Nghiên cứu vi khuẩn lactic phân lập từ một số sản phẩm lên men

Khóa luận tốt nghiệp

1

MỞ ĐẦU
Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng việc lên men bằng vi sinh vật để chế
biến và bảo quản thực phẩm. Công nghệ lên men thực phẩm đã được khởi xướng
cách đây ít nhất 6000 năm (Hol zapfef, 2000). Lên men lactic là một trong những
ứng dụng vi sinh vật đầu tiên mà con người phát hiện được, người ta đã sử dụng
vi khuẩn lactic để chế biến và bảo quản sữa, thịt, cá, các loại rau, quả, …
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, hình
cầu hay hình que, chúng lên men đường tạo ra sản phẩm chính là axit lactic.
Trong quá trình lên men ngoài axit lactic chúng còn tạo ra các sản phẩm khác
như các axit hữu cơ, diacetyl, enzyme, ester, … làm tăng hương vị, màu sắc, kết
cấu, giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Một số chủng vi khuẩn lactic sản sinh ra
bacterioxin có khả năng kháng lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh và được ứng
dụng như một chất để bảo quản thực phẩm. Bên cạnh ứng dụng trong công nghệ
thực phẩm, vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau
như trong y học, trong chăn nuôi để ủ chua thức ăn cho gia súc, trong các ngành
công nghiệp hoá chất, vật liệu, dệt, xử lý môi trường, ...
Hệ vi khuẩn lactic chủ yếu có trong các sản phẩm lên men như dưa chua,
sữa chua, nem chua, tré, tôm chua, một số sản phẩm lên men tiêu hoá đông khô,
… Các sản phẩm lên men, đặc biệt là sản phẩm lên men truyền thống phụ thuộc
chủ yếu vào hệ vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu, dụng cụ, môi trường bên
ngoài, tay nghề của người chế biến … làm cho chất lượng sản phẩm không ổn
định. Việt Nam là nước có nền văn hoá ẩm thực phong phú và hấp dẫn, đặc biệt
là các sản phẩm lên men truyền thống. Tuy nhiên việc sản xuất chủ yếu theo
phương pháp thủ công nên chất lượng sản phẩm chịu ảnh hưởng của yếu tố bên
ngoài rất nhiều. Do đó, nghiên cứu để tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn lactic
có khả năng lên men mạnh sẽ góp phần làm nâng cao và ổn định chất lượng sản
phẩm.

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

2

Để góp phần nhỏ trong hướng nghiên cứu vi khuẩn lactic làm cơ sở cho
việc nâng cao chất lượng của các sản phẩm lên men truyền thống, chúng tôi thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu vi khuẩn lactic phân lập từ một số sản phẩm lên
men”. Qua đó, bước đầu phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn
lactic có khả năng sản sinh axit lactic mạnh, khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng
đến quá trình lên men của chúng, từ đó có thể ứng dụng để sản xuất một số sản
phẩm lên men.

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

3

Phần 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. VI KHUẨN VÀ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN
Vi khuẩn (Bacteria) là một trong ba nhóm của vi khuẩn thật (Eubacteria)
thuộc vi sinh vật nhân nguyên thuỷ (Prokaryotes).
Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau.

Đường kính của vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2 - 2,0 µm, chiều dài cơ thể
khoảng 2,0 - 8,0 µm. Vi khuẩn có nhiều hình dạng như hình cầu, hình que, hình
dấu phẩy, hình xoắn, hình có cuống, hình có sợi, … Ngoài ra, còn có thể gặp các
hình dạng khác của vi khuẩn như hình khối vuông, khối tam giác, khối ngôi sao,
… Hình thái và cách sắp xếp tế bào là một trong những tiêu chuẩn để phân loại vi
khuẩn [11, 20].
Mỗi tế bào vi khuẩn đều có kích thước rất nhỏ bé và rất nhẹ (Escherichia
coli có kích thước 2,0 x 0,5µm) [11].
Tế bào của vi khuẩn được bao bọc bởi thành tế bào với thành phần đặc
trưng là peptidoglycan. Dựa vào cấu trúc và thành phần hoá học của thành tế bào
mà vi khuẩn được chia làm 2 loại là vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.
Thành tế bào giúp duy trì hình dạng, bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất
lợi. Ở một số vi khuẩn bên ngoài thành tế bào còn có một lớp bao nhầy hay còn
gọi là giáp mạc. Đó là một lớp vật chất dạng keo có độ dày nhất định. Thành
phần chủ yếu của bao nhầy là polisaccharit ngoài ra còn có polipeptit và protein
[1, 7].
Màng tế bào của vi khuẩn đựoc cấu tạo bởi 2 lớp photpholipid và các
protein nằm ở phía trong, phía ngoài hay xuyên màng. Màng tế bào của vi khuẩn
cấu tạo theo mô hình khảm lỏng [11].
Bên trong màng tế bào vi khuẩn là tế bào chất. Tế bào chất là phần vật
chất dạng keo có chứa các protein, acid nucleic, hydratcacbon, lipid, ribosome

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

4

70S, …Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ ( hạt

glycogen, hạt PHB (poly - β - hydroxybutyrate), …), hạt cacboxixom, … [1]
Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên
không có hình dạng cố định. Đó là một nhiễm sắc thể duy nhất dạng vòng chứa
một sợi AND xoắn kép còn gắn với màng tế bào chất. Nhiều vi khuẩn còn chứa
AND ngoài nhiễm sắc thể. Đây là những sợi AND xoắn kép, dạng vòng kín, có
khả năng sao chép một cách độc lập và gọi là plasmid. Thể nhân là cơ sở vật chất
chứa thông tin di truyền của vi khuẩn [11].
Một số vi khuẩn có khả năng di chuyển là nhờ chúng có các tiên mao.
Tiên mao là những sợi lông dài được cấu tạo bởi các phân tử protein là flagellin,
mọc ở mặt ngoài vi khuẩn. Không phải mọi vi khuẩn đều có tiên mao. Tiên mao
quyết định khả năng và phương thức di động của vi khuẩn. Số lượng và vị trí gắn
của tiên mao trên tế bào vi khuẩn có giá trị trong phân loại vi khuẩn. Ở một số vi
khuẩn có khuẩn mao (tiêm mao, nhung mao) là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn
mọc quanh bề mặt vi khuẩn; chúng có tác dụng giúp vi khuẩn bám vào giá thể.
Có một loại khuẩn mao đặc biệt gọi là khuẩn mao giới tính, chúng có thể nối liền
giữa hai vi khuẩn và làm cầu nối để truyền vật chất di truyền từ thể cho sang thể
nhận [11, 20, 43].
Vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng rất lớn, tốc độ này phụ thuộc vào điều kiện
dinh dưỡng, nhiệt độ, mức độ hiếu khí và nhiều yếu tố khác. Một số vi khuẩn vào
cuối thời kì sinh trưởng phát triển sẽ sinh ra trong tế bào một thể nghỉ có dạng
hình cầu hay hình bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử. Mỗi tế bào chỉ hình
thành một bào tử do đó bào tử của vi khuẩn không phải là cơ quan sinh sản mà có
thể coi như một hình thức bảo vệ đặc biệt hay hình thức sống tiềm sinh, chuyển
từ trạng thái hoạt động sang trạng thái nghỉ. Chỉ có một số chi vi khuẩn có khả
năng sinh bào tử như Clostridium, Bacillus, Sporasarcina, Desulfotomaculum, …
[1]
Vi khuẩn sinh sản chủ yếu theo phương thức sinh sản vô tính bằng cách
trực phân, từ một tế bào mẹ cho ra hai tế bào con. Ngoài ra một số loài vi khuẩn

