Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở việt nam dựa trên chỉ thị ITS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DUỢC

----

----

BÙI THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN
DÂY THUỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH)
Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DUỢC HỌC

Hà Nội – 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DUỢC

---
---Nguời thực hiện: Bùi Thị Yến

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN
DÂY THUỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH)
Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(NGÀNH DUỢC HỌC)
Khóa
Nguời huớng dẫn
: QH2015.Y

: PGS. TS. Đinh Đoàn Long
ThS. Phạm Thị Hồng Nhung
Hà Nội – 2020


LỜI CẢM ON
Để hoàn thành khóa luận này, tôi dã may mắn nhận duợc rất nhiều sự giúp dỡ quý
báu cả về vật chất, tinh thần của thầy cô, bạn bè. Lời dầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính
trọng và lòng biết on sâu sắc tới PGS. TS. Đinh Đoàn Long, ThS. Phạm Thị Hồng
Nhung – Giảng viên Khoa Y Duợc – Đại học Quốc gia Hà Nội, những nguời dã
trực tiếp huớng dẫn tôi, chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình thực hiện nghiên
cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm on cô Đỗ Thị Lệ Hằng, bạn Đỗ Hạnh Nguyên dã giúp
dỡ, hỗ trợ tôi trong thực hành thí nghiệm. Các thầy cô, các bạn không chỉ trang
bị cho tôi kinh nghiệm và kỹ nang chuyên môn mà còn truyền cho tôi tình yêu, lòng
nhiệt huyết với nghiên cứu và luôn sẵn sàng giúp dỡ mỗi khi tôi gặp khó khan.
Tôi xin chân thành cảm on các thầy cô giáo Bộ môn Y Duợc học co sở dã
hết lòng quan tâm, giúp dỡ và tạo diều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Tôi cung xin cảm on những cán bộ tại Viện duợc liệu - Bộ Y tế dã không quản
ngại khó khan thu thập và cung cấp mẫu vật giúp dỡ tôi thực hiện dề tài một cách
thuận lợi nhất.
Tôi xin gửi lời cảm on tới Ban chủ nhiệm Khoa, cùng toàn thể các thầy cô giáo
Khoa Y Duợc - Đại học Quốc gia Hà Nội dã cho tôi những kiến thức quý báu
trong quá trình học tập tại nhà truờng.
Chúng tôi trân trọng cảm on sự tài trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Công nghệ
Việt Nam cho dề tài mã số NVQG-2018/02 do PGS.TS Đinh Đoàn Long chủ trì
dể thực hiện nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin duợc bày tỏ lòng biết on và sự yêu thuong dến gia dình, nguời

thân và bạn bè, những nguời dã luôn ở bên cổ vu, dộng viên và tạo mọi diều kiện
giúp dỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện dề tài khóa luận này.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 nam 2020 Tác giả
Bùi Thị Yến


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
bp
Cặp bazo (base pair)
DNA
Deoxyribo Nucleic Acid
dNTP
Deoxyribonucleotide 5’ Triphosphate
Genbank
Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế
H.helix
Hedera helix L (Thuờng xuân)
H.nepalensis
Hedera nepalensis K.Koch (Dây thuờng xuân)
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu nang cao (High Performance Liquid Chromatography)
ITS
Vùng dệm trong duợc sao mã (Internal transcribed spacer)
Kit Thermo
GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ)
ML
Maximum Likelihood
NCBI
Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for
Biotechnology Information)

NJ
Neighbor - Joining
OD
Mật dộ quang học (Optical Density)
PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)
RNA
Ribo Nucleic Acid
UPGMA
Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thông tin các mẫu thực vật duợc nghiên cứu
..........................................
19
Bảng 3.1. Nồng dộ và OD260/280 DNA tổng số của của các mẫu nghiên cứu
..........
...................................................................................................................................
27
Bảng 3.3. Các haplotype trong nghiên cứu
...............................................................
24 Bảng 3.2.Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân dòng doạn gen ITS

30 Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền (phía duới bên trái) và số luợng nucleotide sai
khác (phía trên bên phải) giữa 11 nhóm mẫu nghiên cứu và H.nepalen sis
(AJ131238.1), H.helix (AM503887.2), H. sinensis (GU054623.1) và Kalopanax
septemlobus (MH711151.1)

......................................................................................

31
Bảng 3.5. Vị trí các nucleotide sai khác khi so sánh các trình tự trên BioEdit
........
32
Bảng 3.6. Các trình tự tham chiếu trên Genbank
.....................................................
35


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. So dồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật.
..........................
9
Hình 1.2. Dạng cây phát sinh loài biết rõ nguồn gốc
...............................................
11
Hình 1.3. Cây Dây thuờng xuân H. nepalensis .
......................................................
13
Hình 1.4. Phân bố dịa lý của H. nepalensis tại miền Bắc nuớc ta
...........................
14
Hình 2.1. So dồ thiết kế nghiên cứu
.........................................................................
21
Hình 2.2. Hiển thị kết quả giải trình tự qua phần mềm BioEdit
..............................
23
Hình 3.1. Ảnh diện di DNA tổng số của một số mẫu trên gel agarose 1,2 %.
.........

