAGAAGATACT
GACTGTAAGATGGCAAGACGAGCTC
GGCTGAAGGATCCCTCATTC
GCATTCCGAGTGGTTACTATTCC
CGTCTTGCCATCTTACAGTCTTAT
CGAGTACAGGGTAAGCGAGCTAAA
TGCTATTCATGCAGCGGACTT
ACGAGCAACAGTACCCTGCTAT
CTGTACATGCTCCACTCGTT

Mục đích
Phát hiện CIAV

Giải trình tự gen

3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Nghiên cứu sự lưu hành của virus và bệnh thiếu máu truyền
nhiễm ở gànuôi tại một số tỉnh/thành phố miền Bắc Việt Nam
- Xác định tỷ lệ dương tính CIAV ở đàn gà nuôi tại 10 tỉnh/thành phố
6


thuộc miền Bắc Việt Nam: Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội, Bắc
Ninh, Hải Dương, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng và Quảng Ninh;
- Nghiên cứu triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh thiếu máu
truyền nhiễm ở gà mắc tự nhiên;
- Tìm hiểu đặc điểm sự lưu hành CIAV theo: vị trí địa lý, lứa tuổi, mục
đích sản xuất (hướng thịt, hướng trứng), quy mô chăn nuôi, phương thức
chăn nuôi;
- Chứng minh chủng CIAV lưu hành là virus có độc lực thông qua gây
bệnh thực nghiệm cho gà.
3.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV
- Đặc điểm di truyền của các chủng CIAV lưu hành ở đàn gà nuôi tại
10 tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam;
- Đặc điểm di truyền của gen mã hóa capsid protein của CIAV ở đàn
gà nuôi tại 10 tỉnh/ thành phố;
- Nghiên cứu nguồn gốc phát sinh chủng loại của CIAV lưu hành tại
miền Bắc;
- Nghiên cứu đặc điểm phát tán theo không gian và thời gian của

CIAV lưu hành tại miền Bắc.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp lựa chọn cơ sở chăn nuôi để thu mẫu
Với mục đích khẳng định có sự lưu hành của virus gây bệnh Thiếu
máu truyền nhiễm ở gà, chúng tôi tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên tại 64 trại
gàvới quy mô chăn nuôi (< 500 con, 500- 1000 con và> 1000 con), mục
đích chăn nuôi khác nhau, phân bố tại các vùng chăn nuôi gà tập trung
thuộc 10 tỉnh miền bắc Việt Nam, chưa từng sử dụng vacxin phòng bệnh
thiếu máu truyền nhiễm để tiến hành nghiên cứu. Để thu thập các thông
tin cần thiết, chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu hồi cứu và
nghiên cứu cắt ngang. Khi mẫu bệnh phẩm được kiểm tra cho kết quả
dương tính với CIAV thì kết luận: đàn và trại gà đó có lưu hành CIAV.
3.5.2. Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng vàbệnh tích đặc trưng
- Bước 1: điều tra thông tin về đàn giống nuôi tại trang trại: nguồn gốc
con giống; chương trình vacxin được sử dụng cho đàn bố mẹ và đàn gà
hiện được nuôi; tình hình đàn gà trong thời gian nuôi. Bước 2: quan sát
tình trạng đàn gà và các biểu hiện lâm sàng của những gà ốm; vàbước 3:
mổ khám các gà nghi mắc.
3.5.3. Phương pháp mổ khám vàlấy mẫu
Theo “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về bệnh động vật- yêu cầu chung lấy
7


mẫu bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển” (QCVN 01- 83:
2011/BNNPTNT). Bệnh phẩm gồm tuyến Harder, tuyến ức, tủy xương,
lách, túi Fabricius, v.v... được tách riêng khỏi cơ thể để quan sát và chụp
ảnh; sau đó được bảo quản lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm để thực
hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.4. Phương pháp tách chiết ADN
ADN tổng số được tách chiết từ huyễn dịch bệnh phẩm 10% hoặc

huyết thanh theo quy trình được mô tả trước đây (Yang & cs., 2003).
3.5.5. Phương pháp PCR phát hiện CIAV
Nghiên cứu này sử dụng kít PCR thương mại với các thành phần cơ
bản của phản ứng (trừ sợi khuôn, mồi đặc hiệu) được trộn sẵn. Nghiên cứu
sự lưu hành CIAV, phản ứng PCR phát hiện CIAV được thực hiện bằng
cặp mồi CAVVP3F/ CAV2 (Van Santen & cs., 2001) với chu trình nhiệt
như sau: tiền biến tính ở 94oC trong 5 phút; 40 chu kỳ nhiệt bao gồm biến
tính 94oC/ 20 giây, bắt mồi 58,5oC/ 30 giây, kéo dài 72oC/ 60 giây; giữ ở
nhiệt độ 25oC cho tới khi dừng.
Đối với thí nghiệm chứng minh độc lực của virus, CIAV được phát hiện
bằng phản ứng semi-nested PCR, sử dụng 3 mồi CAVVP3F/CAV1/CAV2.
Chu trình nhiệt: tiền biến tính ở 94oC trong 5 phút; 40 chu kỳ nhiệt bao gồm
biến tính 94oC/ 20 giây, bắt mồi 57oC/ 30 giây, kéo dài 72oC/ 60 giây; giữ ở
nhiệt độ 25oC cho tới khi dừng.
Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trong thạch agarose 2% có bổ sung
thuốc nhuộm ADN 1x (RedSafe Nucleic Acid Staining Solution, iNtRON).
Vạch sản phẩm PCR được quan sát ở bước sóng ánh sáng 514nm.
3.5.6. Phương pháp chứng minh độc lực của CIAV
3.5.6.1. Bố tríthínghiệm gây nhiễm CIAV
Tổng số có 20 gà 1 ngày tuổi âm tính CIAV, được chia thành 2 nhóm.
Nhóm thí nghiệm: 10 gà, được tiêm 1 ml huyễn dịch CIAV (104,0
TCID50/ml) vào xoang phúc mạc, 7 ngày sau tiêm nhắc lại lần 2. Nhóm
đối chứng: 10 gà được tiêm 1 ml dung dịch PBS 1x vào xoang phúc mạc.
(Liều gây nhiễm được chọn dựa vào (i) liều nhiễm từ 104,0 TCID50/ml
cho đến 2 x 104,5 TCID50/ml của một số nghiên cứu đã công bố (Kaffashi
& cs., 2006; Wani & cs., 2015; Tongkamsai & cs., 2019) và (ii) kết quả
gây nhiễm thử được thực hiện một số lần trước đó của chúng tôi).
3.5.6.2. Theo dõi khả năng tăng trọng ở gàsau khi nhiễm CIAV
Khối lượng của gà được theo dõi bằng phương pháp cân với tần suất 1
lần/ tuần và từ tuần 1 đến tuần 8, so sánh giữa nhóm đối chứng và nhóm