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33

Khóa luận tốt nghiệp

5

cũng tồn tại phương thức sinh sản hữu tính nguyên thuỷ, hai tế bào có sự khác
biệt nhau về di truyền tiếp hợp với nhau đưa tới sự tái tổ hợp di truyền [11, 25].

II. VI KHUẨN LACTIC
1. Sơ lược về tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic
Quá trình lên men axit lactic để chế biến, bảo quản thực phẩm cũng được
sử dụng từ lâu. Axit lactic lần đầu tiên được tách ra từ sữa bò lên men bởi nhà
hoá học Thuỵ Điển Scheele vào năm 1780 .
Năm 1875 Pasteur đã chứng minh việc làm chua sữa là kết quả hoạt động
của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic [11].
Đến năm 1878 Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và
đặt tên là bacterium lactis (hiện nay gọi là Streptococcus lactis) và từ đó nhiều
loài vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập. Công nghiệp lên men sản xuất
axit lactic có thể nói đã được hình thành từ năm 1881 [11].
Năm 1919, Orla-Jensen là người đầu tiên nghiên cứu và phân loại có hệ
thống vi khuẩn lactic [33].
Sau này rất nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về vi khuẩn lactic trong các
sản phẩm khác nhau như thịt, rượu vang, sữa, …
Đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic và những ứng dụng của chúng
trên thế giới và trong nước.
* Trên thế giới
Năm 2004, Kacem Mourad và cộng sự đã nghiên cứu vi khuẩn lactic để
ứng dụng vào việc lên men quả oliu xanh Algeri [32].
Năm 2005, Jamal S.Y Haddadin nghiên cứu vi khuẩn lactic phân lập từ

phomat trắng làm từ sữa cừu nguyên liệu [31]
Năm 2010, Yi - seng Chen và cộng sự đã nghiên cứu về những đặc điểm
của vi khuẩn lactic phân lập từ quả dâu tằm chín ở Đài Loan [40].
Năm 2011, Lin Kiat Saw và cộng sự nghiên cứu về quá trình lên men
nước trái cây nhiệt đới bằng vi khuẩn lactic [35].

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

6

Năm 2011, Sook Jong Rhee và cộng sự nghiên cứu về tầm quan trọng của
vi khuẩn lactic trong thực phẩm lên men châu Á [38].
* Ở trong nước
Năm 2002, Võ Nhân Hậu nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn lactic và ứng
dụng để sản xuất cải bẹ muối chua [29].
Năm 2002, Vương Trọng Hào, Tống Thị Mơ nghiên cứu quá trình lên men
sữa chua - canxi [30].
Năm 2007, Nguyễn Thế Trang, Trần Đình Mấn đã nghiên cứu ứng dụng
của chủng Pediococcus pentosaceus HN02 để sản xuất chế phẩm bảo quản cá
[13].
Năm 2008, Nguyễn Thế Trang và Trần Đình Mấn nghiên cứư về đặc điểm
phân loại của hai chủng vi khuẩn lactic HN11 và HN34 sinh tổng hợp L+(-) axit
lactic phân lập tại Việt Nam [14].
Năm 2008, Mai Đàm Linh và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm sinh học
của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn Hà Nội [8].
Năm 2011, Nguyễn Hoài Hương và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn
một số chủng vi khuẩn lactic từ nem chua truyền thống để làm giống khởi động

nem chua probiotic [12].
Năm 2012, Nguyễn Thi Diễm Hương, Đỗ Thị Bích Thuỷ đã nghiên cứu
một số tính chất có lợi của chủng Lactobacillus fermentum DC1 phân lập từ sản
phẩm dưa cải Huế [15].
Hiện nay một hướng trong nghiên cứu vi khuẩn lactic là nghiên cứu khả
năng tạo thành chất kháng khuẩn để ứng dụng chúng trong sản xuất probiotic.
2. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic
Trong tự nhiên vi khuẩn lactic thường gặp trong đất, không khí, nước
nhưng chủ yếu ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm như: các loại rau quả, thịt,
sữa, các sản phẩm của sữa, ... Các loài Lactobacillus còn tìm thấy ở dạ dày, ruột
non, ruột già và âm đạo.

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

7

Các vi khuẩn lactic không giống nhau về mặt hình thái nhưng về mặt sinh
lý chúng có chung những đặc điểm đặc trưng. Các vi khuẩn lactic được xếp vào
họ Lactobacteriaceae [20].
Vi khuẩn lactic không đồng nhất về hình thái gồm các vi khuẩn hình cầu,
hình que, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc xếp thành cặp, thành chuỗi.
Streptococcus lactis là vi khuẩn có hình bầu dục thường đứng thành đôi hay
thành chuỗi ngắn, Streptococcus cremoris có tế bào dạng hình cầu đứng thành
chuỗi, Lactobacilus bulgaricum có tế bào dạng que dài, …[10] Kích thước của
chúng thay đổi tuỳ thuộc vào từng loài. Streptococcus lactis 2 µm, Pediococcus
halophilus 0,6 -1,0 µm, Lactobacillus (0,3 - 1,0) x (1,0 -20) µm, ... [25]
Vi khuẩn lactic đều là những vi khuẩn Gram dương, không tạo thành bào