24
Hình 3.2. Tối uu nhiệt dộ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen ITS
............................
26
Hình 3.3. Tối uu nồng dộ DNA phản ứng nhân dòng gen ITS
................................
26
Hình 3.4. Tối uu nồng dộ mồi phản ứng nhân dòng gen ITS
...................................
27
Hình 3.5. Kết quả PCR nhân dòng gen ITS của một số mẫu
...................................
28
Hình 3.6. Kết quả hiển thị giải trình tự của mẫu H1 qua phần mềm BioEdit
..........
28
Hình 3.7. Kết quả so sánh BLAST của mẫu H4 và H. nepalensis (AJ131238).
......
.....................................................................................................
................................................................................................................
...........................................................................................................
..................................................................................................
46
29 Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phuong pháp UPGMA dựa trên
chỉ thị phân tử ITS

35 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phuong pháp NJ dựa trên chỉ thị
phân tử ITS

36 Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phuong pháp ML dựa trên chỉ

thị phân tử ITS

36 Hình 4.1. Phân bố dịa lý các haplotype của Dây thuờng xuân ở các tỉnh Lào Cai,
Hà Giang, Lạng Son


i
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
............................................................................................................
1
CHUONG 1. TỔNG QUAN
.....................................................................................
3
1.1. Đa dạng và phân loại sinh học
.........................................................................
3
1.1.1. Khái niệm da dạng sinh học
.....................................................................
3
1.1.2. Đa dạng di truyền
.....................................................................................
3
1.1.3. Thực trạng da dạng sinh học ở Việt Nam
.................................................
3
1.1.4. Các phuong pháp phân loại học
...............................................................
4
1.2. Công cụ phân tích da dạng di truyền và tiến hóa

.............................................
6
1.2.1. Tổng quan về chỉ thị DNA
.......................................................................
6
1.2.2. Các kỹ thuật chỉ chị DNA
........................................................................
7
1.2.3. Vùng dệm trong duợc sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS)
........
8
1.2.4. Các phuong pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
............................
10
1.3. Tổng quan về Dây thuờng xuân (Hedera nepalensis K. Koch)
....................
13
1.3.1. Phân loại học loài Hedera nepalensis K. Koch
......................................
13
1.3.2. Đặc diểm hình thái và phân bố dịa lý
.....................................................
14


1.3.3. Giá trị y học
............................................................................................
14
CHUONG 2. VẬT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN CỨU
.......................

19
2.1. Vật liệu nghiên cứu
........................................................................................
19
2.1.1. Vật liệu thực vật
.....................................................................................
19
2.1.2. Hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu
..............................................
20
2.1.3. Thiết bị
....................................................................................................
20
2.2. Phuong pháp nghiên cứu
...............................................................................
21
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
.........................................................................
21
2.2.2. Nhân dòng doạn gen dích bằng kỹ thuật PCR
........................................
22
2.2.3. Giải trình tự
............................................................................................
22
2.3.4. Xử lý số liệu và phân tích kết quả
..........................................................
23
CHUONG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
..............................................................

24


ii
3.1. Tách chiết DNA tổng số
................................................................................
24
3.2. Kết quả nhân dòng doạn gen ITS bằng phản ứng PCR
..................................
25
3.2.1. Kết quả các phản ứng tối uu
...................................................................
25
3.2.2. Kết quả nhân dòng gen ITS từ các mẫu thực vật
...................................
28
3.3. Giải trình tự
....................................................................................................
28
3.4. Độ tuong dồng của trình tự gen ITS duợc khuếch dại
...................................
29
3.5. Cây phát sinh chủng loại dựa trên vùng gen ITS
...........................................
30
3.5.1. Lựa chọn mô hình
...................................................................................
30
3.5.2. Khoảng cách di truyền
............................................................................

30
3.5.3. Xây dựng cây chủng loại
........................................................................
35
CHUONG 4. BÀN LUẬN
.......................................................................................
37
4.1. Tách chiết DNA tổng số
................................................................................
37
4.2. Tối uu quy trình nhân dòng gen ITS bằng phản ứng PCR và giải trình tự
....
38
4.3. Khoảng cách di truyền
...................................................................................
40
4.5. So sánh giữa các phuong pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
..............
41
4.5.1. Phuong pháp UPGMA


...........................................................................
41
4.5.2. Phuong pháp Neighbor- Joining
.............................................................
42
4.5.3. Phuong pháp Maximum LikeLihood
.....................................................
42

4.6. Dự doán trong bảo tồn và chọn tạo giống
......................................................
43
4.7. So sánh với phân tích hình thái học
...............................................................
44
4.8. Phân tích dịa lý của các mẫu nghiên cứu
.......................................................
45
CHUONG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
.........................................................
47


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trên thế giới cung nhu ở nuớc ta xu huớng sử dụng duợc liệu và các sản phẩm
cham sóc sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật ngày một tang cao. Theo số liệu
của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số ở các nuớc dang phát triển
có nhu cầu cham sóc sức khỏe ban dầu liên quan dến y học cổ truyền [23]. Trong
gần 20 nam trở lại dây, uớc tính có khoảng 40 - 50% các thuốc duợc dua ra thị
truờng dều trực tiếp hoặc gián tiếp có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [25].
Tại Mỹ, doanh số bán thực phẩm chức nang có nguồn gốc từ thực vật tang 8,5%,
dạt tổng doanh thu khoảng 8 tỷ USD trong nam 2017 [51]. Cây duợc liệu duợc coi
là kho tàng vô giá cung cấp các hợp chất sinh học phục vụ nghiên cứu phát
triển thuốc, là thành phần không thể thiếu của ngành duợc liệu, góp phần phục vụ cham
sóc sức khỏe cộng dồng, nâng cao dời sống và phát triển kinh tế - xã hội [23] . Đây
là một trong những lý do ngày càng có nhiều loài cây thuốc duợc dầu tu nghiên cứu,
mở rộng quy mô sản xuất dể phát triển thành các sản phẩm chất luợng dáp ứng cho
thị truờng [23].