thí nghiệm.
8


3.5.6.3. Xác định tỷ khối huyết cầu ở gàsau khi nhiễm CIAV
Tỷ khối huyết cầu (%) của từng cá thể trong mỗi nhóm thí nghiệm và
đối chứng được xác định hàng tuần.
3.5.7. Phương pháp giải trình tự gen
Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo hai chiều (xuôi và ngược)
bằng phương pháp Sanger’s (thực hiện tại công ty 1st BASE, Malaysia), sử
dụng 3 cặp mồi như được mô tả trước đây (Li & cs., 2016). Trình tự
nucleotide tiếp tục được phân tích bằng chương trình tin sinh học BioEdit
v7.1.3.0 (Hall, 1999) trên cơ sở đối chiếu so sánh (i) giữa các trình tự
nucleotide được giải trình tự theo chiều xuôi, chiều ngược và (ii) với trình tự
gen ORF1 và toàn bộ genome tham chiếu công bố trên ngân hàng gen. Bộ
gen hoàn chỉnh của 3 chủng CIAV trong nghiên cứu này được chú giải cấu
trúc gen dựa vào thông tin đã biết trước của chủng CIAV tham chiếu
(GenBank M81223), sử dụng phần mềm GATU (Tcherepanov & cs., 2006).
3.5.8. Phương pháp phân tích đặc điểm di truyền
Mức tương đồng trình tự nucleotide của bộ gen CIAV được phân tích
dựa vào phần mềm SDT phiên bản 1.2 (Muhire & cs., 2014). Đánh giá sự
biến động mức tương đồng dọc theo chiều dài bộ gen của CIAV được
thực hiện bằng phân phần mềm SimPlot (Lole & cs., 1999) với các tham
số mặc định.
Ngoài ra, những thay đổi của gen VP1 được đánh giá thông qua 12 vị trí
amino acid đóng vai trò trong quá trình nhân lên và độc lực của virus
(Renshaw & cs., 1996; Scott & cs., 2001; Yamaguchi & cs., 2001; Todd &
cs., 2002). Biến đổi amino acid tại mỗi vị trí được hiển thị bằng chương trình
WebLogo (Crooks & cs., 2004). Ở mỗi vị trí, chỉ có các thay đổi thường xuyên
nhất được hiển thị. Chiều cao của các chữ cái tương ứng với mỗi amino acid ở

một vị trí phản ánh tần suất xuất hiện của amino acid tại vị trí đó.
3.5.9. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
Dựa vào các công bố trước đây (Ducatez & cs., 2008; Kye & cs., 2013;
Ou & cs., 2018) mối liên hệ di truyền của các chủng CIAV được xây dựng
bằng phương pháp Neighbor-joining, sử dụng mô hình Kimura-2
parameter mô phỏng sự biến đổi của nucleotide. Mức tin cậy ở các nhánh
cây phát sinh chủng loại được ước tính bằng phương pháp bootstrap, với
số lần lặp lại là 1000 lần. Phân tích trên được thực hiện bởi phần mềm
MEGA6 (Tamura & cs., 2013). Các chủng CIAV tham chiếu (phụ lục 1)
của genogroup G1-G3 (Ducatez & cs., 2006; Olszewska-Tomczyk & cs.,
2016) và của genogroup G4 được đề xuất gần đây (Ou & cs., 2018) đã
được đưa vào để xây dựng cây phát sinh chủng loại.
9