tử (kể cả Sporolactobacillus inulinus) và hầu hết không di động. Tế bào vi khuẩn
lactic không chứa cytocrom và enzyme catalase tuy nhiên chúng vẫn có thể sinh
trưởng khi có mặt oxigen. Vi khuẩn lactic là bọn sống từ kị khí tới vi hiểu khí
[11].
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khá phức tạp. Không một đại diện
nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết
chứa glucose và NH4+. Đa số chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin, tiamin,
axit pantotenic, iotin, …) và các amino axit. Vì vậy môi trường nuôi cấy vi khuẩn
lactic khá phức tạp. Vi khuẩn có khả năng lên men tạo axit lactic bằng cách phân
giải nguồn hydrat cacbon có trong môi trường [1,11].
Vi khuẩn lactic có khả năng trao đổi chất kém. Có thể là do hậu quả của sự
chuyển hoá sinh trưởng trong sữa hoặc trên môi trường giàu chất dinh dưỡng và
chất sinh trưởng chúng đã mất đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đổi. Tuy
nhiên chúng lại có khả năng mà đa số các vi khuẩn khác không có , đó là khả
năng sử dụng lactose. Việc sử dụng được lactose cũng có thể được xem như một
sự thích nghi với các điều kiện tồn tại trong đường ruột của động vật có vú [1].

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

8

3. Cơ chế của quá trình lên men vi khuẩn lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hoá kị khí đường với sự tích luỹ axit
lactic trong môi trường. Có hai kiểu lên men lactic là lên men lactic đồng hình và
lên men lactic dị hình.
3.1. Lên men lactic đồng hình
Quá trình lên men lactic đồng hình tạo ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic

Phương trình chung của quá trình lên men:
2 CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

C6H12O6

Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose được chuyển hoá theo
con đường EMP. Những vi khuẩn thuộc nhóm này chứa các enzyme cần thiết cho
sự phân giải glucose, trong đó có hai enzyme quan trọng là enzyme aldolase và
triosophophate izomerase. Trước tiên glucose sẽ được chuyển hoá thành
pyruvate. Do đa số các vi khuẩn lên men lactic không chứa enzyme
decacboxylase nên axit pyruvic tiếp tục bị khử để tạo thành axit lactic nhờ lactate
dehydrogenase cùng với sự tham gia của NADH 2 đã được tạo ra trong phản ứng
loại 2H+ của glyceraldehyde-3-phosphate. Và tuỳ thuộc vào enzyme lactate
dehdrogenase và sự tồn tại của lactate racemase mà axit lactic tạo ra có thể ở
dạng đồng phân D, L hay cả hai. Chỉ có một phần rất nhỏ axit pyruvic được
decacboxyl hoá và chuyển thành axit acetic, ethanol và CO2 [1, 22] .
Một số loài vi khuẩn lên men đồng hình: Lactococus lactis, Streptococcus
thermophilus,

Lactobacillus

helveticus,

Lactobacillus

delbruckii

subsp.

bulgaricum (thường được sử dụng làm giống khởi động trong lên men sữa),

Pediococcus sp (thường sử dụng trong lên men xúc xích), Tetragenococcus (dùng
trong lên men nước đậu nành), … [10, 36]
C6H12O6
2 NAD+

2 NADH2

CH3CHOHCOOH
Hình 1.1. Quá trình lên men đồng hình

3.2. Lên men lactic dị hình

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33

2 CH3COCOOH


Khóa luận tốt nghiệp

9

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men kị khí phức tạp hơn nhiều so
với lên men lactic điển hình. Ngoài acid lactic chúng còn tạo ra trong môi trường
các sản phẩm phụ như acid acetic, rượu ethylic, CO 2, H2O, một số chất thơm như
este, điacetyl…[7]
Phương trình của quá trình lên men:
C6H12O6

CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + CO2

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme của con đường EMP
(aldolase, triosophotphate isomerase) nên giai đoạn đầu của sự phân giải xảy ra
theo con đường pentosephosphate, tức là qua glucose - 6 - phosphate, 6 phosphogluconat và ribulose-5-phosphate. Chất này nhờ một epimease được
chuyển thành xilulose - 5 - phosphate. Sau đó dưới tác dụng của phosphoketolase
phân giải xilulose - 5 - phosphate thành gliceraldehyde - 3 - phosphate (AlPG) và
acetylphosphate. AlPG sẽ bị oxi hoá thành axit lactic, quá trình này xảy ra giống
như trong sự lên men đồng hình; còn acetylphosphate có thể chuyển hoá thành
ethanol và acid acetic [11].
Một số loài vi khuẩn lên men lactic dị hình: L. mesenteroides subsp.
cremoris, Leuconostoc lactis (trong lên men sữa), Leuconostoc kimchii ( dùng
trong lên men rau), Oenococcus oeni (sử dụng trong lên men rượu),
Lactobacillus sanrancis-censis (được sử dụng trong lên men bánh mì), … [36]
AlPG
Glucose

Xilulose-5P

Pyruvate

Lactate

Pentosophosphoketolase
Acetaldehyde
Acetyl-P

Ethanol

Acetyl-ScoA
Axit acetic

Hình 1.2. Quá trình lên men lactic dị hình

* Lên men lactic dị hình ở Bifidobacterium: Vi khuẩn lactic dị hình
Bifidobacterium bifidum có dạng chữ V hay chữ Y (bifidus tiếng Hi Lạp có nghĩa
là bị chia đôi, bị phân cắt), là thành viên trong khu hệ đường ruột của trẻ sơ sinh,

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

10

trước hết là các trẻ nuôi bằng sữa mẹ. Vi khuẩn này cần N-acetilglucosemin chỉ
có trong sữa người mà không có trong sữa bò. Các đại diện thuộc chi
Bifidobacterium là những vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt, không chịu khí và cần
một khí quyển chứa CO2 (10% CO2) để sinh trưởng. Bifidobacterium chuyển hóa
glucose theo phương trình:
2 C6H12O6

2 CH3CHOHCOOH

+ 3 CH3COOH

Bifidobacterium lên men glucose qua con đường phụ phosphoketolase,
không chứa aldolase cũng như glucose-6-phosphat-dehydrogenase, song lại chứa
các phosphoketolase hoạt động, phân giải fructose-6-phosphat và xilulose - 6
-phosphat thành acetylphosphate và eritro-4-phosphate hoặc glixeraldehyde-3phosphate. Glixeraldehyde-3-phosphate sẽ tiếp tục biến đổi để tạo thành axit
lactic [1].
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ngoài đảm bảo đầy đủ các chất dinh
dưỡng mà còn phải không chứa các độc tố và cho hiệu suất thu hồi sản phẩm lớn.
Mỗi nguồn dinh dưỡng không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn mà
còn ảnh hưởng không nhỏ đến sự thu hồi sản phẩm và bảo quản chế phẩm sinh
khối sau này.
Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng khá phức tạp. Mỗi loại vi khuẩn
lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Quá trình lên men lactic
của vi khuẩn lactic chịu tác động của nhiều yếu tố như: nguồn carbon, nguồn
nitrogen, pH, nhiệt độ, hàm lượng NaCl, thời gian nuôi cấy, …
4.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng phát triển
cũng như quá trình tạo ra axit lactic của vi khuẩn lactic. Lựa chọn thời gian phù
hợp sẽ thu được lượng axit lớn nhất.