Họ Nhân Sâm (Araliaceae) là thực vật cung cấp nhiều cây thuốc quý, duợc dân gian
sử dụng lâu dời. Tuy nhiên, các loài trong chi Hedera của họ này còn ít duợc biết
dến ở Việt Nam. Trong chi này, Thuờng xuân (Hedera helix) và Dây thuờng xuân
(Hedera nepalensis) là hai loài duợc nghiên cứu nhiều nhất [19]. Ở châu Âu, Thuờng
xuân dã duợc sử dụng từ rất lâu dời, một trong những sản phẩm
nổi tiếng trên khắp
®
thế giới là siro ho Prospan của Công ty Engelhard Arzneimitel GmbH&Co.KG
(Cộng hòa Liên bang Đức). Ở Việt Nam, Thuờng xuân không phải cây bản dịa nhung
Dây thuờng xuân duợc ghi nhận phân bố ở nhiều vùng núi cao miền Bắc và hai loài
này có hình thái dễ nhầm lẫn. Một số nghiên cứu duợc lý dã ghi nhận Dây thuờng
xuân có nhiều tác dụng nhu chống ung thu, chống oxy hóa, hạ duờng huyết, giảm
dau, kháng viêm…[32, 39, 43, 57]. Mặc dù có tiềm nang duợc lý nhu vậy, song
nghiên cứu về Dây thuờng xuân ở Việt Nam còn hạn chế, dặc biệt là nghiên cứu về
da dạng di truyền.
Khai thác duợc liệu quá mức, không có dịnh huớng và kiểm soát chặt chẽ dã
và dang de dọa trực tiếp dến nguồn tài nguyên cây thuốc ở nuớc ta. Do dó, công tác
bảo tồn da dạng sinh học, các nguồn gen quý dang là mối quan tâm hàng dầu của
các nhà quản lý và Nhà nuớc. Đánh giá duợc mức dộ da dạng di truyền nguồn gen
cây thuốc kết hợp với các phân tích thành phần hóa học của từng giống cây cho
phép chúng ta chọn lọc duợc giống cây sản xuất hiệu quả hợp chất quan tâm. Qua


2
dó, thông tin về nguồn gen giúp chúng ta dua ra duợc chiến luợc bảo tồn và phát
triển cây thuốc tiềm nang một cách hiệu quả và bền vững. Hiện nay, các chỉ thị
DNA dã trở thành một trong những công cụ hỗ trợ dắc lực cho nghiên cứu phân
loại, phân tích da dạng sinh học. Nó giúp xác dịnh khoảng cách di truyền và dặc
trung cấp dộ cá thể, quần thể phục vụ bảo tồn và chọn giống [14, 26, 38]. Vùng dệm
trong duợc sao mã (Internal Transcribed Spacer, viết tắt là ITS) là một chỉ thị phân

loại tốt ở thực vật. Song ITS có phải là một chỉ thị tốt dể dánh giá mức dộ da dạng
di truyền nguồn gen Dây thuờng xuân ở Việt Nam hay không? Để di tìm lời giải
cho câu hỏi này chúng tôi lựa chọn dề tài: “Nghiên cứu da dạng di truyền nguồn
gen Dây thuờng xuân (Hedera nepalensis K. Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị
ITS” với hai mục tiêu:
1. Xây dựng quy trình tối uu nhân dòng vùng gen ITS của cây Dây thuờng
xuân.

2. Định danh khoa học của các mẫu Dây thuờng xuân thu thập tại Việt Nam thông
qua xây dựng cây phát sinh loài dựa trên chỉ thị phân tử ITS.
Để thực hiện mục tiêu nghiên cứu trên, tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu nhu
sau:
1. Tách chiết DNA tổng số của 45 mẫu Dây thuờng xuân.
2. Tối uu quy trình nhân dòng gen ITS với cặp mồi dặc hiệu.
3. Nhân dòng gen ITS bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.
4. Phân tích số liệu thu duợc và xây dựng cây phát sinh chủng loại.


3
CHUONG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đa dạng và phân loại sinh học
1.1.1. Khái niệm da dạng sinh học
Theo Công uớc da dạng sinh học nam 1992: Đa dạng sinh học là sự phong phú của
mọi co thể sống có từ tất cả các nguồn trong các hệ sinh thái mà chúng tạo nên; da
dạng sinh học gồm sự da dạng trong loài (da dạng di truyền), giữa các loài (da dạng
loài) và các hệ sinh thái (da dạng các hệ sinh thái). Đa dạng sinh học có
tầm quan trọng to lớn dối với thiên nhiên và con nguời. Nó mang giá trị sinh thái và
môi truờng, bảo vệ tài nguyên dất và nuớc, diều hòa khí hậu, mang giá trị kinh tế
lớn nếu biết khai thác và sử dụng dúng cách [9].
1.1.2. Đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền hay còn gọi là da dạng nguồn gen là một phần của da dạng sinh học.
Đa dạng di truyền thể hiện sự phong phú của những biến dị trong cấu trúc
di truyền của các cá thể bên trong loài hoặc giữa các loài; bên trong hoặc giữa
những quần thể. Đa dạng di truyền xuất phát từ những dột biến nhỏ nhu thêm, mất,
thay thế hoặc dảo vị trí nucleotide trong chuỗi DNA, hoặc từ các dột biến ở cấp dộ
cao hon nhu các dột biến về số luợng hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể.
Đa dạng di truyền là sự da dạng ở cấp dộ phân tử, là nền tảng cho sự da dạng của
sinh giới [4]. Đây là mức dộ nhỏ nhất dể cấu thành nên các tổ chức lớn hon nhu tế
bào hoặc co quan. Nghiên cứu da dạng di truyền chính là nghiên cứu sự biến dổi
của sinh vật hay quần thể sinh vật ở cấp dộ di truyền (gen, DNA). Ngày nay, nghiên
cứu da dạng sinh học nói chung, da dạng di truyền nói riêng dang ngày càng duợc
phát triển, góp phần giúp dịnh danh chính xác hệ thống sinh vật khổng lồ. Ngoài ra,
dây còn là co sở cho bảo tồn phát triển nguồn gen, lai chọn tạo giống mới, nghiên
cứu tiến hóa…

1.1.3. Thực trạng da dạng sinh học ở Việt Nam
Việt Nam là một dất nuớc có khí hậu nhiệt dới gió mùa, trải dài gần 3260 km theo
chiều dọc, dịa hình ¾ là dồi núi, nên có nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng
phong phú. Theo các tài liệu thống kê, Việt Nam là một trong 25 nuớc có mức dộ
da dạng sinh học cao trên thế giới, trong dó xếp thứ 16 về mức dộ da dạng sinh học
(chiếm 6,5% số loài có trên thế giới). Chỉ kể dến thực vật, Việt Nam có khoảng
20000 loài trên cạn và duới nuớc; gần 4000 loài thực vật có giá trị làm thuốc và có
nhiều loài thuộc duợc liệu quý hiếm.