3.5.10. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử
Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond & cs., 2012) có thể dựng cây
phát sinh chủng loại dựa vào số lượng lớn các trình tự gen ORF1. Dựa vào
đặc điểm phân nhánh để xác định các nhánh phụ dẫn tới các chủng CIAV
lưu hành ở miền Bắc. Đặc điểm dịch tễ học theo thời gian và không gian
được phân tích riêng cho từng nhánh phụ bằng phần mềm chương trình
PastML (Ishikawa & cs., 2019). Phần mềm PastML yêu cầu tham số đầu
vào là cây phát sinh chủng loại và bảng danh sách các địa điểm lấy mẫu
tương ứng với các trình tự gen. Phần mềm iTOL (Letunic & Bork, 2007)
biểu diễn và hiệu đính dựng cây phát sinh chủng loại (phylogenetic tree).
3.5.10. Phương pháp xử lýsố liệu
Số liệu được nhập và tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
Để đánh giá tỷ lệ lưu hành của CIAV theo trang trại, nhóm tuổi khác nhau,
thực hiện phân tích phương sai (ANOVA one -way) tích hợp trong phần
mềm SPSS (IBM Corp.) phiên bản 22. Sự sai khác có ý nghĩa thống kê

nếu giá trị p  0,05.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Để nâng cao ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu này, cần chứng
minh có bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà nuôi tại Việt Nam và chủng virus
phân lập được có độc lực. Với những lập luận đó, các kết quả nghiên cứu của
chúng tôi được trình bày gồm hai phần: (1) xác định có bệnh thiếu máu
truyền nhiễm, sự lưu hành và khả năng gây bệnh của các chủng CIAV thực
địa; (2) nghiên cứu đặc điểm di truyền, dự đoán nguồn gốc, sự phát tán theo
không gian và thời gian của virus ở miền Bắc Việt Nam.
4.1. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS VÀ BỆNH THIẾU MÁU
TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ NUÔI TẠI MIỀN BẮC
4.1.1. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành CIAV
Do chưa có nhiều thông tin về CIAV ở Việt Nam và để chuẩn hóa quy
trình PCR nhằm tăng khả năng phát hiện virus, nghiên cứu đã chọn lấy
mẫu (đợt 1) ở đàn gà nuôi tại 14 trang trại thuộc Hà Nội và vùng phụ cận.
Đối tượng lấy mẫu là tất cả các gà ở mọi lứa tuổi bao gồm gà bình thường
và gà ốm chưa rõ nguyên nhân. Kết quả trình bày ở bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quả PCR phát hiện CIAV trong mẫu bệnh phẩm
Âm tí
nh
Dương tính
Số mẫu
Phân nhóm
kiểm tra Số mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ (%)
Theo cá thể
Theo trang trại

124
14

61
1

10

49,2
7,1

63
13

50,8
92,9


Do các cơ sở chăn nuôi ở 14 trang trại kể trên không sử dụng vacxin
phòng bệnh do CIAV gây ra nên 50,81% mẫu gà ốm dương tính CIAV là
do nhiễm tự nhiên. Dựa vào kết quả thăm dò bước đầu nêu trên, nghiên
cứu đã triển khai lấy mẫu ở phạm vi rộng hơn (đợt 2) và phát hiện CIAV
ở các trang trại khác thuộc 10 tỉnh/thành phố miền Bắc Việt Nam, kết quả
được thể hiện ở bảng 4.2:
Đây là kết quả có có ý nghĩa khoa học và thực tiễn giúp cho những
người làm công tác chăn nuôi, thú y có được sự quan tâm cần thiết đến vai
trò gây bệnh của CIAV, từ đó xây dựng được chiến lược phòng chống
bệnh truyền nhiễm cho đàn gà một cách có hiệu quả.
Bảng 4.2. Kết quả PCR phát hiện CIAV ở mẫu bệnh phẩm thu từ
10 tỉnh/thành phố miền Bắc Việt Nam
Số mẫu
Số mẫu
Tỷ lệ (%)

TT
Địa điểm
kiểm tra
dương tính
dương tính
1
Hòa Bì
nh
16
4
25
2
Vĩnh Phúc
14
14
100
3
Phú Thọ
11
3
27,3
4
Hà Nội
10
5
50
5
Bắc Ninh
15
10

66,7
6
Hải Dương
7
7
100
7
HàNam
10
10
100
8
Nam Định
19
4
21,1
9
Hải Phòng
8
8
100
10 Quảng Ninh
9
9
100
Tổng hợp
119
74
62,2
4.1.2. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà nhiễm CIAV trong

tự nhiên
Nhì
n chung, các triệu chứng phổ biến thu được từ thực tế (với các đàn
được khẳng định dương tính CIAV) là : mào tích nhợt nhạt, xuất huyết ở da
vùng cánh, v.v... Đàn gà nhiễm CIAV còn có biểu hiện triệu chứng không
điển hình như: ủ rũ, giảm ăn, rụng lông, nhợt nhạt và còi cọc.
Bệnh tích: tuyến ức và tủy xương là hai tổ chức chịu sự tác động chính
của virus. Có thể quan sát rõ mức độ teo tuyến ức khác nhau: gần như mất
hoàn toàn các thùy hoặc các thùy teo to- nhỏ không đều. Đối với tủy xương,
kết quả kiểm tra bệnh tích cũng thấy phần lớn các trường hợp tủy xương có
màu vàng. Tuy nhiên, mức độ biến đổi bệnh tích ở tủy xương là khác nhau
giữa các cá thể. Ngoài tuyến ức và tủy xương, nghiên cứu còn làm rõ biến đổi
bệnh tí
ch đại thể ở túi Fabricius.
11


4.1.3. Đặc điểm về sự lưu hành của CIAV
4.1.3.1. Sự lưu hành của CIAV theo địa điểm nghiên cứu
Theo yếu tố không gian- vùng địa lý, ban đầu nghiên cứu tập trung tìm
hiểu sự phân bố của virus ở một phạm vi nhỏ là Hà Nội và vùng phụ cận,
sau đó mở rộng ra 10 tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam. Tỷ lệ phát hiện
CIAV cao ở một số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam tương xứng với một
vài công bố ở các nước (74/119 mẫu, chiếm tỷ lệ trung bình là 62,2%).
4.1.3.2. Sự lưu hành của CIAV theo một số chỉ tiêu trong chăn nuôi gia cầm
Để làm rõ hơn các đặc điểm dịch tễ học của bệnh thiếu máu truyền
nhiễm do CIAV gây ra ở gia cầm, nghiên cứu đi sâu phân tích sự lưu hành
theo một số yếu tố trong chăn nuôi gia cầm hiện nay. Kết quả được minh
họa ở hình 4.1.

