Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (trevesia palmata (roxb ex lindl ) vis , họ nhân sâm araliaceae) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA
CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG
(Trevesia palmata (Roxb. e x Lindl.) Vis.,
họ Nhân sâm Araliace ae)

Chuyên ngành : Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc
Mã số : 9720202

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI- NĂM 2020


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
HỌC VIỆN QUÂN Y

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Võ Xuân Minh
2. PGS.TS. Đỗ Quyên

Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến

Phản biện 2: PGS.TS. Trần Việt Hùng

Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Văn Minh

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án
cấp trường họp tại Học viện Quân y
vào hồi:

giờ 00 ngày

tháng

năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư viện Quốc Gia
2. Thư viện Học viện Quân y


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ
NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1

Lê Thị Thanh Thảo, Đỗ Quyên, Nguyễn Thị Ngọc, Lê
Thanh Sơn, Bùi Hữu Tài, Phan Văn Kiệm (2016), “Phân lập
một số hợp chất saponin từ cây Đu đủ rừng (Trevesia
palmata)”, Tạp chí Y-Dược học Quân sự số chuyên đề Dược,
tr. 23-31.

2

Le Thi Thanh Thao, Do Quyen, Duong Binh Vu and Phan
Van Kiem (2018), “New acetylated saponins from the leaves
of Trevesia palmata”, Natural Product Communications,
Vol. 12, N001-2, p.407-410.

3

Le Thi Thanh Thao, Nguyen Trong Diep, Nguyen Hong
Van, Nguyen Nu Huyen My, Vo Xuan Minh (2019), “Study
on the extraction of total saponin from folium Trevesiae
palmatae using Ultrasonic method” Tạp chí Y-Dược học
Quân sự, số 9 tháng 12/2019, p.175-180.

4

Lê Thị Thanh Thảo, Đỗ Quyên, Nguyễn Hồng Vân, Võ
Xuân Minh (2020), “Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố,
thông số của qui trình phun sấy đến chất lượng của cao khô
lá đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ
Nhân sâm Araliaceae)” Tạp chí Y học Việt Nam, số tháng
5/2020, p. 73-78.


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT
1.
2.
3.
4.
5.

6.

Viết tắt
A
Aer
AO
BC
C
13
C-NMR

7.
8.

CI
CR/DP

9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.

cs.
Cyc
DĐVN
DM/DL
ĐĐR

EtOH
HMBC

16.

HPLC

17.
18.
19.
20.

HS chiết
HSPL
HSPS
HR-ESIMS

21.

IL

Phần viết đầy đủ
Độ hấp thụ quang
Aerosil
Acid oleanolic
Bạch cầu
Nồng độ
Carbon-13
nuclear
magnetic

resonance
spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ carbon 13)
Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr)
là tỷ lệ % (khối lượng/khối lượng) của chất rắn trên
tổng khối lượng dịch phun sấy
Cộng sự
Cyclophosphamid
Dược điển Việt Nam
Dung môi/dược liệu (ml/g)
Đu đủ rừng
Ethanol
Heteronuclear
multiple
bond
correlation
spectroscopy (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều
liên kết)
High performance liquid chromatography (Sắc ký
lỏng hiệu năng cao)
Hiệu suất chiết
Hệ số pha loãng
Hiệu suất phun sấy
High resolution - electrospray ionization - mass
spectroscopy (Phổ khối phân giải cao ion hóa phun
mù điện tử)
Interleukin


22.
23.

24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.

INF
KLCT
KTTP
KLRbk
LD50
LOD
LOQ
M
Mal
MeOH
m/z
OA
RSD

35.
36.
37.
38.

39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.

SPN
SD
SE
STT
TCCS
TCMD
TD/CR
TLC
KLLTĐ
KLTƯTĐ
TB
TNF
UV – VIS

Interferon
Khối lượng cơ thể
Kích thước tiểu phân
Khối lượng riêng biểu kiến
Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số con vật thử)
Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)
Khối lượng
Maltodextrin
Methanol
Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/điện tích)
Ovalbumin + Al(OH)3
Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương
đối)
Hàm lượng Saponin toàn phần
Standard deviation (Độ lệch chuẩn)
Standard error (Sai số chuẩn)
Số thứ tự
Tiêu chuẩn cơ sở
Tăng cường miễn dịch
Tá dược/Chất rắn
Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
Khối lượng lách tương đối
Khối lượng tuyến ức tương đối
Trung bình
Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u)
Ultraviolet-visible (Tử ngoại - khả kiến)