4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

11

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi
khuẩn. Mỗi loài vi sinh vật có yêu cầu nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của
chúng. Vi khuẩn lactic có khoảng nhiệt độ phát triển khá rộng từ 10 oC - 40oC.
Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều làm ức chế hoạt động của các enzyme, làm
đình trệ các phản ứng trao đổi chất, ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát
triển của vi khuẩn. Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ tối thích trong khoảng 25 oC
- 35oC, loại ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 oC - 45oC, loại ưa lạnh có thể phát

triển ở nhiệt độ 5oC. Khi gia nhiệt từ 60oC - 80oC thì hầu hết các vi khuẩn lactic
bị chết sau 10 - 30 phút.
Nhiệt độ lên men ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và chất lượng
sản phẩm. Ở nhiệt độ 0 - 4oC sự lên men lactic không bị đình chỉ mà diễn ra
chậm. Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại vi khuẩn là 35 - 42 oC nhưng nhiệt độ này
cũng kích thích hoạt động của nhiều sinh vật lạ.
4.3. Ảnh hưởng của pH
Mỗi loài vi sinh vật có một pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển.
Các loài vi khuẩn lactic khác nhau có khả năng tạo thành axit lactic khác nhau
nên khả năng chịu axit cũng khác nhau tuỳ loại. Vi khuẩn lactic có thể phát triển
trong khoảng pH từ 4,4 - 9,3. Trong quá trình lên men tạo ra axit lactic làm cho
pH của môi trường giảm. Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men lactic, axit
lactic sinh ra có tác dụng ức chế các vi sinh vật khác nhưng sau đó khi hàm lượng
axit lactic quá lớn sẽ gây ức chế chính vi khuẩn lactic. Tốc độ phát triển cũng
như lượng sản phẩm trao đổi chất sẽ giảm khi axit lactic tạo ra quá nhiều. Vì vậy,
trong quá trình sản xuất người ta luôn điều chỉnh pH về khoảng tối ưu để vi
khuẩn lactic phát triển. Mỗi loại vi khuẩn lactic có các khoảng pH tối thích khác
nhau, dao động trong khoảng 4,5 - 6,5. Lactobacillus có pH tối ưu 5,6 - 6,2,
Pediococcus 5,5 -6,5, pH < 4 vi khuẩn lactic ngừng hoạt động (Trần Minh Tâm,
1998). Ngoài ra, một số loài có thể phát triển trong môi trường axit mạnh hoặc
kiềm mạnh như loài Lactobacillus fermentum có thể chịu được pH =3. Theo

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

12

Giraud và công sự (1991), đối với vi khuẩn Lactobacillus plantarum A6, sự giảm

pH sẽ làm giảm sự chuyển hoá cơ chất.
4.4. Ảnh hưởng của oxygen
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kị khí không bắt buộc. Do đó, oxi không ảnh
hưởng lớn đến quá trình lên men lactic tuy nhiên trong điều kiện thiếu oxi thì vi
khuẩn lactic hoạt động tốt hơn, quá trình lên men lactic thuận lợi hơn (Trần Minh
Tâm, 1998). Sự hiện diện của oxygen sẽ làm tăng hoạt động của các vi khuẩn gây
thối và các vi khuẩn khác làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Vì vậy, quá
trình lên men lactic thường được tiến hành trong điều kiện kị khí.
4.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon
Cacbon là nguyên tố đóng vai trò quan trọng đối với mọi sinh vật. Nguồn
cacbon được dùng để tham gia cấu tạo nên tế bào vi sinh vật vừa cung cấp năng
lượng cho hoạt động sống của chúng. Vi khuẩn lactic phân giải các hyđrat carbon
tạo ra axit lactic. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat carbon như:
glucose, fructose, galactose, các loại đường đôi (saccharose, lactose, mantose),
các polysaccharit (tinh bột, detrin, …). Nguồn carbon tốt nhất là các
monosaccharit và disaccharit. Khả năng gây lên men và tốc độ lên men các loại
đường ở các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì khác nhau. Streptococcus lactis
lên men được glucose, lactose, galactose, maltose, dextrin mà không lên men
được saccharose. Streptococcus cremoris lên men lactose tạo thành axit lactic
nhưng không lên men được saccharose, maltose và dextrin [21].
4.6. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen
Nitrogen cũng là một trong những nguyên tố đóng vai trò quan trọng đối
với mọi sinh vật, chúng là thành phần của protein, acid nucleic, … do đó nitrogen
có vai trò hêt sức quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của các vi
khuẩn. Mỗi loài vi khuẩn lactic có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Đa phần các
vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33

Khóa luận tốt nghiệp

13

nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ một số ít loài vi
khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ như
Lactobacillus helveticus. Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ
dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ
phức tạp có chứa nitơ như cao thịt, cao nấm men, pepton, casein, …
4.7. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl
Dung dịch muối ăn ở nồng độ cao sẽ ức chế hoạt động của vi sinh vật lạ
cũng như vi khuẩn lactic. Khi tiến hành muối chua ra quả cần phải tạo điều kiện
cho vi khuẩn lactic phát triển và ức chế các vi sinh vật khác. Do vậy cần sử dụng
nồng độ muối không quá cao thường sử dụng muối ăn nồng độ 4-6% hoặc nước
muối với nồng độ 6-10%.
5. Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic
Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic không chỉ tạo ra axit lactic mà
còn tạo ra nhiều hợp chất hữu cơ khác như điacetyl, các axit hữu cơ, bacteriocin,
các enzyme,… Các hợp chất này cho thực phẩm có màu sắc, mùi vị, hương thơm
hấp dẫn và có thể chống lại một số vi khuẩn gây bệnh, gây hư hỏng giúp kéo dài
thời gian bảo quản. Do đó, vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau: công nghiệp, nông nghiệp, y học, thực phẩm, môi trường, …
5.1. Trong công nghiệp
Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu axit lactic. Axit lactic có vị
chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước
uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt. Axit lactic còn dùng để sản xuất thức ăn
kiêng, thức ăn chống suy dinh dưỡng cho người già và trẻ em, … Nguyên liệu
dùng trong sản xuất axit lactic là mật bột, tinh bột và những nguyên liệu chứa
tinh bột (Lương Đức Phẩm, 2002). Trong công nghiệp để sản xuất axit lactic và
các loại lactat, người ta thưởng sử dụng loài vi khuẩn L. delbruckii và loài L.