Loại gà (A), phương thức chăn nuôi (B), quy mô chăn nuôi (C) và
nhóm tuổi (D). Tỷ lệ CIAV dương tính (tính bằng phần trăm, dấu ●) và
khoảng tin cậy là 95%. Giá trị xác suất p ở góc trên bên trái phía trên của
mỗi bảng với mức ý nghĩa là 0,05 hoặc nhỏ hơn đã chỉ ra sự khác nhau
đáng kể có tính thống kê giữa các phân loại nhóm.
Hì
nh 4.1. Kết quả phát hiện CIAV theo một số chỉ tiêu trong chăn nuôi
Về đặc điểm lưu hành của CIAV theo mục đích chăn nuôi (loại gà):
CIAV được phát hiện ở cả gà hướng thịt và hướng trứng với tỷ lệ dương tí
nh
lần lượt là 69,8% và57,9% nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống
kê(p = 0,201).
12


Về đặc điểm lưu hành của CIAV theo phương thức chăn nuôi: tỷ lệ
dương tính với CIAV ở hình thức nuôi thả cao hơn rõ rệt so với hình thức
nuôi nhốt (80,5% và 52,6%) (p<0,05) đã chỉ ra phương thức chăn nuôi có ảnh
hưởng đến sự lây nhiễm CIAV; gà nuôi thả có nguy cơ nhiễm bệnh CIA cao
hơn gà nuôi nhốt.
Về sự lưu hành của CIAV theo quy môchăn nuôi: tỷ lệ dương tính ở
quy mô đàn nhỏ (< 500 con), trung bình (500-1000 con) và lớn (> 1000
con) lần lượt là 64,3%; 58,3% và 63% (p = 0,804). Điều đó có nghĩa là gà
nuôi ở bất cứ quy mô nào đều có thể nhiễm CIAV vàkhông theo một xu
hướng cụ thể.
Về sự lưu hành của CIAV theo lứa tuổi: kết quả cho thấy tỷ lệ dương
tính với CIAV ở 3 nhóm tuổi gà lần lượt là 60,9%; 64,7% và 60%. Sự lưu
hành của CIAV ở miền Bắc Việt Nam không có một xu hướng cụ thể nào
đối với từng nhóm tuổi.
4.1.4. Kết quả chứng minh độc lực của CIAV lưu hành ở gàtại miền Bắc

4.1.4.1 Kết quả gây nhiễm thực nghiệm CIAV
Kết quả phát hiện CIAV trong máu gà 8 tuần sau gây nhiễm cho thấy:
bằng phương pháp semi-nested PCR, nghiên cứu này không phát hiện được
CIAV ở máu của gà nhóm gây nhiễm trong 2 tuần đầu. Hiện tượng virus
huyết bắt đầu xuất hiện ở tuần thứ 3 sau gây nhiễm (tỷ lệ 20%) và tăng dần
cho đến tuần thứ 6 (100%). Virus huyết duy trì tới tuần thứ 8 (thời điểm dừng
thí nghiệm). Ở nhóm đối chứng (không gây nhiễm virus), trong toàn bộ thời
gian thí nghiệm (tuần 1- tuần 8) đều không phát hiện được virus trong máu,
kể cả ở 01 gà chết ở tuần thứ 6.
4.1.4.2. Một số chỉ tiêu lâm sàng của gànhiễm CIAV
Triệu chứng lâm sàng của gà tại thời điểm 6 tuần tuổi (2 tuần sau khi bắt
đầu có hiện tượng virus huyết, cũng là thời điểm 100% gà gây nhiễm dương
tính với virus huyết). Tuy nhiên, trong suốt quá trình theo dõi, hầu như không
quan sát được triệu chứng thiếu máu của gà nhiễm virus thực nghiệm.
4.1.4.3. Khả năng tăng trọng của gàsau gây nhiễm CIAV
Từ thời điểm 1- 4 tuần sau khi gây nhiễm (9-30 ngày tuổi), gà thuộc
nhóm thí nghiệm và đối chứng có sự chênh lệch về khối lượng nhưng sự
khác biệt tại mỗi thời điểm không có ý nghĩa thống kê. Từ tuần thứ 5 sau
gây nhiễm (thời điểm có từ > 70% đến 100% gà dương tính virus huyết),
nhóm nhiễm virus có khối lượng thấp hơn rõ rệt so với nhóm đối chứng.
4.1.4.4. Biến động tỷ khối huyết cầu ở gàgây nhiễm CIAV
Từ tuần 5 sau gây nhiễm trở đi, kết quả kiểm định về sự khác biệt tỷ
13


khối huyết cầu giữa 2 nhóm gà cho giá trị p < 0,05, chứng tỏ kết quả bắt
đầu sai khác và có ý nghĩa thống kê. Trong đó, thấy rõ nhóm gà nhiễm
CIAV có tỷ khối huyết cầu thấp hơn rõ rệt so với nhóm gà đối chứng.
4.1.4.5. Bệnh tí
ch đại thể ở gà được gây nhiễm CIAV

Tại thời điểm hiện tượng thiếu máu là khác biệt rõ rệt nhất giữa nhóm
thí nghiệm và đối chứng (ngày 56 sau nhiễm virus, hình 4.2), toàn bộ gà
của 2 nhóm được mổ khám để nghiên cứu biến đổi bệnh tích đại thể.