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh suy giảm miễn dịch là một nhóm các tình trạng khác
nhau gây nên do một hay nhiều khiếm khuyết của hệ miễn dịch và
biểu hiện trên lâm sàng bởi gia tăng tình trạng dễ mắc các bệnh
nhiễm trùng. Ngày nay, các bệnh suy giảm miễn dịch có xu hướng

ngày càng gia tăng với hậu quả cấp tính, tái diễn hay mạn tính
thường là nặng nề.
Hiện nay, cơ quan quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (US
FDA) đã cấp phép cho nhiều thuốc có tác dụng điều trị cho bệnh
nhân suy giảm miễn dịch được dùng trên lâm sàng. Các thuốc tăng
cường miễn dịch (TCMD) có nguồn gốc phong phú, các chất có
nguồn gốc từ các chế phẩm sinh học (Immunoglobulin, Interferon,
…) là sản phẩm công nghệ hiện đại, giá thành còn khá cao. Các
thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược thường có nhiều tác dụng
không mong muốn.
Có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng TCMD của các loài thực
vật đã được công bố. Đặc biệt, trong số các nhóm hợp chất thiên
nhiên, nhóm chất saponin là nhóm có tác dụng TCMD nổi bật nhất.
Đu đủ rừng (ĐĐR, Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis. họ
Nhân sâm Araliaceae) là một cây nhỡ, mọc nhiều và dễ mọc ở bìa
rừng hay rừng tái sinh. Với nguyên liệu nghiên cứu là lá, nguồn
nguyên liệu dồi dào, sẵn có ở các khu vực Hà Giang, Ba Vì, Cúc
Phương, Phú Thọ…, nên việc thu hái không làm ảnh hưởng đến môi
trường sinh thái hay đa dạng sinh học.
Cho đến nay, cây ĐĐR ở Việt Nam mới chỉ được sử dụng theo
kinh nghiệm dân gian lấy lõi thân thay cho vị thuốc thông thảo. Trên


2
thế giới cũng chỉ có rất ít nghiên cứu về loài này và chưa có chế
phẩm nào có tác dụng TCMD từ ĐĐR được nghiên cứu.
Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh
giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng
(Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm
Araliace ae)” được nghiên cứu với các mục tiêu sau:

1. Xây dựng được qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng ở
qui mô phòng thí nghiệm.
2. Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng và bước đầu đánh giá
được độ ổn định của cao k hô lá Đu đủ rừng.
3. Đánh giá được tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính
của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm.
*Những đóng góp mới của luận án:
1. Đã xác định được nhóm chất chính có trong lá ĐĐR là
saponin. Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của
6 hợp chất saponin, trong đó có 2 chất mới.
2. Đã xây dựng và thẩm định TCCL lá ĐĐR. Đã khảo sát và
xây dựng được qui trình chiết xuất cao lá ĐĐR qui mô 2 kg
dược liệu/mẻ, qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR bằng
phương pháp phun sấy.
3. Đã xây dựng và thẩm định TCCL sản phẩm cao khô lá ĐĐR.
Sản phẩm ổn định trong các điều kiện nghiên cứu.
4. Đã đánh giá được tác dụng TCMD trên động vật thực
nghiệm, cho thấy sản phẩm bào chế được có khả năng cải
thiện đáp ứng miễn dịch trên động vật thực nghiệm.


3
*Nội dung và cấu trúc mới của luận án:
Luận án bao gồm 147 trang. Đặt vấn đề: 2 trang; chương 1 (tổng
quan): 27 trang; chương 2 (nguyên liệu, thiết bị, đối tượng và
phương pháp nghiên cứu): 23 trang; chương 3 (kết quả nghiên cứu):
66 trang; chương 4 (bàn luận): 26 trang; kết luận và kiến nghị: 3
trang.
* Tài liệu tham khảo: Luận án bao gồm 107 tài liệu, trong đó có 84
tài liệu tiếng Anh.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan của luận án đã cập nhật các vấn đề:
- Về ĐĐR: Đặc điểm thực vật và phân bố, thành phần hóa học,
tác dụng sinh học và dược lý đã được công bố, công dụng-liều dùng
dùng theo dân gian.
- Cao thuốc: khái niệm; phân loại theo DĐVN V và DĐ Châu
Âu. 2 giai đoạn chính trong kỹ thuật điều chế cao thuốc: chiết xuất
và làm khô. Trong đó có trình bày về chiết xuất bằng siêu âm và làm
khô bằng phun sấy là các kỹ thuật sử dụng trong luận án
- Mô hình đánh giá tác dụng TCMD: in vitro và invivo: tổng
quan được các mô hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
Lá cây ĐĐR được thu hái vào tháng 5/2015, nguyên liệu được
rửa sạch, sấy khô (40oC) trong tủ sấy có quạt gió đến độ ẩm dưới
12%,

rồi được làm nhỏ đến kích thước mong muốn và bảo quản

trong túi nilon kín, để nơi thoáng mát, khô ráo. Để xây dựng TCCS
mẫu được thu hái tại 5 tỉnh của Việt Nam. Nghiên cứu chiết xuất,
phân lập, bào chế sử dụng mẫu được thu hái ở Hà Giang.