4
Trên thế giới cung nhu ở Việt Nam, suy thoái da dạng sinh học dang ngày
một nặng nề. Đó là một vấn dề gây nhức nhối toàn cầu. Các chuyên gia cho rằng tốc
dộ tuyệt chủng hiện tại của các loài thực vật dang cao hon 100 dến 1000 lần so với
mức tự nhiên. Cứ sau 2 nam, chúng ta lại mất ít nhất một loại duợc liệu [23]. Trong

khi dó, còn tới 90% số loài chua duợc thống kê, nghiên cứu thì nhiều loài trong số
dó dã bị tuyệt chủng. Nhiều nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp khác nhau dẫn dến
sự suy thoái dó nhu khai thác, sử dụng không bền vững; cháy rừng, chuyển dổi
phuong thức sử dụng dất, ô nhiễm môi truờng, chiến tranh, yếu kém trong công tác
quản lý [4, 9]. Hàng ngày, hàng giờ dều dang có sự gia tang nguy co tuyệt chủng
của một số loài nào dó. Do dó, các nghiên cứu phục vụ bảo tồn và phân tích da dạng
sinh học là vô cùng cần thiết, quan trọng, có ý nghia khoa học và thực tiễn.
Hiện nay, nuớc ta có nguồn duợc liệu lớn, dự báo một nguồn gen phong phú nhung
việc tạo ra giá trị kinh tế từ nguồn duợc liệu này còn rất hạn chế. Các sản phẩm từ
duợc liệu chua duợc chuẩn hóa, dẫn dến khó tạo ra các sản phẩm ổn dịnh, có giá trị
cao. Đặc biệt, phát triển thuốc từ duợc liệu gặp nhiều hạn chế do mối nghi ngại lớn
về tác dụng, sự ổn dịnh về chất luợng, khó phân biệt về hình thái. Vì vậy, nghiên cứu
da dạng di truyền càng trở lên có ý nghia, giúp xác dịnh chính xác danh pháp khoa
học của các loài, từ dó kết hợp với các nghiên cứu duợc lý dể có biện pháp bảo vệ và
phát triển các nguồn gen tạo duợc các sản phẩm chất luợng tốt.

1.1.4. Các phuong pháp phân loại học
Phân loại học có vai trò và ý nghia dối với nhiều ngành, nhiều linh vực [13]. Có
nhiều cách phân chia về các phuong pháp phân loại học, phần duới dây sẽ trình
bày một số phuong pháp phân loại chính duợc sử dụng hiện nay.
1.1.4.1. Phuong pháp phân loại học truyền thống
Trong phân loại học truyền thống có bao hàm phân loại học dựa trên chỉ thị
cảm
quan (hình thái, màu sắc, mùi vị…) và chỉ thị hóa học (sắc ký lớp mỏng - Thin Layer
Chromatography - TLC; sắc ký lỏng cao áp - High-Performance Liquid
Chromatography - HPLC...).
Phuong pháp phân loại bằng dặc diểm hình thái (phuong pháp hình thái học) là một
phuong pháp giữ vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu phân loại học. Nó duợc sử
dụng rất rộng rãi và phổ biến. Phuong pháp cho phép so sánh các dặc diểm hình thái
của các co quan trong co thể sinh vật, truớc hết là co quan sinh duỡng và sinh sản.

Nhờ việc làm nổi bật các dặc diểm giống, khác nhau và nhờ tính ổn dịnh


5
của chúng mà ta có thể sắp xếp các sinh vật vào các nấc thang phân loại khác nhau,
xác dịnh duợc mối quan hệ thân cận. Hạn chế lớn nhất của phuong pháp là phân
biệt các loài dồng hình. Đôi khi do lợi ích kinh tế hoặc lỗi trong khâu thu hái mà
nguời ta có thể nhầm lẫn các sinh vật với nhau một cách vô tình hoặc cố ý; gây hậu
quả nghiêm trọng nhất là với các cây có chất dộc [3, 6, 8]. Tuy vậy, chúng ta không
thể phủ nhận và thay thế duợc vai trò to lớn của các cách phân loại truyền thống dối
với phân loại học nói chung.
1.1.4.2. Phuong pháp phân loại học hiện dại
Phân loại học phân tử
Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và tin sinh học, các kỹ thuật chỉ
thị sinh học phân tử ra dời từ thập kỷ 80 của thế kỷ truớc dem lại những thành tựu
kỳ diệu và buớc tiến quan trọng trong phân loại học [13, 14, 26]. Phân loại học phân
tử xác dịnh các loài dựa trên các dặc diểm khác biệt về trình tự DNA, protein hoặc
isozyme. Phần lớn chỉ thị phân tử duợc sử dụng hiện này là các chỉ thị DNA, các
chỉ thị này nằm gần hay liên kết với gen và không có hoặc ít ảnh huởng dến kiểu
hình. Bằng phuong pháp này, sự khác biệt giữa các co thể hoặc các loài khác nhau
trở nên nhanh và chính xác. Phuong pháp dặc biệt có ích trong truờng hợp giải
quyết các vấn dề về loài dồng hình hay nghiên cứu các biến dị, khắc phục một phần
nhuợc diểm của phuong pháp phân loại truyền thống [13].
Phân loại học hiện trạng số (numerical taxonomy) sử dụng các dấu hiệu
giống nhau của sinh vật (từ 60 trở lên) mà không xét nguồn gốc của các dấu hiệu.
Phuong pháp can cứ vào mức dộ giống nhau của các dối tuợng dể xác dịnh quan hệ
phân loại bằng cách dùng các thuật toán. Uu diểm của phuong pháp này là loại bỏ
duợc tính chủ quan và dảm bảo tính tự nhiên của hệ thống phân loại. Tuy nhiên
nhuợc diểm lớn là dã loại trừ yếu tố tiến hóa và không thể thay thế phuong pháp
phân loại truyền thống [13].