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

14

coagulans. Hai loài vi khuẩn này đều thuộc loại vi khuẩn ưa nhiệt và có khả năng
tích luỹ nhiều axit lactic.
Vi khuẩn lactic là một trong hai nhóm liên quan đến sản xuất rượu vang
đỏ và trắng (Nannelli et al., 1008). Chúng thường được dùng làm giống khởi
động để lên men rươu. Vi khuẩn lactic đặc biệt là Oenococcus oeni (trước đây là
Leuconostoc oenos) thực hiện quá trình lên men thứ cấp hoặc lên men malolactic
bằng cách decacboxyl axit L-malic thành axit L-lactic và CO 2. Phản ứng này
cùng với hàng loạt các phản ứng khác xảy ra biến đổi hoàn toàn nước ép nho
thành rượu [33]. Trong một vài nghiên cứu trên dịch nước nho các tác giả
Fendant và Dole; Maret và Sozzi (1977,1979); Maret và sộng sự (1979) đã ghi
nhân lại sự có mặt của các loại vi khuẩn lactic lên men đồng hình thuộc giống
Lactobacillus (Lactobacillus pantarum, Lactobacillus casei) và một số vi khuẩn
lên men dị hình (Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii, …)
Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da,
dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo [22].
5.2. Trong nông nghiệp và môi trường
Vi khuẩn lactic được dùng để ủ chua thức ăn gia súc. Nhờ ủ chua mà thức
ăn có thể giữ được khá lâu ở trạng thái tươi mà vẫn không bị hao hụt về mặt chất
lượng dinh dưỡng. Về mặt vitamin thì thức ăn sau khi ủ chua lại giàu vitamin
hơn so với trước khi ủ. Để tạo điều kiện cho lên men lactic xảy ra, lá các loại cây
lấy củ hoặc cỏ ... được nén chặt trong các hầm ủ, thêm rỉ đường để nâng cao tỉ lệ
C/N và tạo độ chua ban đầu bằng cách thêm axit formic hay axit vô cơ [11].

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium loại nấm
gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp.
Chế phẩm EM (effective microogranism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu
nó bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự đóng góp của vi khuẩn lactic. Chế
phẩm này có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô
nhiễm môi trường.

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

15

Vi khuẩn lactic còn được sử dụng để cải thiện nguồn nước ở các ao nuôi
tôm.
5.3. Trong y học
Vi khuẩn lactic được sử dụng để chữa bệnh đường ruột, dùng trong phẫu
thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa.
Trong nha khoa có hai chế phẩm được sử dụng nhiều là Puramex và
Puracal. Puramex gồm có: almulinium lactat, Fe-lactat (được sử dụng để điều trị
bệnh thiếu máu), Mg-lactat, Zn-lactat. Còn Purical chỉ có lactat canxi. Các chế
phẩm này thường làm cho răng khoẻ hơn.
Vi khuẩn lactic được sử dụng để sản xuất probiotic giúp chữa một số bệnh
cho con người. Các tác dụng có lợi của thực phẩm có bổ sung các vi khuẩn sống
(probiotic) đến sức khoẻ của con người, đặc biệt là các sản phẩm sữa cho trẻ em
đang ngày càng được nghiên cứu bởi các chuyên gia y tế. Các chế phẩm sinh học
có khả năng miễn dịch, chức năng tiêu hoá, hô hấp và có thể có tác động dáng kể
trong việc giảm bệnh truyền nhiễm ở trẻ em [37].
Một số ứng dụng của probiotic như: chống lại Helicoacter pylori - một tác

nhân gây bệnh viêm dạ dày B, viêm tá tràng, ung thư dạ dày. Một số thí nghiệm
trên động vật cho thấy rằng vi khuẩn lactic có thể ức chế sự tăng trưởng của tác
nhân gây bệnh và giảm hoạt động của enzyme urease cần thiết cho các tác nhân
gây bệnh ở lại môi trường axit của dạ dày (Midolo và cộng sự, 1995;. Kabir et al,
1997; Aiba và cộng sự, 1998; Coconnier và cộng sự, 1998).
Một số bằng chứng sơ bộ cho thấy probiotic có thể ngăn ngừa hoặc trì
hoãn sự khởi đầu của bệnh ung thư, điều trị tim mạch, giảm cholesterol trong
máu. Chế phẩm probiotic còn có thể chữa bệnh viêm âm đạo do vi khuẩn [37].
5.4. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm
Trong lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm, vi khuẩn lactic được sử
dụng khá rộng rãi để tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau như dưa chua, sữa
chua, nem, tré, xúc xích, pho mat, …

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

16

Việc bảo quản sữa bằng quá trình lên men đã được con người sử dụng từ
rất sớm trong lịch sử. Thịt lên men đã được tạo ra từ thế kỉ 15 trước công nguyên
ở Babylon và Trung Quốc. Phương pháp lên men rau được biết ở Trung Quốc và
thế kỷ thứ ba trước công nguyên.
Trong bảo quản và chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng để
làm dưa chua, làm chua quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả. Trong
muối chua rau quả, trong điều kiện yếm khí, lên men lactic sẽ xảy ra một cách tự
nhiên, lúc đầu bởi Leuconostoc với sự tạo thành CO 2 và về sau có sự tham
gia của Lactobacillus plantarum.
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rất phổ biến trong sản xuất sữa và các sản

phẩm từ sữa như: sữa chua, igaua, kefia, pho mat, …. Để sản xuất sữa chua
người ta thường sử dụng một số loài vi khuẩn sinh axit lactic như:
Lactobacterium bulgaricus, L. acidophilum,

Streptococcus lactis hay

S.

cremoris và một lượng vi khuẩn sinh hương như Streptococcus diacetylacis,
Betacoccus citrovorus. Một loại iagua đặc biệt có tên là sữa aciđophilus được sản
xuất nhờ Lactobacillus acidophilus. Trong sản xuất kefia và kumis người ta
thường sử dụng vi khuẩn Streptococcus lactis và Lactobacillus caucaticus [1]
Một số loài vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh bacterioxin nên trong
ngành công nghiệp thực phẩm đã được ứng dụng nhiều. Khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin của vi khuẩn lactic được biết nhiều ở một số chủng thuộc chi
Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Lactobacillus, … Một số bacteriocin đã
và đang được nghiên cứu ứng dụng trong bảo quản các sản phẩm để chống lại
các vi khuẩn tạp nhiễm như Listeria, Clostridia, Bacillus spp., … [39]. Hiện nay
nisin là một bacteriocin được tổng hợp bởi Lactococcus lactis susp. Vi khuẩn
lactic được ứng dụng rộng rãi nhất trong bảo quản thực phẩm.