Hình 4.2. Bệnh tích đại thể ở tuyến ức vàtủy xương
Hình 4.2 cho biết các thùy của tuyến ức ở nhóm gà đối chứng có kích
thước tương đối đồng đều (hình 4.2E, 4.2F), trong khi đó kích thước của
các thùy này của nhóm thí nghiệm có sự teo một phần (hình 4.11B) hoặc
teo gần như hoàn toàn (hình 4.2A). Tủy xương ở nhóm thí nghiệm nhạt màu
(hình 4.2D) hoặc có màu vàng rõ (hình 4.2C). Ngược lại, tủy xương của
nhóm gà đối chứng luôn có màu đỏ nâu (hình 4.2G, 4.2H). Như vậy, gà
được gây nhiễm bởi chủng CIAV thực địa trong nghiên cứu này có biến đổi
bệnh tích điển hình của bệnh thiếu máu truyền nhiễm, giống như mô tả của
nhiều nghiên cứu trên thế giới (Yuasa & cs., 1979; Yuasa & cs., 1980).
4.2. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CIAV TẠI MIỀN BẮC
4.2.1. Đặc điểm di truyền của CIAV lưu hành tại miền Bắc
Để tìm hiểu đặc điểm cấu trúc bộ gen của CIAV lưu hành tại miền Bắc,
bộ gen của 3 chủng virus đã được giải mã thành công (mã số MH53610414


MH536106) và đều có kích thước là 2298 nucleotide. Kích thước bộ gen
của CIAV thu được trong nghiên cứu này tương đương với đa số các
chủng CIAV trên thế giới (161/ 176 chủng công bố trên GenBank dài
2298 nucleotide). Kết quả phân tích cấu trúc bộ gen được lần lượt trình
bày ở các phần dưới đây.

Ghi chú:  ÷ trình tự nucleotide lặp (direct repeat); ATF: trình tự
bám yếu tố khởi động phiên mã; CCAAT: trình tự tăng cường tính bám
của yếu tố khởi đầu phiên mã; Sp1: trình tự giàu GC bám protein Sp1;
TFIID: trình tự bám yếu tố khởi động phiên mã II D.

Hình 4.3. Cấu trúc vùng khởi đầu phiên mãcủa CIAV ở miền Bắc
Hình 4.3 trình bày cấu trúc đầu 5’ không mã hóa protein của CIAV. So
với 2 chủng tham chiếu, 3/3 chủng CIAV của Việt Nam đều có 4 vùng
trình tự lặp lại (ký hiệu 1, 2, 4, 5, hình 4.3) và giống với chủng virus có
độc lực (Cux-1, mã số M81223). Vùng 5’ này còn chứa các trình tự bám
cho yếu tố khởi động quá trình phiên mã, ví dụ như ATF, CCAAT, Sp1 và
TFIID (hình 4.3). Như vậy, 3 chủng virus ở miền Bắc mang cấu trúc gen
15


đặc trưng ở vùng 5’ của CIAV (Noteborn & cs., 1991). So sánh với chủng
CIAV clone 10 đã được chứng minh có độc lực thấp (mã số U66304)
(Meehan & cs., 1997), 3/3 chủng CIAV trong nghiên cứu này và chủng
Cux-1 độc lực cao đều không có đột biến thêm 21 nucleotide (đánh dấu
màu xám, hình 4.3) nằm giữa trình tự lặp số 2 và số 4.
Tiếp tục so sánh vùng gen mã hóa protein của CIAV, đã xác định
được bộ gen của 3/3 chủng CIAV trong nghiên cứu này có cấu trúc vùng
gen mã hóa protein giống với chủng tham chiếu M81223 (hình 4.4).

Ghi chú: giátrị (%) biểu thị mức tương đồng nucleotide giữa các gen
của 3 chủng CIAV ở miền Bắc với chủng virus tham chiếu M81223.
Chiều của mũi tên biểu thị hướng của quá trình dịch mã.
Hình 4.4. Cấu trúc vùng mãhóa protein của CIAV ở miền Bắc
Có thể thấy vùng mã hóa protein của 3 chủng CIAV gồm 3 gen cùng
chiều, lồng nhau, theo thứ tự ORF2- ORF3- ORF1 (hì
nh 4.4). Về mức tương
đồng, gen ORF2 tương đồng 100%, gen ORF3 tương đồng 98,3% - 99,2% và
gen ORF1 tương đồng từ 98,9% - 99,1% so với chủng CIAV tham chiếu.
Ở mức độ gen, 3 chủng thực địa của Việt Nam đồng thời thể hiện vùng
biến đổi trong gen VP1. Gen mã hóa protein VP1 chứa 2 vùng (dấu *,

hình 4.5A - 4.5C) có sự tương tự gen ít hơn 95% (đường nét đứt) khi so
sánh với các chuỗi của 3 nhóm gen. Một vùng thêm vào có sự tương
đồng gen thấp (dấu ★, hình 4.5A) được quan sát trong vùng không mã
hóa khi 3 chủng của Việt Nam được so sánh với nhóm di truyền G1.
16