Phân loại học Phylocod xác dịnh các dặc diểm tổ tiên, các dặc diểm phân ly từ tổ
tiên và hình thành các bậc tiến hóa don dòng xác dịnh nhu các loài. Khác với phân
loại truyền thống phân chia thành nhiều thứ bậc (loài, giống, họ, bộ...),
Phylocod chỉ là hệ thống danh pháp. Theo phuong pháp này, số luợng loài sẽ tang
lên hay vấn dề mẫu chuẩn của loài sẽ là những diểm hạn chế. Vì vậy, hệ thống danh
pháp này chỉ mang tính tham khảo [13].


6
Cận phân loại học (Parataxonomy) sử dụng dể so sánh tổng quát về mức dộ phong
phú của sinh vật nói chung của một khu vực. Phuong pháp phân loại này chủ truong
phân thành các don vị phân loại mà không thành các loài theo những nguyên tắc
chung. Nó có thể phù hợp cả những nguời không chuyên về phân loại học bằng cách
phân loại bằng mắt thuờng. Vì vậy, nhiều nhà khoa học cho rằng dây sẽ chỉ là một kỹ
thuật trợ giúp trong phân loại học [13].
1.2. Công cụ phân tích da dạng di truyền và tiến hóa
1.2.1. Tổng quan về chỉ thị DNA
Nhiệm vụ chính cho bất kỳ chuyên gia về hệ thống thực vật, sinh thái học,
sinh học tiến hóa và bảo tồn hoặc chuyên gia pháp y ứng dụng là dịnh danh chính
xác mẫu dộng thực vật một cách nhanh chóng, có thể lặp lại và dộ dáng tin cậy cao.
Chỉ thị DNA sử dụng các doạn trình tự gen hoặc DNA dặc hiệu là một công cụ hữu
ích dể xác dịnh, nhận dạng loài. Số luợng nghiên cứu sử dụng mã vạch duợc sử
dụng ngày càng nhiều. Bằng cách kết hợp các thế mạnh của di truyền phân tử, công
nghệ giải trình tự và tin sinh học, chỉ thị DNA cung cấp một phuong tiện nhanh
chóng và chính xác dể nhận biết các loài dã biết, mô tả và dặt tên truớc dó và lấy
thông tin về chúng. Cho dến ngày nay, công cụ này khám phá hàng ngàn loài dộng
thực vật chua duợc dặt tên, dặc biệt là trong quần xã sinh vật nhiệt dới. Là một công
cụ khám phá da dạng sinh học mang tính cách mạng [26], chỉ thị DNA dã giúp tìm
kiếm các loài có tiềm nang mới dối với khoa học, phân tích dữ liệu di truyền của
chúng, dặc biệt là với các loài có nguy co tuyệt chủng.

Dựa trên chỉ thị DNA, nhiều mã vạch DNA duợc phát triển. Mã vạch DNA
là các trình tự dặc hiệu cho phép xác dịnh một don vị phân loại nào dó nhu loài. Đối
với những nguời sử dụng phân loại học ứng dụng, mã vạch DNA dóng vai trò là
phuong tiện dể xác dịnh các loài quy dịnh, các loài xâm lấn và các loài có nguy co
tuyệt chủng. Ngoài ra nó còn dể kiểm tra danh tính và dộ tinh khiết của các sản
phẩm thực vật, nhu thuốc thảo duợc thuong mại và thực phẩm chức nang. Mã vạch
DNA hiện dang duợc sử dụng dể giải quyết các vấn dề sinh thái, tiến hóa và bảo
tồn. Quá trình tạo và áp dụng mã vạch DNA thực vật cho mục dích nhận dạng dòi
hỏi hai buớc co bản: 1) xây dựng thu viện mã vạch DNA của các loài dã biết và 2)
khớp với chuỗi mã vạch DNA của một mẫu chua biết so với thu viện mã vạch
DNA. Buớc dầu tiên yêu cầu các nhà phân loại chọn một dến vài cá thể cho mỗi
loài dể làm mẫu tham chiếu trong thu viện mã vạch DNA. Mô, tế bào có thể duợc

thu trực tiếp từ các mẫu vật tuoi hoặc các mẫu khô, không bị nhiễm nấm mốc. Khi


7
thu viện mã vạch DNA hoàn tất, mẫu chua biết sẽ duợc tách chiết DNA tổng số và
mã vạch DNA duợc tạo ra của mẫu vật sẽ duợc so sánh với mã vạch DNA dã biết
bằng cách sử dụng một số loại thuật toán phù hợp [38].
Chỉ thị DNA là công cụ hữu ích giúp phân loại các loài [13, 26, 38]. Đoạn
gen duợc sử dụng có thể tìm thấy ở tất cả các sinh vật (hoặc ít nhất là trong các
thành viên của một nhóm loài), các trình tự nucleotide sẽ giống nhau hoặc rất giống
nhau ở các cá thể trong cùng một loài. Vì vậy khu vực này có thể duợc sử dụng cho
nhận dạng các loài bằng cách so sánh trình tự của chỉ thị DNA trong sinh vật thử
nghiệm với trình tự tham khảo từ các co sở dữ liệu. Các vùng gen duợc dùng làm
chỉ thị DNA ở thực vật bao gồm các trình tự DNA trong lạp thể và DNA trong
nhân. Hiện nay, các chỉ thị dựa trên trình tự DNA là một phuong pháp xác dịnh các
loài một cách hiệu quả. Tuy nhiên, mỗi phuong pháp phân loại dều có những mặt
hạn chế. Chỉ thị DNA phân biệt các loài với nhau, nhung không có dủ dữ liệu dể mô