4
2.1.2. Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng trưởng thành dòng Swiss, không phân
biệt giống, cân nặng 18 - 22 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện
Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp; Chuột cống trắng trưởng

thành, dòng Wistar, không phân biệt giống, cân nặng mỗi con tại
thời điểm bắt đầu thí nghiệm là 160 - 180 g, đạt tiêu chuẩn thí
nghiệm do ban chăn nuôi Học viện Quân Y cung cấp.
2.1.3. Thuốc thử, hóa chất, dung môi
Các thuốc thử, hóa chất, dung môi, trang thiết bị đạt tiêu chuẩn
cho nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất; xây dựng tiêu chuẩn;
bào chế; đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính.
2.1.4. Máy móc, trang thiết bị nghiên cứu
Các thiết bị đặc thù: thiết bị chiết siêu âm (SONY MEDI
SM30- CEP, Hàn Quốc), thiết bị phun sấy PG-5 (Trung Quốc), máy
đo quang phổ UV-VIS, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, máy
phân tích huyết học, máy xét nghiệm sinh hóa... và một số thuốc thử,
hóa chất, thiết bị dụng cụ thông thường khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao
khô lá Đu đủ rừng
2.2.1.1. Phương pháp xác định một số hợp chất chính sử dụng làm
chất đánh dấu
Khảo sát các nhóm thành phần hoá học bằng các phản ứng hóa
học đặc trưng.
Lá cây ĐĐR (5kg) được chiết siêu âm với methanol; chiết
phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần. Phân lập các
hợp chất bằng các phương pháp sắc ký. Phát hiện chất bằng đèn tử


5
ngoại hoặc dùng thuốc thử, kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân
lập bằng các phương pháp kết hợp như: TLC, HPLC và NMR. Xác
định cấu trúc hóa học dựa trên các thông số lý hóa và so sánh với các
số liệu đã công bố.

2.2.1.2. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ
rừng
* Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng SPN bằng UV-Vis
- Nguyên tắc: Saponin toàn phần trong lá ĐĐR được định
lượng bằng đo quang phổ UV-Vis sau khi thực hiện phản ứng tạo
màu Rosenthaler. Hàm lượng SPN được tính theo AO.
- Chuẩn bị: dãy dung dịch chuẩn AO trong MeOH nồng độ từ
100 - 300 µg/ml; dung dịch thử: 5,0 g lá ĐĐR, sau khi loại
chlorophyl, chiết siêu âm 2 lần với MeOH x 2 h ở 50◦C, gom dịch
chiết, thêm dung môi vừa đủ 200 ml, pha loãng 2,5 lần; lọc qua
màng lọc 0,45 µm trước khi làm phản ứng; mẫu trắng: MeOH.
- Tiến hành phản ứng tạo màu Rosenthaler: Hút chính xác 0,2
ml dung dịch thử (hoặc chuẩn hoặc trắng), cho vào ống nghiệm, rồi
thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 5% trong acid acetic băng và 1,2 ml
acid percloric. Đậy kín ống nghiệm rồi ủ cách thủy ở 70oC±1oC
trong khoảng thời gian thích hợp. Ngâm ống nghiệm trong nước đá
rồi chuyển vào bình định mức 5 ml, tráng ống nghiệm bằng ethyl
acetat và bổ sung ethyl acetat vừa đủ đến vạch.
- Xây dựng phương pháp:
+ Khảo sát cực đại hấp thụ: Quét phổ từ 400 tới 800 nm, chọn λmax.
+ Khảo sát thời gian phản ứng tạo màu: Thực hiện phản ứng
tạo màu với dãy dung dịch chuẩn làm việc AO có nồng độ: 92,50;
138,75; 185,0; 231,25; 277,50 µg/ml với thời gian ủ lần lượt là 10, 20,


6
30, 40 và 60 phút; lặp lại 6 lần, lựa chọn được thời gian phản ứng
thích hợp nhất.
- Thẩm định phương pháp: Xác định khoảng tuyến tính, độ lặp
lại và độ đúng theo hướng dẫn của ICH.

*Thẩm định phương pháp định lượng AO bằng HPLC
- Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: cột C18 (4,6 × 250 mm; 5 µm);
tốc độ dòng: 0,8 ml/phút; thể tích tiêm: 10 µl; Detector UV: Bước
sóng 215 nm; Pha động: H2O/MeOH (5/95, v/v).
- Chuẩn bị: dãy dung dịch chuẩn: AO trong MeOH nồng độ từ
10-100 µg/ml; mẫu thử: ĐĐRchiết siêu âm 5,0 g lá với MeOH x 2 lần
x 2 h thu được 250 ml, lọc dịch lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi
tiêm vào hệ thống sắc ký; mẫu trắng: MeOH.
- Thẩm định phương pháp: Tính tương thích hệ thống, tính đặc
hiệu của phương pháp, khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại và độ
đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): theo
hướng dẫn của ICH.
*Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá ĐĐR
Mô tả dược liệu (hình thái thực vật, vi phẫu, soi bột), mất khối
lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng (Cd, Hg, As,
Pb) theo phương pháp của DĐVN V. Định tính acid oleanolic bằng
TLC; Định lượng SPN bằng phương pháp UV-Vis, định lượng AO
bằng HPLC đã được thẩm định.
2.2.1.3. Phương pháp xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng
* Qui trình bào chế dịch chiết
- Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất: chiết siêu âm,
ngấm kiệt, chiết hồi lưu, sắc truyền thống.


7
- Khảo sát các thông số qui trình chiết xuất: KTTP dược liệu,
loại dung môi chiết, tỷ lệ DM/DL và số lần chiết, thời gian chiết.
- Sau khi cô cao, loại tạp; tiến hành kiểm nghiệm và điều
chỉnh cao lỏng đựa trên chỉ tiêu tỷ lệ chất rắn trong cao và hàm
lượng SPN.

* Qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy
- Các yếu tố / thông số khảo sát: Loại tá dược phun sấy (Mal,
Aer, lactose monohydrat, Starch 1500), tỷ lệ TD/CR (10 - 30 %),
nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch (120 - 150ºC, 20 - 40 ml/ phút),
tỷ lệ CR/DP (10 - 20 %)
- Căn cứ để lựa chọn: cảm quan hình thái bột, khối lượng riêng
biểu kiến và chỉ số nén CI, mất khối lượng do làm khô, tính hút ẩm,
hiệu suất thu hồi hoạt chất và hiệu suất phun sấy.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và
đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng
2.2.2.1. Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao k hô lá Đu đủ
rừng
Hình thức: Đánh giá bằng cảm quan; mất khối lượng do làm
khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng (Cd, Hg, As, Pb), giới hạn
nhiễm khuẩn theo phương pháp của DĐVN V. Định tính acid
oleanolic bằng TLC; định lượng SPN bằng phương pháp UV-Vis,
định lượng AO bằng HPLC đã được thẩm định.
2.2.2.2. Sơ bộ đánh giá độ ổn định của cao k hô lá Đu đủ rừng
- Điều kiện bảo quản: Thử nghiệm dài hạn (nhiệt độ 30 ± 2ºC,
độ ẩm 75 ± 5%); lão hóa cấp tốc (Nhiệt độ 40 ± 2ºC, độ ẩm 75 ±
5%). Thời gian lấy mẫu: 0, 3, 6, 9, 12 tháng với thử nghiệm dài hạn
và 0, 3, 6 tháng với lão hóa cấp tốc. Tiêu chuẩn đánh giá: Theo
TCCS.


8
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch và
độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm
2.2.3.1. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao k hô lá Đu
đủ rừng

* Mô hình đánh giá: Sử dụng mô hình gây suy giảm miễn dịch
bằng cyclophosphamid (cyc) trên chuột nhắt:
- Chuột thí nghiệm được chia thành 5 lô, mỗi lô 8 con: Lô 1 Chứng sinh học: chuột uống nước cất; Lô 2 - Mô hình: Chuột được
tiêm Cyc + uống nước cất; Lô 3 - Chứng dương: Chuột được tiêm
Cyc + uống levamisol liều 100 mg/kg; Lô 4: Chuột được tiêm Cyc +
uống cao khô ĐĐR liều 1 (400 mg/kg); Lô 5: Chuột được tiêm Cyc +
uống cao khô ĐĐR liều 2 (800 mg/kg). Sau khi tiêm Cyc liều 200
mg/kg ở các lô 2, 3, 4, 5, vào ngày thứ 2 các lô chuột được uống
nước cất và các thuốc liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8, giết chuột,
lấy máu và các tổ chức lympho để làm xét nghiệm.
* Xét nghiệm chức năng miễn dịch: Các chỉ số chung: khối
lượng lách tương đối (KLLTĐ), khối lượng tuyến ức tương đối
(KLTƯTĐ); Số lượng BC chung, BC lympho và BCTT, làm giải
phẫu vi thể lách và tuyến ức. Các thông số đánh giá miễn dịch dịch
thể và qua trung gian tế bào: đo kết quả phản ứng quá mẫn chậm với
kháng nguyên OA qua bề dày bàn chân chuột, định lượng IgG,
cytokin IL-2 và TNF-α.
2.2.3.2. Phương pháp đánh giá độc tính của cao k hô lá Đu đủ rừng
* Độc tính cấp: tiến hành tên chuột nhắt trắng (10 lô, mỗi lô 10
con), cho uống Cao khô ĐĐR (hòa tan với nước) với các mức liều
tăng dần, xác định tỷ lệ chuột chết trong 72 h, theo dõi cho đến hết


9
thời gian 7 ngày. LD50 được tính bằng phương pháp dùng Excel, sau
đó có kiểm chứng lại bằng phương pháp Litchfield-Wilcoxon.
* Độc tính bán trường diễn: Tiến hành trên chuột cống trắng (3
lô, mỗi lô 10 con: lô chứng - sinh lý: uống nước cất; lô trị 1: uống
cao khô lá ĐĐR liều 240 mg/kg/ngày; lô trị 2: uống cao khô lá ĐĐR
liều 720 mg/kg/ngày). Các chỉ tiêu đánh giá: tình trạng chung của

chuột, các chỉ số huyết học, sinh hóa, quan sát hình ảnh đại thể gan,
lách, thận ngày thứ 90.
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kế t quả nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khô lá
Đu đủ rừng
3.1.1. Kết quả xác định một số hợp chất chính làm chất đánh dấu
Thực hiện khảo sát sơ bộ các nhóm chất hữu cơ cho thấy
saponin là thành phần chính của lá ĐĐR. Chiết xuất, phân lập đã xác
định được 6 hợp chất saponin triterpenoid thuộc dẫn xuất của acid
oleanolic và acid ursolic; trong đó có 4 hợp chất saponin đã biết là
acid

ole anolic,

davisianosid

B

ilekudinosid
và

2

hợp

C,
chất

kalopanaxsaponin
mới được

đặt

H,

và

tên

là

acetyltreve siasaponin A và ace tyltrevesiasaponin B.
3.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng
làm nguyên liệu chiết xuất
3.1.2.1. Kết quả xấy dựng và thẩm định các phương pháp định lượng
chất đánh dấu trong lá Đu đủ rừng
* Phương pháp định lượng SPN trong lá ĐĐR bằng UV-Vis
- Xây dựng phương pháp