G1 vs. 33.5

B
1
0.98
0.96
0.94
0.92
0.9
0.88
0.86
0.84
0.82
0.8

*
VP2
VP1

*

VP3
101
201
301
401
501
601
701
801
901
1001
1101
1201
1301
1401
1501
1601
1701
1801
1901
2001
2101
2201

MứcGenetic
tươngsimilarity
đồng gen

1
0.98

0.96
0.94
0.92
0.9
0.88
0.86
0.84
0.82
0.8

G1 vs. 33.3

VP2

G3 vs. 33.3

G2 vs. 33.5

*
VP2
VP1

*

VP3

G3 vs. 33.5

*

*
VP1

VP3
101
201
301
401
501
601
701
801
901
1001
1101
1201
1301
1401
1501
1601
1701
1801
1901
2001
2101
2201

MứcGenetic
tươngsimilarity
đồng gen

1
0.98
0.96
0.94
0.92
0.9
0.88
0.86
0.84
0.82
0.8

G3 vs. 3.1

G2 vs. 33.3

Center position
Vị trí trung
tâm

positiontâm
Vị tríCenter
trung

C

G2 vs. 3.1

101

201
301
401
501
601
701
801
901
1001
1101
1201
1301
1401
1501
1601
1701
1801
1901
2001
2101
2201

G1 vs. 3.1

A

Vị tríCenter
trung
positiontâm

Ghi chú: 3 bộ gen CIAV lần lượt được so sánh với chủng virus tham chiếu thuộc
genogroup 1 (A), 2 (B) và3 (C). Dấu * và ★ đánh dấu các vùng có mức tương
đồng < 95% (đường nét đứt).

Hình 4.5. Đặc điểm biến đổi bộ gen của CIAV lưu hành ở miền Bắc
4.2.2. Đặc điểm di truyền của gen mãhóa capsid protein
4.2.2.1. Biến đổi di truyền ở cấp độ nucleotide
Đối với CIAV, sự biến đổi về trình tự nucleotide thường dao động
trong phạm vi 5% và tập trung ở vùng gen mã hóa cho protein VP1
(Ducatez & cs., 2006; Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013). Từ đó,
nghiên cứu tiếp tục phân tích đặc điểm di truyền của gen mã hóa capsid
protein (hình 4.6).
17


Vx_Cux-1_M55918

Vx_P4_AJ890284

Vx_3711_EF683159
VP7

HN1

VP8

BN1

C1

VP9

C5

VP10

C8

C10

C12

C13

C16

VP7

HN1

VP8

BN1

C1

VP9

VP10

C5

C8

C10

C12

C13

C16

VP7

HN1

VP8

BN1

C1

VP9

VP10

C5

C8

C10

C12

C13

C16

Vùng gen ít biến đổi
Vùng gen nhiều biến đổi

7 chủng CIAV lần lượt được so sánh với 3 chủng virus vacxin. Chủng P4 và
Cux-1 có trong các vacxin tương ứng là Nobilis CAV P4 và AviPro Thymovac.
Chủng 3711 được xác định là chủng virus vacxin qua thông tin truy cập ngân
hàng gen (EF683159). Vị trí có trình tự khác so với chủng vacxin tham chiếu
được biểu thị bằng màu tương ứng với nucleotide sai khác.

Hình 4.6. Kết quả so sánh trình tự phân đoạn gen ORF1
Kết quả cho thấy: 7 chủng CIAV đại điện sai khác nhau ở 27 vị trí
nucleotide so với chủng tham chiếu Cux-1; giữa chúng có mức tương đồng
gen cao về trình tự nucleotide (dao động từ 96,7% đến 99,8%); có 561/582 vị
trí (chiếm 93,39%) không có đột biến nucleotide và 21/582 vị trí (chiếm
3,61%) đột biến (đa hình nucleotide, polymorphic). Trong số 21 đột biến
điểm, vùng biến đổi của gen VP1 (Renshaw & cs., 1996) chiếm 5 vị trí
.
Tính chung trên chiều dài phân đoạn gen ORF1 được so sánh (582
18


nucleotide), 7 chủng CIAV này sai khác từ 4,64% đến 6,70% so với 3

chủng virus vacxin. Nhận xét tương tự cũng được rút ra về đặc điểm đột
biến trong khoảng nucleotide 1-200 và 201- 582 khi so sánh 6 chủng
CIAV của Việt Nam năm 2013 (BN1, HN1, VP7-VP10) với 3 chủng virus
vacxin (hình 4.6).
4.2.2.2. Biến đổi di truyền ở cấp độ amino acid
Phân tích trình tự amino acid suy diễn (vị trí 1 đến 194 của protein VP1)
của 7 chủng CIAV đại diện cho biết sự tương đồng rất cao (giống nhau ở
188/194 vị trí) và khác nhau ở 6 vị trí amino acid trên VP1.
Kết quả phân tích trình tự amino acid của các chủng CIAV thuộc nghiên
cứu cho phép khẳng định: 4 chủng (C5, C12, C13 và C16) mang trình tự
amino acid 75V97M139K144E là đặc trưng của nhóm 1 hoặc nhóm 3; 3 chủng
còn lại (C1, C8 và C10) mang trình tự amino acid 75I/T97L139Q144Q là đặc
trưng của nhóm 2. Như vậy, dự đoán có ít nhất hai nhóm di truyền của
CIAV lưu hành ở gà tại các địa điểm lấy mẫu.
4.2.2.3. Biến đổi amino acid ở các vị tríliên quan tới độc lực
Kết quả cho thấy: rõ ràng rằng không có chủng CIAV ở Việt Nam nào
có sự biến đổi liên quan đến kiểu hình của chủng CIAV có độc lực thấp:
75I- 89T- 125L- 141L- 144E (Todd & cs., 2002). Bên cạnh đó, chỉ có 2 chủng
(MH536105 và MH536106) có vị trí amino acid 394 (glutamin- Q) quy
định tính độc lực của CIAV được tìm thấy trong 4 chủng đại diện thuộc
nghiên cứu.
4.2.3. Nguồn gốc phát sinh chủng loại của CIAV lưu hành tại miền Bắc
4.2.3.1. Nguồn gốc phát sinh chủng loại dựa vào trình tự amino acid
đặc trưng
Sự khác biệt giữa 7 chủng CIAV đại diện của nghiên cứu này với 3
chủng virus vacxin và 6 chủng CIAV của Việt Nam (công bố năm 2013)
được làm rõ.
Giống như một số nghiên cứu đã công bố (Snoeck & cs., 2012;
Olszewska-Tomczyk & cs., 2016) cây phát sinh chủng loại dựa vào một
phần trình tự gen ORF1cho biết CIAV có thể chia thành 3 nhóm di truyền.