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

17
Bảng 1. Một số thực phẩm lên men ở châu Á [38]

Sản phẩm

Quốc gia

Bánh mì, mì lên men
India
Idli
Sri Lanka

Nguyên liệu
chính

Vi sinh vật

Gạo
Black gum

L. mesenteroides
S. faecalis

Hình thức /
Cách sử dụng
Làm phồng bánh

Puto

Philippines

Gạo

L. mesenteroides

S. faecalis

Làm phồng bánh

Đậu xanh

Trung
Quốc

Đậu xanh

L. mesenteroides

Mì sợi

Bột mì

Thái Lan,
Hàn Quốc,
Nhật Bản

Khanomjeen

Thái Lan

Gạo

Kim chi

Hàn Quốc

Bắp cải Hàn
Quốc, củ cải, một
số loại rau khác,
muối

L. mesenteroides
Lb. brevis,
Lb. plantarum

Dưa muối

Việt Nam

Bắp cải, rau

L. mesenteroides
Lb. plantarum

Dakguadong

Thái Lan

Lá mù tạt

Lb. plantarum

Cây mù tạt

Lb. brevis

Pediococcus cerevisiae

L. mesenteroides noodle
Lb. casei,
Lb. cellobiosus
Lb. fermenti
Lactobacillus sp.
Streptococcus sp.

Mì sợi

Rau lên men

Burong
Philippines
mustala
Thịt và cá lên men

Cá biển nấu chín
với kê, muối
Cá biển nấu chín
với kê, muối
Cá nước ngọt,
gạo, muối
Cá nước ngọt
muối, cơm rang

Sikhae

Hàn Quốc

Narezushi

Nhật Bản

Burong-isda

Philippines

Pla-ra

Thái Lan

Balao-balao

Philippines

Tôm, gạo, muối

Kungchao

Thái Lan

Tôm, gạo, muối

Nham

Thái Lan

Thịt lơn, galic,

muối, gạo

Nem chua

Việt Nam

Thịt lợn, muối,
cơm

Phần 2.
Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33

L. mesenteroides
Lb. plantarum
L. mesenteroides
Lb. plantarum
Lb. brevis,
Streptococcus sp.
Pediococcus sp.
L. mesenteroides
P. cerevisiae
P. cerevisiae
P. cerevisiae,
Lb. plantarum
Lb. brevis
Pediococcus sp.
Lactobacillus sp

Salad, món ăn
kèm

Salad, món ăn
kèm
Salad, món ăn
muối
Salad, món ăn
kèm
Món ăn kèm
Món ăn kèm
Món ăn kèm
Món ăn kèm
Đồ gia vị
Món ăn kèm
Thịt lợn gói
trong lá chuối
Giò


Khóa luận tốt nghiệp

18

ĐỐI TƯỢNG - THỜI GIAN - PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
I. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Một số chủng vi khuẩn lactic được phân lập các sản phẩm lên men như:
- Nước dưa chua: tự làm và mua ở chợ Tây Lộc
- Nem chua :
- Tôm chua: Bà Mai, Cao Bá Quát
- Sữa chua Vinamilk : Cửa hàng giới thiệu và bán sản phẩm Vinamilk, 168
Nguyễn Trãi

- Tré: cửa hàng Đông Ba, 25 Đào Duy Anh

II. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Từ tháng 2/2013 đến tháng 5/2013

III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Phân lập và đếm số lượng tế bào
1.1. Môi trường phân lập [10,19,27]
Để phân lập vi khuẩn lactic chúng tôi sử dụng môi trường MRS agar bổ
sung thêm CaCO3 .
Peptone

10g

Ammonium citrate 2 g

Cao thịt

10 g

MgSO4.7H2O

0,2 g

Cao nấm men

5g

MnSO4.H2O

0,05 g

Glucose

20 g

Agar

20 g

Tween 80

1 ml

CaCO3

5g

K2HPO4

2g

Nước cất

1000ml

CH3COONa

5g

pH

6,2 - 6,5

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

19

Môi trường sau khi pha chế được phân vào các bình tam giác và khử trùng
ở 1atm trong 20 phút. Sau khi khử trùng, phân phối môi trường vào các hộp Petri
đã khử trùng trong tủ cấy vô trùng.
1.2. Phân lập
- Đối với mẫu dạng lỏng (nước dưa cải chua, sữa chua, …): hút 1ml mẫu
cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng lắc đều ta có độ pha loãng 10 -1. Hút
ra 1 ml cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước vô trùng lắc đều ta có độ pha
loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ cần thiết (10-5).
- Đối với dạng rắn (nem, tré): nghiền nát mẫu bằng cối chày sứ đã khử
trùng, cân 1 g mẫu hoà tan vào bình tam giác chứa 9 ml nước vô trùng, ta có độ
pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ thích hợp (10-5).
Dùng pipette vô trùng (loại 1 ml) hút mẫu ở các độ pha loãng nhỏ vào bề
mặt thạch đĩa chữa sẵn môi trường (lượng mẫu cho vào đĩa có thể là một giọt hay
một lưưọng cụ thể). Dùng que gạt dàn đều mẫu trên bề mặt thạch. Mỗi nồng độ
pha loãng cấy lên 3 đĩa Petri. Sau đó bao gói cẩn thận và nuối cấy trong tủ ấm ở
nhiệt độ 30oC trong 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy chọn những khuẩn lạc mọc
riêng rẽ và có tạo vòng trong suốt ở xung quanh để cấy chuyền sang ống thạch
nghiêng. Sau khi ống giống mọc tốt giữ giống trong điều kiện lạnh.
1.3. Tính số lượng tế bào vi sinh vật [10, 19]