10
+ Khảo sát cực đại hấp thụ: Quét bước sóng từ 400 -800 nm,
có cực đại hấp thụ ở 550 nm.
+ Khảo sát thời gian phản ứng tạo màu: kết quả cho thấy
trong các mẫu có hệ số tương quan cao thì ở mẫu có thời gian phản
ứng là 40 phút có độ hấp thụ quang cao nhất. Do vậy, đề tài lựa chọn
thời gian để làm phản ứng màu là 40 phút để khảo sát tiếp.
- Thẩm định phương pháp
+ Xác định khoảng tuyến tính: Kết quả cho thấy, trong khoảng
nồng độ AO khảo sát, độ hấp thụ và lượng AO có sự tương quan

tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan r2 = 0,9986 và phương trình
hồi qui tuyến tính là Y = 0,0742 X – 0,0364.
+ Độ lặp lại và độ đúng: Kết quả cho thấy các giá trị RSD
trong ngày và khác ngày đều nhỏ hơn 2,21%, đáp ứng yêu cầu về độ
lặp lại của phương pháp phân tích. Tỷ lệ % chất chuẩn tìm lại trong
ngày và giữa các ngày thay đổi trong khoảng từ 92,67% - 97,11%,
đáp ứng yêu cầu về độ đúng của phương pháp phân tích.
* Phương pháp định lượng AO bằng HPLC
- Kết quả thẩm định
+ Tính tương thích hệ thống: Kết quả cho thấy: RSD về thời gian
lưu và diện tích pic của acid oleanolic đều nhỏ hơn 2%. Giá trị số đĩa lý
thuyết cao N>20.000 và hệ số bất đối xứng píc khoảng 1,15. Như vậy,
phương pháp phân tích này là tương thích với hệ thống sắc ký.
+ Tính đặc hiệu của phương pháp: sắc đồ của mẫu thử có píc
trùng với thời gian lưu của chuẩn AO; trên sắc đồ mẫu trắng không
xuất hiện píc nào tại thời gian lưu của AO. So sánh phổ của píc chất
AO trên sắc đồ chuẩn và píc có cùng thời gian lưu trong mẫu thử cho


11
thấy 2 phổ này chồng khít với mức tương quan 99%, chứng tỏ
phương pháp có tính đặc hiệu cao.
+ Khoảng nồng độ tuyến tính: Kết quả cho thấy, trong khoảng
nồng độ khảo sát (từ 11,13 đến 111,25 µg/ml) có mối liên quan tuyến
tính giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích. Đường hồi qui y =
11333 x – 9726,9 với r2 =0,9972.
+ Độ lặp lại và độ đúng: Kết quả cho thấy phương pháp có độ
lặp lại cao với các giá trị RSD trong ngày và khác ngày đều nhỏ hơn
3,3%, đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp phân tích. Tỷ lệ %
tìm lại trong ngày và giữa các ngày thay đổi trong khoảng từ 96,30 99,05%, đáp ứng yêu cầu về độ đúng của phương pháp phân tích.

+ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):
kết quả thu được LOD = 0,0122 µg/ml và LOQ = 0,04 µg/ml.
3.1.2.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng
TCCS dược liệu được đề xuất có các chỉ tiêu như sau: Mô tả
dược liệu: hình thái thực vật, vi phẫu, soi bột; mất khối lượng do làm
khô (≤12%); tro toàn phần (10%); giới hạn kim loại nặng theo
phương pháp AAS (As ≤ 1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1
mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg); định tính acid oleanolic: theo phương pháp
TLC; định lượng: hàm lượng SPN ≥ 15 mg/g tính theo AO bằng UV
– Vis, hàm lượng AO ≥ 750 µg/g bằng HPLC.
3.1.3. Kết quả xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng
3.1.3.1. Kết quả xây dựng qui trình bào chế dịch chiết lá Đu đủ rừng
Từ kết quả khảo sát đã lựa chọn được các thông số của qui
trình chiết xuất dịch chiết lá ĐĐR bằng phương pháp chiết siêu âm
như sau:


12
Bảng 3.18. Thông số qui trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ rừng
bằng phương pháp chiết siêu âm
STT
Phương pháp/ thông số
1
Chiết siêu âm
2
Bột khô lá ĐĐR
3
Dung môi chiết
4
Nhiệt độ chiết

5
Số lần chiết
6
Tỷ lệ DM/ DL
7
Thời gian chiết

Thiết bị/ thông số
Thiết bị SM30-CEP
Kích thước 0,5 - 1mm
Ethanol 50º
70ºC
2 lần
15ml/1g/ lần x 2 lần
90 phút/ lần x 2 lần