Trên cơ sở đó, 100% chủng virus lưu hành ở Việt Nam thuộc nhóm G2 và G3.
Đáng chú ý, 7/7 chủng CIAV của nghiên cứu này không nằm cùng nhánh với
các chủng virus vacxin (chủng P4, Cux-1 và3711). Thêm vào đó, kết quả so
sánh trình tự amino acid với chủng virus vacxin (P4) cho biết: (i) 4 chủng
CIAV thực địa trong nghiên cứu này (chủng C5, C12, C13 và C16) có 3 vị trí
sai khác và(ii) 3 chủng (C1, C8 và C10) có 7 vị trí sai khác.

19


Vị trí amino acid
14 22 75 92 97 125 139 144 152

94,2%

A

H

V

G

M

L

K

E

V

A

H

V

G

M

L

K

E

V

A

H

V

G

M

L

K

E

V

A

H

V

G

M

L

K

E

V

A

H

V

G

M

L

K

E

V

A

H

V

G

M

L

K

E

V

A

H

V

G

M

L

K

E

V

A

H

V

G

M

L

K

E

V

A

H

V

D

M

I

K

E

M

S

H

V

G

M

I

K

D

V

A

N

I

G

L

I

Q

Q

V

A

N

I

G

L

I

Q

Q

V

A

N

I

G

L

I

Q

Q

V

A

Q

I

G

L

I

Q

Q

V

A

Q

I

G

L

I

Q

Q

V

A

H

V

G

M

I

K

E

V

3a

3b

2

1

Ghi chú: Dựa vào các chủng tham chiếu đã biết nhóm di truyền, CIAV được
chia thành nhóm 1, nhóm 2 vànhóm 3 (phân nhóm 3a, 3b). Giá trị bootstrap tại
các nút node của cây phát sinh chủng loại được hiển thị cho phân nhánh chính.
Bảng đính kèm liệt kê các vị trí có thay đổi amino acid được mã hóa, trong đó các
vị trí amino acid đặc trưng nhóm di truyền được đánh dấu màu xám. Những vị trí
amino acid có sai khác giữa 7 chủng CIAV trong nghiên cứu này với chủng virus
vacxin P4 được đóng khung.

Hình 4.7. Cây phát sinh loài của CIAV dựa vào gen ORF1
Như vậy, các kết quả trình bày ở trên cho thấy: (i) có hai nhóm di
truyền của CIAV lưu hành ở gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận khi dựa
vào gen ORF1 (nhóm di truyền G2 vàG3 với 2 phân nhóm phụ là G3a,
G3b); (ii) các chủng virus này khác với chủng virus vacxin phòng bệnh
thiếu máu truyền nhiễm hiện có trên thị trường Việt Nam (CAV P4AJ890284). Kết quả trên cũng phù hợp với công bố của nghiên cứu (Craig
& cs., 2009) khi khẳng định các chủng CIAV lưu hành tại Argentina có
chung trình tự amino acid tại các vị trí 22, 75, 97, 139, 144 và 414 và khác
so với các chủng virus vacxin (Cux-1, Del-Ros) được sử dụng ở 4 vị trí 75,
97, 139, 144. Theo đó các chủng CIAV lưu hành được xếp vào nhóm di
truyền G1, khác với các chủng virus vacxin thuộc về nhóm di truyền G2.

Các kết quả thu được làm rõ thêm sự lưu hành rất phổ biến và đa nhóm di
truyền của CIAV ở miền Bắc Việt Nam.
4.2.3.2. Nguồn gốc phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide
Nguồn gốc phát sinh chủng loại của CIAV lưu hành ở miền Bắc dựa
20


vào trình tự nucleotide được phân tích dưới nhiều cấp độ. Cây phát sinh
loài của CIAV được xây dựng từ bộ gen hoàn chỉnh (n = 162), gen VP1
hoàn chỉnh (n = 395) và một phần gen VP1. Kết quả: không có chủng
CIAV nào của Việt Nam (được thu thập trong năm 2013, 2016 và 2017)
nằm cùng nhóm với các chủng virus vacxin. Tất cả các chủng CIAV phân
lập được ở Việt Nam đều thuộc genogroup G2 và G3.