Xác định số lượng tế bào vi sinh vật trong 1g hoặc 1 ml mẫu bằng phương
pháp xác định gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch
đĩa.
- Số lượng vi khuẩn trong 1 g mẫu khô tuyệt đối được tính bằng công
thức:
CFU/g = M.a.10n /W
Trong đó:
CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colonie Forming Unit)
W: trọng lượng khô tuyệt đối của 1 g mẫu phân lập

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

20

a: số giọt pipete của 1 ml mẫu
M: số lượng khuẩn lạc trung bình/ hộp Petri
10n : độ pha loãng mẫu
- Số lượng vi khuẩn trong 1ml mẫu được tính theo công thức:
N = M.A.P
Trong đó:
N: số lượng tế bào vi sinh vật (CFU/ml)
M: số lượng khuẩn lạc trung bình trong một đĩa Petri
A: số giọt trong 1 ml mẫu
P: độ pha loãng
(Để tăng độ chính xác, giá trị M thường lấy trung bình cộng của 3, 5 hoặc
7 hộp Petri của cùng một độ pha loãng).
2. Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic [27,43]

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng phân giải CaCO3
Trong môi trường thạch đĩa MRS có bổ sung CaCO 3, vi khuẩn lactic khi
sinh trưởng và phát triển tạo ra axit lactic sẽ phân giải CaCO 3 tạo thành vòng
trong suốt xung quanh vạch cấy. Vòng càng lớn thì khả năng sinh axit càng
nhiều.
* Tiến hành:
Từ những chủng phân lập được tiến hành cấy vạch từng chủng lên môi
trường MRS có bổ sung thêm CaCO3 và nuôi trong 60 giờ ở nhiệt độ 30oC. Sau
đó, tiến hành đo kích thước vạch cấy (d) và vạch phân giải (D). Hiệu số giữa D
và d phản ánh khả năng tạo axit lactic của mỗi chủng.
3. Quan sát hình thái của vi khuẩn lactic
Tiến hành nhuộn đơn các chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn được, quan
sát dưới kính hiển vi ở vật kính X 100.

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

21

4. Phương pháp định lượng axit lactic [10, 27]
Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên men, thêm 20ml nước cất và 1 - 2
giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N.
Lượng axit lactic có trong 10ml dịch lên men được tính bằng cách lấy số
ml NaOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ nhân với 0,009 (1ml dung dịch NaOH
tương đương với 0,009g axit lactic).
5. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo axit lactic của các chủng
vi khuẩn lactic đã tuyển chọn
5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trong
môi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%). Sau các khoảng thời gian: 12,
24, 36, 48, 60, 72,84, 96 giờ, ly tâm (4000 vòng/10 phút) thu dịch lên men để
xác định axit tổng tích luỹ trong môi trường và đo OD bằng máy quang phổ kế ở
bước sóng 610 nm để xác định sinh khối tạo thành.
5.2. Ảnh hưởng của pH môi trường
Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trong
môi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%) ở các độ pH khác nhau: 4,0; 4,5;
5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8. pH môi trường được pha bằng đệm Mc Ilvaine. Nuôi cấy
trong khoảng thời gian tối ưu ở trên, sau đó ly tâm (4000 vòng/10 phút) thu dịch
lên men để xác định axit tổng tích luỹ trong môi trường và đo OD bằng máy
quang phổ kế ở bước sóng 610 nm để xác định sinh khối tạo thành.
5.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon
Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trong
môi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%) với các nguồn cacbon: glucose,
fructose, lactose, saccharose, tinh bột, CMC, rỉ đường. Nuôi cấy các chủng vi
khuẩn trong khoảng thời gian và pH tối ưu, sau đó ly tâm (4000 vòng/10 phút)

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

22

để thu dịch lên men để xác định axit tổng tích luỹ trong môi trường và đo OD
bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 610 nm để xác định sinh khối tạo thành.
5.4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen
Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trong
môi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%) với các nguồn nitrogen khác

nhau: peptone, cao thịt, ure, KNO 3, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO2. Nuôi cấy các
chủng vi khuẩn trong khoảng thời gian và pH tối ưu, sau đó ly tâm (4000
vòng/10 phút) để thu dịch lên men để xác định axit tổng tích luỹ trong môi
trường và đo OD bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 610 nm để xác định sinh
khối tạo thành.
5.5. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl
Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trong
môi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%) ở các nồng độ NaCl khác nhau:
1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%. Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trong
khoảng thời gian và pH tối ưu, sau đó ly tâm (4000 vòng/10 phút) để thu dịch
lên men để xác định axit tổng tích luỹ trong môi trường và đo OD bằng máy
quang phổ kế ở bước sóng 610 nm để xác định sinh khối tạo thành.
6. Xây dựng đồ thị chuẩn sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic
Nuối cấy vi khuản lactic trong môi trường MRS dịch thể trong 72 giờ. Ly
tâm (4000 vòng/10 phút) thu lấy sinh khối. Dùng cân phân tích cân chính xác 2g.
Lấy 1g cho vào chén cân, đêm sấy khô đến trọng lượng không đổi giữ các
lần cân. Tính trọng lượng khô tuyệt đối của 1 g sinh khối.
1 g sinh khối còn lại pha loãng trong nước vô trùng ở các độ pha loãng
khác nhau để đo mật độ quang ở bước sóng 610nm.
7. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mên
Microsoft Office Excel 2007.

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

23

Phần 3.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
I. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC
1. Phân lập và xác định số lượng vi khuẩn lactic
Chúng tôi đã tiến hành phân lập vi khuẩn lactic từ 8 sản phẩm lên men
trên địa bàn thành phố Huế: nước dưa cải chua (tự làm, mua ở chợ), nem chua,
tôm chua, nước củ cải muối chua, nước ớt chua, tré, sữa chua Vinamilk. Tiến
hành phân lập các mẫu trên môi trường MRS có bổ sung CaCO 3 và nuôi cấy ở
30oC trong 48 giờ. Qua phân lập, chúng tôi đã tách được 75 chủng vi khuẩn
lactic, kí hiệu là L1, L2, L3, …, L75. Tiến hành quan sát các khuẩn lạc vi khuẩn
mọc trên môi trường thạch đĩa, chúng tôi nhận thấy khuẩn lạc vi khuẩn có những
dạng sau:
- Đa số khuẩn lạc có kích thước 0,5 - 1,5 mm, dạng tròn, trơn, láng, bờ
đều, nhô, màu trắng đục hoặc trắng sữa, một số khuẩn lạc có màu trắng trong
hoặc vàng kem.
- Ngoài ra, một số khuẩn lạc có kích thước 2 - 3 mm, tròn, trơn, màu trắng
đục hoặc trắng sữa, một số ít khuẩn lạc có màu trắng trong hoặc màu kem.
- Một số ít khuẩn lạc có kích thước khá lớn 3,5 - 4 mm, dạng tròn, màu
trắng đục hoặc trắng trong, một số ít bờ không đều, khô.
Các chủng vi khuẩn được cấy chuyền qua ống thạch nghiêng và bảo quản
lạnh ở 4 - 6oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Từ các mẫu nghên cứu, qua quá trình phân lập, chúng tôi đã xác định
được số lượng vi khuẩn lactic theo phương pháp ở mục 1.3. Kết quả được trình
bày ở bảng 3.1