Tiến hành chiết xuất qui mô 2 kg/mẻ x 3 mẻ chiết khác nhau.
Tiến hành cô cao, loại tạp (lọc qua vải dày, cô thu hồi dung môi
(70ºC, áp suất giảm, cô tới cao 3:1, để lắng 24h, gạn. Cắn được thêm
EtOH gấp 5 lần, lắng, gạn, lọc điều chỉnh về cao 3:1) kết quả thu
được như sau:
Bảng 3.20. Kết quả chiết xuất, cô đặc và loại tạp cao lá Đu
đủ rừng 3:1
Dịch
chiết

Cao
3:1
chưa loại tạp

Cao 3:1 đã
loại tạp

Khối lượng,
5,48 kg
thể tích

170,0 lít

1,83 kg

1,83 kg

SPN (1)

683,98
µg/ml

156,00 ± 4,61
mg/g

205,67 ±
4,45 mg/g

Nội dung

Lá ĐĐR

22390 µg/g

Khối lượng
123,28 g
116,28 g
102,33 g
SPN
Tỷ lệ cắn khô trong cao
35,93%
Hiệu suất chiết, cô cao tính theo SPN
83,44%
Hiệu suất chiết, cô và loại tạp tính theo SPN
Tỷ lệ làm giàu SPN
(1)

94,77 g
25,24%
77,27%
131,84%

: hàm lượng SPN trong 1 g chất rắn trong cao tính theo k hô kiệt.


13
Kết quả cho thấy: Hàm lượng SPN trong cao 3:1 chưa loại tạp
là 156,00 ± 4,61 mg/g. Sau khi loại tạp, cô đặc và điều chỉnh về cao
3:1 cho hàm lượng saponin toàn phần là 205,67 ± 4,45 mg/g. Tỷ lệ
làm giàu SPN là 131,84%.
3.1.3.2. Kết quả bào chế cao k hô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy
Từ kết quả khảo sát, đã lựa chọn được công thức và thông số
của qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR bằng phương pháp phun sấy
như sau:

Bảng 3.29. Công thức và thông số qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ
rừng bằng phun sấy

STT

Tên thông s ố

Thông số

1

Dịch phun sấy

2

Tá dược phun sấy

Aerosil

3

Tỷ lệ tá dược/ chất rắn

30%

4

Nhiệt độ đầu vào

130 ± 2ºC

5

Tốc độ cấp dịch

30 ml / phút

6

Tỷ lệ CR/DP

14%

7

Áp suất khí nén đầu phun

2 Bar

Cao lá ĐĐR (3:1) phối hợp
thêm tá dược


14
Xây dựng được qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR như sau:
Bột lá ĐĐR
Đạt TCCS

EtOH 50º
DM/DL = 15ml/1g

Chiết siêu âm lần 1

700 C, 90 phút

Gạn, lọc
Bã ĐĐR 1

DM/DL = 15ml/1g

Chiết siêu âm lần 2

700 C, 90 phút

Gạn, lọc

Bã ĐĐR 2

EtOH thu hồi

Dịch chiết ĐĐR 1

Dịch chiết ĐĐR 2

Dịch chiết ĐĐR 1+2
Cô thu hồi dung môi
Cao ĐĐR 3:1
Để lắng, gạn
EtOH 96º

Phần cắn 1

Phần dịch lỏng 1

Để lắng, gạn
Phần cắn 2

Phần dịch lỏng 2
Cô thu hồi dung môi
Cao ĐĐR 3:1

Kiểm nghiệm:
- Hàm lượng SPN: 165 245 mg/g
- Tỷ lệ chất rắn: 20 - 30%

Hình 3.12. Sơ đồ các giai đoạn điều chế cao lá đu đủ rừng 3:1


15
Cao ĐĐR 3:1
- Thêm Aer, nước: tỷ lệ Aer 30% so với
chất rắn, tỷ lệ CR/ DP: 14%;
- Khuấy đều đồng nhất
Dịch phun sấy
Cấp dịch phun (30ml/phút)
Phun sấy
Nhiệt độ đầu vào 130 ± 20 C
Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar.
Cao k hô lá ĐĐR

Đóng gói

Kiểm nghiệm theo
TCCS

Hình 3.13. Sơ đồ tóm tắt giai đoạn bào chế cao khô lá đu đủ rừng
bằng phương pháp phun sấy
3.2. Kế t quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và đánh
giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng
3.2.1. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao khô lá Đu
đủ rừng
Tiến hành trên 3 lô cao khô (mỗi lô 2 mẻ chiết, mỗi mẻ 2 kg
dược liệu); kết quả đề xuất TCCS của cao khô lá ĐĐR gồm các chỉ