tả các loài mới nên có thể gây xáo trộn, làm thay dổi hệ thống phân loại truyền
thống dã ổn dịnh với hệ thống danh pháp từ hàng tram nam nay [13].

1.2.2. Các kỹ thuật chỉ chị DNA
Các kỹ thuật chỉ thị DNA duợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di
truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản dồ liên kết di
truyền, nhận biết gen; trong chọn giống bao gồm dánh giá da dạng di truyền, nhận
biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các diều kiện bất lợi của
môi truờng, nang suất và phẩm chất giống. Mỗi kỹ thuật khác nhau sẽ duợc ứng
dụng vào từng dối tuợng mà nhà nghiên cứu huớng dến, hoặc kết hợp nhiều các
phuong pháp khác nhau dể phân tích. Các kỹ thuật không sử dụng PCR nhu da hình
dộ dài doạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), lấy
dấu cắt hạn chế (Restriction Endonuclease Fingerprinting - REF). Các kỹ thuật sử
dụng PCR nhu DNA da hình duợc nhân bản ngẫu nhiên (Randomly Amplified
Polymorphic - DNA/ RAPD); PCR với mồi ngẫu nhiên (Arbitrarily primed PCR - APPCR); da hình dộ dài chuỗi nhân bản (Amplified Sequence Length
Polymorphism - ASLP); nhân bản chọn lọc các locus da hình (Selective
Amplification of Polymorphic Loci - SAMPL). Kỹ thuật chỉ thị dựa trên các tiểu vệ
tinh gồm có chuỗi lặp lại don giản giữa (Inter-Simple Sequence Repeats - ISSR);
chuỗi lặp lại nguợc duợc dánh dấu (Inverse Sequence-Tagged Repeats - ISTR). Các
kỹ thuật PCR các chuỗi dặc trung nhu vị trí chuỗi dánh dấu (Sequence-Tagged-Site
- STS); da hình dộ dài chuỗi don giản (Single Sequence Length Polymorphism -


8
SSLP); các chuỗi lặp lại don giản (Simple Sequence Repeats - SSR). Các kỹ thuật
chỉ thị gen nhảy nhu da hình gen nhảy nguợc giữa duợc nhân bản (InterRetrotrasposon Amplified Polymorphis - IRAP); da hình sự gắn dựa trên gen nhảy
nguợc (Retrotrasposon-Based Insertion Polymorphism - RBIP). Các kỹ thuật chỉ thị
nhân khác có thể kể dến vùng dệm trong duợc sao mã (Internal Transcribed Spacer
- ITS); da hình don nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism - SNP). Các kỹ
thuật chỉ thị lục lạp nhu chuỗi lặp lại don giản lục lạp (Chloroplast Simple

Sequence Repeats - cpSSR); phân tích da hình dộ dài doạn cắt giới hạn DNA lục lạp
(Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis cpDNA - RFLPA cpDNA).
Công nghệ hỗ trợ hiện dại nhu công nghệ sắp xếp da dạng (Diversity array
Technology - DarT); giải trình tự thế hệ thứ hai (Next-geneation sequencing - NGS)
[14].

1.2.3. Vùng dệm trong duợc sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS)
Vùng dệm trong duợc sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) nằm giữa
gen RNA ribosome tiểu don vị nhỏ và gen RNA ribosome tiểu don vị lớn là một
dấu hiệu phát sinh gen duợc sử dụng rộng rãi cho phân loại nhiều loài. ITS ở thực
vật nhân thực chứa rRNA 5,8S duợc bảo tồn và các khu vực có thể biến dổi là ITS1
và ITS2. Các vùng này có chiều dài có thể thay dổi và khuếch dại bằng cách sử
dụng các doạn mồi bổ sung cho các vùng duợc bảo tồn của các gen suờn của chúng.
Có nghiên cứu truớc dây dã chỉ ra rằng việc loại bỏ các khu vực duợc bảo tồn dẫn
dến phân loại chính xác hon [47].
Các vùng tổ chức nhân (nucleolar organizing regions – NORs) nằm trong
nhiễm sắc thể chứa các DNA ribosome (rDNA) là các phần của các don vị lặp lại
(Hình 1.1a) duợc sắp xếp theo thứ tự nhất dịnh với số luợng bản sao lên dến 30000
trong một tế bào [14, 20, 45]. Do dó, vùng rDNA nhu một công cụ cho các nghiên
cứu phát sinh gen do thành phần cấu trúc của nó khác nhau về mức dộ bảo tồn [31].
Xen kẽ giữa các rDNA là các vùng intron không duợc sao mã với chức nang
chua duợc biết rõ. Mỗi Exon (rDNA) chứa các tiểu phần ribosome nhỏ (16S-18S),
vùng ITS và tiểu phần lớn (26S-28S). Theo dó, Hình 1.1b thể hiện duợc vùng ITS
bao gồm ba phần là ITS1, 5,8S và ITS2 nằm xen kẽ giữa các tiểu phần ribosome.
Vùng này duợc gọi chung là vùng dệm trong duợc sao mã (Internal Transcribed
Spacer –ITS).