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

24

Bảng 3.1. Số lượng vi khuẩn lactic trong các mẫu sản phẩm lên men phân lập.
STT

Nguồn phân lập

Địa điểm thu mẫu

1
2

Nước dưa cải
Nem chua

3

Tôm chua

Chợ Tây Lộc
Chợ An Cựu
Cửa hàng Bà Mai,

4

Củ cải muối chua

5

Tré

6
7

Nước ớt chua
Nước dưa cải

8

Sữa chua
Vinamilk

5/3 Cao Bá Quát
Tự làm
Cửa hàng Đông Ba,

Thời gian

Số lượng tế bào (CFU/g

thu mẫu
20/2/2013
22/2/2013

hoặc CFU/ml) (x106)
29,17
27,08

27/2/2013

9,16

27/2/2013

38,50

25 Đào Duy Anh
Tự làm
Tự làm
Cửu hàng giới thiệu và

4/3/2013

14,46

4/3/2013
14/3/2013

9,92.
31,25

bán sản phẩm Vinamilk,

14/3/2013

20,05

168 Nguyễn Trãi

CFU: Colonie Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)
Từ kết quả ở bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy, trong 8 mẫu sản phẩm lên men
phân lập, số lượng vi khuẩn có sự chênh lệch và khác biệt nhau rõ rệt, dao động
trong khoảng 9,16.106 - 38,5.106.
Nhìn chung, số lượng vi khuẩn trong các mẫu là khá lớn. Trong đó, số
lượng vi khuẩn phân lập từ nước củ cải muối chua là lớn nhất 38,50.10 6 CFU/ml.
Tiếp theo là mẫu nước dưa cải với số lượng vi khuẩn cũng rất lớn, 31,25.10 6
CFU/ml ở mẫu nước dưa cải tự làm và 29,17.10 6 CFU/ml ở mẫu nước dưa cải
mua ở chợ. Vì lên men lactic là quá trình chuyển hoá đường thành acid lactic nên
hàm lượng đường có trong nguyên liệu đóng vai trò quan trọng. Trong củ cải
trắng hàm lượng đường là khá cao 5,3% gồm các loại đường dễ hấp thụ (glucose,
fructose) nên đây là điều kiện thuận lợi để vi khuẩn lactic phát triển. Hàm lượng
đường trong cải bẹ xanh cũng khá lớn khoảng 3% do đó mà số lượng vi khuẩn
trong mẫu nước dưa tương đối cao. Tuy nhiên trong 2 mẫu nước dưa cải thì mẫu
nước dưa tự làm lại có số lượng vi khuẩn lớn hơn so với mẫu nước dưa mua ở
chợ. Điều này có thể do trong mẫu nước dưa ở chợ, để kéo dài thời gian bảo quản
và làm cho sản phẩm có màu đẹp người ta đã bổ sung một số chất bảo quản và
chất tạo màu nên đã làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic. Trong các mẫu
lên men từ thực vật thì mẫu nước ớt chua có số lượng vi khuẩn thấp nhất 9,92.10 6

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33


Khóa luận tốt nghiệp

25

CFU/ml, nguyên nhân có thể do trong ớt lượng đường rất ít và do ớt có chất
capcaisin gây cay nên không thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển.
So với các mẫu lên men từ thực vật thì các mẫu lên men từ động vật có số

lượng vi khuẩn thấp hơn. Trong nem, tré, tôm chua thì acid lactic tạo ra là do quá
trình lên men đường (cho vào khi chế biến) nhờ các vi khuẩn có trong nguyên
liệu. Số lượng vi khuẩn có trong nem chua là 27,08.10 6 CFU/g lớn hơn nhiều so
với tré là 14,46.106 CFU/g. Điều này có thể do quá trình chế biến của 2 sản phẩm
này khác nhau, nem được làm từ thịt nạc tươi để lên men còn tré thì nguyên liệu
là thịt đầu heo đã qua sơ chế cùng với nhiều thành phần khác (tỏi, mè, riềng, …)
nên số lượng vi khuẩn tồn tại trong tré cũng ít hơn nem.
Sữa bò là nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng nên thuận lợi cho sự phát
triển của vi khuẩn lactic do đó số lượng vi khuẩn có trong mẫu sữa chua
Vinamilk cũng ở mức cao 20,05.106 CFU/ml.
Như vậy, số lượng vi khuẩn lactic từ các mẫu lên men khác nhau phụ
thuộc nhiều yếu tố, trong đó nguyên liệu ban đầu, kỷ thuật chế biến đóng vai trò
quan trọng.
2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid lactic mạnh
Để đánh giá khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic đã
phân lập, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn theo phương pháp cấy
vạch trên môi trường thạch đĩa MRS có bổ sung CaCO 3 (5 g/l). Những chủng vi
khuẩn có khả năng sản sinh axit lactic sẽ tạo thành vòng trong suốt xung quanh
khuẩn lạc. Khả năng sinh axit được xác định bằng hiệu số giữa vạch phân giải
(D) và độ lớn của vạch cấy (d). Kết quả được trình bày ở bảng 3.2
Từ bảng kết quả 3.2 cho thấy, tỉ lệ số lượng các chủng vi khuản có khả
năng sinh acid ở cảc mức độ khác nhau chênh lệch nhau khá lớn. Trong đó chủng
có khả năng sinh acid ở mức trung bình chiếm tỉ lệ lớn nhất 56 %, chủng có khả
năng sinh acid mạnh có tỉ lệ thấp nhất chỉ 8 %, các chủng sinh acid yếu chiếm
36% và không có chủng sinh acid rất mạnh.
Bảng 3.2. Khả năng sinh acid của các chủng vi khuẩn phân

Hồ Ngọc Bảo Vy - Sinh học K33

lập