16
tiêu sau: tính chất (khối bột khô tơi, màu vàng nâu nhạt, đồng nhất,
vị đắng, mùi đặc trưng); mất khối lượng do làm khô (≤5%); tro toàn
phần (15%); giới hạn kim loại nặng theo phương pháp AAS (As ≤
1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1 mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg); độ
nhiễm khuẩn (đạt mức 4, phương pháp đĩa thạch DĐVN V); định
tính acid oleanolic: theo phương pháp TLC; định lượng: hàm lượng
SPN ≥ 100 mg/g và ≤ 200 mg/g tính theo AO bằng UV – Vis; hàm
lượng AO ≥ 7,5 mg/g và ≤ 12,5 mg/g bằng HPLC tính theo chế phẩm
khô kiệt.
3.2.2. Kết quả đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng
Kết quả cho thấy, tất cả các tiêu chí đánh giá sau 6 tháng ở
điều kiện lão hóa cấp tốc và 12 tháng ở điều kiện dài hạn ít có sự
thay đổi, đều đạt TCCS của chế phẩm.
3.3. Kế t quả đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính

của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm
3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao
khô lá Đu đủ rừng
- Trên các chỉ số miễn dịch chung: Cao khô lá ĐĐR cả hai liều
400 và 800 mg/kg đều không có tác dụng gây tăng khối lượng các cơ
quan lympho, đều gây tăng tế bào BC lympho. ĐĐR liều 1 làm tăng
số lượng bạch cầu ngoại vi, tăng số lượng tế bào BCTT. Trong khi
liều 2 lại làm giảm số lượng bạch cầu chung, làm giảm BCTT.
- Trên các chỉ số miễn dịch dịch thể: Cao khô lá ĐĐR hai liều
đều có tác dụng làm tăng nồng độ IgG trong máu ngoại vi.
- Trên các chỉ số miễn dịch qua trung gian tế bào: Cao khô lá
ĐĐR cả hai liều đều có tác dụng tăng khả năng chế tiết các cytokin


17
IL-2, liều 1 có tác dụng giảm tiết TNF-α, tuy nhiên ở liều 2 lại gây
tăng tiết TNF-α.
3.3.2. Đánh giá độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng
3.3.2.1. Độc tính cấp
Kết quả cho thấy giữa tỷ lệ % chuột chết và mức liều dùng cao
khô lá ĐĐR theo hàm số mũ có tương quan chặt chẽ với hệ số tương
quan r² = 0,9707 theo phương trình y = 4,738e0,016x . Từ đó tính được
LD50 = 10,54 (8,79 – 12,65) g cao khô lá ĐĐR/kg, lớn gấp 26,35 lần
so với liều dự kiến có tác dụng.
3.3.2.2. Độc tính bán trường diễn
Trên các lô chuột dùng cao khô lá ĐĐR liều 240 mg/kg/ngày
và liều 720mg/kg/ngày, theo dõi trong 90 ngày liên tục, cho thấy:
chuột khỏe mạnh, tăng trọng tốt, đều; không làm thay đổi các chỉ số
huyết học; không làm thay đổi các chỉ tiêu sinh hóa đánh giá chức
năng gan, thận; không gây tổn thương mô bệnh học gan, lách, thận.

Chương 4: BÀN LUẬN
4.1. Về xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng
4.1.1. Về xác định nhóm chất đánh dấu
Xác định được nhóm chất chính trong lá ĐĐR là saponin.
Luận án đã phân lập được 6 hợp chất saponin triterpenoid; trong đó
có 4 hợp chất saponin đã biết và 2 hợp chất mới; góp phần bổ sung
cơ sở dữ liệu về hóa học cho loài này. SPN là nhóm chất có nhiều tác
dụng liên quan đến miễn dịch đã được nghiên cứu. Trong số các hợp
chất đã biết, thì kalopanaxsaponin H đã được nghiên cứu về một số
hoạt tính như kháng khối u và gây độc tế bào ung thư. Acid oleanolic
đã được chứng minh rất nhiều về các tác dụng dược lý có liên quan
đến miễn dịch như chống ung thư, tiểu đường, chống viêm, bảo vệ


18
gan, chống oxy hóa, kháng khuẩn, ... Vì vậy luận án đã sử dụng SPN
toàn phần và AO làm chất đánh dấu.
4.1.2. Về lựa chọn 2 phương pháp định lượng
Luận án sử dụng hai phương pháp định lượng: SPN được định
lượng bằng phương pháp quang phổ UV-Vis, còn AO được định
lượng bằng phương pháp HPLC. Việc này là cần thiết vì sẽ góp phần
làm tăng sự chặt chẽ và chính xác trong đánh giá chất lượng sản
phẩm. Xây dựng và thẩm định của cả 2 phuong pháp định lượng
được thực hiện theo đúng hướng dẫn của ICH, kết quả cho thấy qui
trình định lượng đảm bảo được yêu cầu của phương pháp phân tích.
4.1.3. Về tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng
Hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới chưa có nhiều công bố
nghiên cứu về ĐĐR, chưa có chuyên luận về ĐĐR trong các Dược
Điển. Trong nghiên cứu này, từ mẫu thu hái tại 5 tỉnh, chúng tôi đã
đề xuất TCCS để đánh giá chất lượng nguyên liệu lá ĐĐR.