Ghi chú: các chủng được phân chia thành 3 nhóm riêng biệt từ G1 đến G3. Các chủng
CIAV phân lập ở Việt Nam được biểu thị bằng màu tím và đánh dấu bằng mũi tên
theo năm phân lập: 2013 (mũi tên trống), 2016 (đầu mũi tên), 2017 (mũi tên đầy).

Hình 4.8. Cây phát sinh loài của CIAV dựa trên gen VP1 hoàn chỉnh
4.2.4. Đặc điểm phát tán theo không gian và thời gian của CIAV lưu
hành tại miền Bắc
Để nghiên cứu một cách đầy đủ và chính xác nhất về nguồn gốc phát
sinh, quá trình phát tán theo không gian và thời gian của CIAV lưu hành ở
miền Bắc, nghiên cứu đã phân tích cơ sở dữ liệu gồm 984 trình tự gen
(hình 4.9).
21


Hình 4.9. Kết quả xác định đặc điểm phân nhánh CIAV
Kết quả phân tích cho biết có 2 genogroup là G2 và G3 lưu hành ở

miền Bắc Việt Nam. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này đã phân tích sự phát
tán của virus theo không gian và thời gian cho từng genogroup.
4.2.4.1. Đặc điểm phát tán theo không gian vàthời gian của genogroup G2
CIAV thuộc genogroup G2 lưu hành ở miền Bắc thuộc về 2 nhánh, ký
hiệu là G2.1 và G2.2. Kết quả phân tích cơ sở dữ liệu gồm 344 trình tự ORF1
của genogroup G2 dự đoán CIAV thuộc nhóm này phát sinh từ khoảng
những năm 1971, khoảng tin cậy 95% trong khoảng 1963 - 1976. Chủng
virus tổ tiên của genogroup này được dự đoán có nguồn gốc từ Nhật Bản. Ở
các nhánh chính của cây phát sinh chủng loại, đã dự đoán có sự phát tán của
CIAV qua một số nước, ví dụ: Nhật Bản -> Braxin, Braxin -> Argentina, v.v...
22


4.2.4.2. Đặc điểm phát tán theo không gian vàthời gian của genogroup G3
Kết quả phân tích cơ sở dữ liệu gồm 601 trình tự ORF1 của genogroup G3
dự đoán CIAV thuộc nhóm này phát sinh từ khoảng những năm 1941, khoảng
tin cậy 95% trong khoảng 1921 - 1960. Giống như genogroup G2, chủng virus
tổ tiên của genogroup G3 cũng được dự đoán có nguồn gốc từ Nhật Bản. Ở các
nhánh chính của cây phát sinh chủng loại, đã dự đoán có sự phát tán của CIAV
qua một số nước: Nhật Bản -> Braxin, Nhật Bản -> Mỹ, v.v...
CIAV lưu hành tại miền Bắc Việt Nam thuộc genogroup G3 chiếm số
lượng nhiều nhất (62/73 trình tự gen ORF1). Đáng chú ý, kết quả cho thấy
chúng có nguồn gốc không thuần nhất (thuộc về nhiều nhánh khác nhau
của cây phát sinh chủng loại, nhánh G3.1- G3.3). Về nguồn gốc, CIAV ở
miền Bắc thuộc genogroup G3 được dự đoán bắt nguồn từ chủng virus lưu
hành ở một số quốc gia như: Trung Quốc (nhánh G3.3), Đài Loan (nhánh
G3.2); vàBa Lan (nhánh G3.1). Dựa vào đặc điểm phân nhánh này, kết quả
phân tích cho biết có nhiều đợt xâm nhập của genogroup G3 vào Việt Nam.
CIAV thuộc nhánh G3.1, G3.2 vàG3.4 sau khi xâm nhập, có khả năng đã
tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và tiếp tục lây lan ra các địa

phương khác. Một trong những nguyên nhân về nguồn gốc của các chủng
CIAV tại Việt Nam do công tác nhập nội giống từ Mỹ, Trung Quốc, Thái
Lan từ những năm 1990 (Duc Nv, 2008). Bên cạnh đó, hoạt động trao đổi
thương mại động vật sống với Trung Quốc diễn ra thường xuyên đã góp
phần làm xuất hiện các vụ dịch cúm gia cầm ở gà, là điều kiện thuận lợi để
phát tán các chủng CIAV tại Việt Nam (Desvaux & cs., 2016).
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1) Về sự lưu hành virus và bệnh thiếu máu truyền nhiễm
- Đã xác định được CIAV lưu hành rộng rãi ở đàn gà nuôi tại 10
tỉnh/thành phố miền Bắc Việt Nam với tỷ lệ nhiễm trung bình theo cá thể và
trang trại lần lượt là 62,2% và 73,4%;
- Gà ở mọi lứa tuổi, mục đích chăn nuôi, quy mô và phương thức chăn
nuôi đều nhiễm CIAV với tỷ lệ khác nhau; tuy nhiên chỉ thấy sự sai khác rõ
rệt về tỷ lệ nhiễm ở yếu tố phương thức chăn nuôi (nuôi thả tự do có tỷ lệ
nhiễm 80,5% cao hơn so với nuôi nhốt 52,6%);
- Bệnh thiếu máu truyền nhiễm đã xuất hiện ở đàn gà nuôi tại miền Bắc,
với biến đổi bệnh tích đại thể điển hình ở gà mắc tự nhiên là teo cơ quan
lympho và tủy xương nhạt màu;
- CIAV lưu hành ở miền Bắc có độc lực; khi gây bệnh thực nghiệm đã
23