9
Hình 1.1. So dồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật. (a) Vị trí nhiễm

sắc thể của các vùng rDNA. (b) Cấu tạo của vùng Intron, Exon liền kề [45]
Hai vùng dệm ITS1 và ITS2 có dộ dài không vuợt quá 300 bp [20], tổng dộ
dài vùng ITS dao dộng từ 600 – 700 bp [14]. Có một diểm lý thú cho vùng gen này
là mức dộ tiến hóa của nó nhanh nên dễ dàng thay dổi về trình tự cung nhu dộ dài.
Bên cạnh dó, các vùng liền kề thì có trình tự rất bảo thủ, thuận tiện cho việc thiết kế
mồi cho phản ứng PCR nhân dòng vùng gen ITS. Ngoài ra, do doạn trình tự gen
không dài, nên việc khuếch dại là không khó khan.
Phân tích vùng gen ITS là một kỹ thuật chỉ thị phân tử quan trọng cho nghiên
cứu da dạng di truyền giúp phân loại phân tử các nhóm taxon có liên kết gần gui
[44]. Bởi vì ITS có tính bảo thủ cao trong loài nhung lại thay dổi ở các loài khác
nhau [22]. Có nhiều nghiên cứu dã tiến hành phân tích riêng biệt từng vùng trình tự
ITS1 và ITS2, song kết quả cho thấy chua dủ bằng chứng dể phân tích tiến hóa. Do
dó sự kết hợp dữ liệu vùng ITS cho kết quả khả quan hon. Hầu hết các nghiên cứu
duợc báo cáo, sự khác biệt giữa các chuỗi ITS chủ yếu là do dột biến diểm. Một tỷ
lệ tuong dối nhỏ của những vị trí bị chèn (insert) hoặc xóa (indels) nucleotide trong
các trình tự tuong tự nhau dể giữ lại tín hiệu dủ cho phân tích phát sinh gen [20].
Nghiên cứu da dạng di truyền sử dụng vùng gen ITS có thể duợc tiến hành bằng
cách: Sử dụng những cặp mồi dặc hiệu dể khuếch dại số luợng bản sao vùng gen
mong muốn; tiến hành giải trình tự trực tiếp; xây dựng cây phát sinh phân loài sử
dụng các trình tự nghiên cứu và các trình tự tham chiếu có sẵn trên Genbank.
Với dặc tính nhu trên, hiện nay, ITS dã và dang duợc ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều
linh vực nhu phân tích di truyền và phân loại, nghiên cứu phát sinh


10
loài…Điển hình có thể kể tên các nghiên cứu ứng dụng của các chi, họ khác nhau
nhu Sorghum (Poaceae) [53], Glycine [37], họ Rosoideae [27], chi Bambusa [29],
thậm chí cả nấm…[50] hoặc các nghiên cứu về sự khác biệt di truyền trong họ
Araliaceae [42, 55, 58], Dendropanax [41], sự khác biệt di truyền qua không gian
và thời gian của Dây thuờng xuân (Hedera sp.) [30],… Ngoài ra, hiện nay dể dữ

liệu phân tích thêm dồ sộ và có dộ tin cậy lớn hon, nguời ta thuờng kết hợp phân
tích da dạng di truyền của nhiều gen chỉ thị khác nhau. Trong dó, một sự kết hợp
phổ biến là sử dụng cả vùng gen nhân ITS và cả cùng gen lục lạp (matK, atpB,
ndhF, rbcL, tnrH - tnrK,…) dể phân tích.

1.2.4. Các phuong pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
Theo Darwin, tất cả các loài sinh vật dều tiến hóa từ một tổ tiên chung. Mối quan
hệ giữa các loài sinh vật duợc biểu diễn bởi một cây phân loài. Dữ liệu dầu vào
cây tiến hóa hay cây phân loài có thể là một hay nhiều yếu tố chứa thông tin
khác nhau liên quan dến chúng, nhu là thông tin về cấu trúc hoặc là thông tin về
hình dáng bên ngoài [16]. Về mặt nguyên tắc, các sinh vật có cấu trúc bên ngoài
và hình dáng càng giống nhau thì chúng càng có quan hệ gần gui.
Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, sinh học phân tử cung
nhu tin sinh học, chúng ta hoàn toàn có thể giải mã bất kỳ một hay nhiều doạn gen
nào chúng ta mong muốn, thậm chí là toàn bộ hệ gen của sinh vật. Đó là dữ liệu
quan trọng và là buớc tiến vuợt bậc hữu ích cho ngành phân loại học. Những gì
chúng ta cần là những doạn DNA hay axit amin của mẫu nghiên cứu dể so sánh
giữa chúng với nhau và với dữ liệu sẵn có. Từ dó, chúng ta có co sở dể xây dựng
cây phát sinh loài. Đây là một công cụ suy luận giúp các nhà phân loại học tái lập
lại sự tiến hóa và phân loài trong tự nhiên.

Một cây phân loài thuờng có cấu trúc nhị phân thể hiện mối quan hệ tiến hóa giữa các
loài sinh vật: (1) mỗi dỉnh (nút lá) của cây biểu hiện cho một loài sinh vật hiện tại;
(2) mỗi nút bên trong biểu diễn cho một loài sinh vật tổ tiên; (3) mỗi cạnh
của cây
sẽ nối hai nút của cây và biểu diễn mối quan hệ trực tiếp giữa hai loài sinh vật ở hai
nút của cây; (4) dộ dài của cạnh cho biết khoảng cách tiến hóa giữa chúng. Có 2 dạng
cây thuờng gặp là cây không gốc (không có thông tin về các loài tổ tiên, cạnh của
cây không thể hiện mối quan hệ cha - con giữa các dỉnh của cây) và cây có gốc (các
cạnh trên cây thể hiện mối quan hệ cha con giữa các dỉnh của cây) [16].