4.1.4. Về qui trình bào chế cao lá Đu đủ rừng
Chiết siêu âm đã và đang được ứng dụng ngày càng nhiều ở
qui mô phòng thí nghiệm đến công nghiệp. Kết quả so sánh giữa các
phương pháp chiết xuất cho thấy phương pháp chiết siêu âm đã làm
tăng rõ rệt hiệu suất chiết nhưng ở nhiệt độ thấp hơn và thời gian
ngắn hơn. Trong nghiên cứu này, đã sử dụng chiết siêu âm để khảo
sát với các thông số khảo sát là: KTTP dược liệu, loại dung môi
chiết, tỷ lệ DM/DL, nhiệt độ và thời gian chiết. Trong khuôn khổ
luận án, thiết bị chiết siêu âm đã cố định về tần số sóng siêu âm là 60
kHz, nên sự ảnh hưởng của tần số sóng siêu âm (là một yếu tố có ảnh
hưởng lớn đến hiệu suất chiết) thì chưa được khảo sát.


19
4.1.5. Về thiết bị chiết xuất, cô đặc và kết quả bào chế cao 3:1
Sau khi lựa chọn được thông số qui trình bào chế dịch chiết.
Tiến hành chiết xuất 3 mẻ liên tục, mỗi mẻ 2kg trên thiết bị chiết
xuất SM30 dung tích 30 lít, tần số siêu âm 60kHz, 8 đầu phát siêu
âm, lực siêu âm 400W. Các thiết bị siêu âm thường đặc trưng bởi tần
số siêu âm (thường trong khoảng 20 - 100kHz) và công suất siêu âm,
nhưng cấu trúc của thiết bị cũng ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất.
Trong nghiên cứu này sử dụng thiết bị siêu âm với các đầu siêu âm
được gắn cố định với tần số siêu âm 60kHz nên không khảo sát được
ảnh hưởng của tần số siêu âm. Do đó, khi nâng cấp qui mô với thiết
bị có tần số siêu âm khác cần tính toán và đánh giá lại các thông số
qui trình để đạt được mục đích chiết xuất mong muốn.
4.1.6. Bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy
Trong luận án này, phương pháp phun sấy được lựa chọn để
bào chế cao khô lá ĐĐR vì đây là kỹ thuật làm khô có nhiều ưu
điểm, hiện đang được áp dụng rộng rãi cả ở qui mô công nghiệp

trong nước. Để xây dựng qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR bằng
phương pháp phun sấy, cần phải khảo sát các thông số của thiết bị
(nhiệt độ khí đầu vào, tốc độ cấp dịch) và thông số thuộc về dịch
phun (tỷ lệ chất rắn, loại và tỷ lệ tá dược). Các thông số của sản
phẩm cần đánh giá là: Mất khối lượng do làm khô, tính hút ẩm, khối
lượng riêng biểu kiến, khả năng trơn chảy, hiệu suất phun sấy, hàm
lượng và hiệu suất thu hồi hoạt chất.
- Các tá dược lựa chọn khảo sát là Mal, Aer, hỗn hợp Mal,
Aer, Starch 1500, lactose. Aer được lựa chọn vì nó có tác dụng bảo
vệ hoạt chất, điều hòa độ trơn chảy, cải thiện độ hút ẩm…


20
- Kết quả khảo sát cho thấy khi tăng tỷ lệ Aer đã cải thiện
được cả về hiệu suất phun sấy và các chỉ số lý hóa khác của sản
phẩm, hiệu suất thu hồi hoạt chất cũng tăng nhẹ, chứng tỏ Aer thể
hiện khả năng bảo vệ hoạt chất nhất định, nhưng hàm lượng saponin
toàn phần là có xu hướng giảm dần, điều này là do hiện tượng pha
loãng nồng độ. Trong đề tài này, lựa chọn tỷ lệ tá dược là 30% là phù
hợp.
- Kết quả khảo sát cho thấy, các công thức phun sấy ở nhiệt độ
và tốc độ cấp dịch khác nhau có ảnh hưởng nhất định đến hiệu suất
và các tính chất hóa lý của sản phẩm. Nhiệt độ sấy cao quá cũng có
thể ảnh hưởng đến độ ổn định của hoạt chất, kết quả khảo sát của đề
tài cho thấy hàm lượng và hiệu suất thu hồi hoạt chất có xu hướng
giảm khi nhiệt độ tăng đến 150°C.
- Dịch chiết lá ĐĐR thu được sau chiết xuất được cô về cao
3:1 có tỷ lệ chất rắn khoảng 25%, nhưng khi phun sấy được chỉnh về
tỷ lệ chất rắn từ 10 - 16%. Vì khi tỷ lệ chất rắn cao quá sẽ làm tăng
độ nhớt của dịch phun nên khi phun sấy sẽ khó hình thành các giọt,

làm giảm hiệu suất phun sấy. Kết quả cho thấy, khi tăng tỷ lệ CR/DP
hầu như không ảnh hưởng đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi SPN,
nhưng lại có xu hướng cải thiện về độ ẩm, tính hút ẩm, khả năng trơn
chảy. Trong đó, tỷ lệ chất rắn 14 - 16% là thích hợp nhất.
4.2. Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và độ ổn định của cao
khô lá Đu đủ rừng
4.2.1. Về xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
Sau khi nghiên cứu bào chế được cao khô lá ĐĐR luận án đã
xây dựng được TCCS để chuẩn hóa chất lượng sản phẩm. Chỉ tiêu
giới hạn dưới khi định lượng chúng tôi lấy tương ứng khoảng 70%
giá trị định lượng được thực tế khi khảo sát) ….