11
Hình 1.2. Dạng cây phát sinh loài biết rõ nguồn gốc
Cụ thể, có nhiều phuong pháp khác nhau sử dụng những thuật toán khác nhau dể
giúp chúng ta tái hiện mối quan hệ phát sinh có thể có duợc thể hiện thông
qua cây phát sinh chủng loại từ dữ liệu một nhóm các trình tự dã biết. Một số
phuong pháp hay duợc sử dụng dể xây dựng cây phát sinh chủng loại sẽ duợc trình
bày ở phần duới dây.

1.2.3.1. Phuong pháp Ma trận khoảng cách (Distance Matrix)
Đây duợc cho là một nhóm các thuật toán don giản nhất dã duợc sử dụng từ lâu
trong các nghiên cứu phát sinh loài. Đuợc bắt dầu sử dụng từ những nam 1990 các
thuật toán này sử dụng dể xác dịnh mối quan hệ giữa các loài dựa trên các dấu
hiệu hình thái. Trong dó thuật toán lập nhóm không có trọng số dùng trung bình số
học (UPGMA - Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages)
[52] phân tích tất cả các dấu hiệu qua dó xác dịnh khoảng cách di truyền giữa tất cả
các cặp trình tự, biểu diễn thành dạng ma trận khoảng cách (dạng dối xứng) rồi gộp
từng cặp mẫu có khoảng cách di truyền giữa chúng là nhỏ nhất [10]. Ma trận
khoảng cách D = (dij) biểu diễn khoảng cách giữa n loài là ma trận trong dó mỗi
phần tử dij là khoảng cách giữa 2 nút của cây trong quan hệ phát sinh [16]. Khoảng
cách giữa các dỉnh (nút lá) và các nút bên trong cây duợc chỉ rõ. Khoảng cách dij
thỏa mãn 3 diều kiện: Tính dối xứng (dij = dji với mọi i, j); tính phân biệt (dij ≠ 0
chỉ khi i ≠ j); bất dẳng thức tam giác: dij < dik + dkj với mọi i, j. Nhìn chung các
thuật toán dựa trên “ma trận khoảng cách” cho kết quả phân tích nhanh, phù hợp dể
xử lý một luợng dữ liệu lớn, cho biết khoảng cách di truyền tuong dối giữa các loài
nhung không phản ánh duợc sự tiến hóa của mỗi gen [10].
Ngoài ra, một phuong pháp khác là Gom cụm lân cận (NJ – Neighbor joining
cung rất duợc hay dùng trong xây dựng cây phát sinh chủng loại với luợng dữ liệu
dồ sộ) [48]. Theo thuật toán này, tỷ lệ tiến hóa duợc tính toán tự do và khác nhau giữa

các dòng khác nhau. Phuong pháp này gần nhu tuong tự với UPGMA,


12
tuy nhiên xuất hiện “cụm lân cận” tức là, hai trình tự duợc gọi là lân cận (gần
nhau) trong một cây, nếu nhu giữa chúng chỉ có duy nhất một nút.
1.2.3.2. Phuong pháp Tiết kiệm tối da (Maximum Parisimony)
Dựa trên nguyên tắc sinh học là “dột biến hiếm khi xảy ra”. Thuật toán này
cho rằng: Cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có dột biến thấp nhất trên tất cả các cây
tiến hóa có thể giữa các taxon duợc phân tích. Do vậy, cây tiến hóa thu duợc từ
phuong pháp này duợc gọi là cây tích phân tiến hóa tối uu [10]. Chỉ số tin cậy cho
từng nhánh cây gọi là giá trị tin cậy (bootstrap), một nhánh chỉ duợc coi là có dộ tin
cậy khi giá trị này dạt trên 70% [33]. Uu diểm của phuong pháp này là tốc dộ tính
toán nhanh và duợc cho là khách quan nhất. Phuong pháp không dua ra bất kì một
giả dịnh nào về quá trình tiến hóa, mà dựa trên nguyên lý giản tiện tối da: Cây tốt
nhất duợc chọn ra dựa vào việc giảm thiểu hóa số luợng các vị trí thay thế cần thiết
dể giải thích cho các vị trí mang thông tin.

1.2.3.4. Phuong pháp Xác suất tối da (Maximum Likelihood)
Đây là một phuong pháp xác suất [10, 60] thuần túy thuờng duợc dùng dể
kiểm chứng lại các cây tiến hóa dã xây dựng bởi các phuong pháp khác. Phuong
pháp này dánh giá một giả thiết tiến hóa bằng xây dựng tất cả các cây tiến hóa có
khả nang xảy ra. Tiếp theo, xác dịnh cây tiến hóa nội suy là cây có xác suất xảy ra
cao nhất qua việc phân tích các yếu tố tiến hóa. Chẳng hạn, về dại thể tần số dột
biến dồng hoán cao hon khoảng 3 lần so với các dột biến dị hoán [10]. Đây duợc
coi là phuong pháp cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hon cả so với các
phuong pháp khác. Nhung thực tế, tốc dộ xử lí thông tin theo phuong pháp này
chậm và không khả thi khi phân tích một luợng dữ liệu lớn. Phuong pháp này cung
cho ra cây tiến hóa có dộ tin cậy khi giá trị dộ tin cậy (bootstrap) dạt trên 70% ở
mỗi nhánh [33].

Thông thuờng trong các nghiên cứu duợc tiến hành dựa trên nhiều phuong pháp
khác nhau, kết quả nghiên cứu tốt là khi các cây tiến hóa duợc xây dựng từ nhiều
phuong pháp nhung cho cấu trúc tuong dồng. Trong nghiên cứu này chúng tôi
sử dụng ba phuong pháp là: Tiết kiệm tối da (Maximum Parsimony), hợp lý tối da
(Maximum Likelihood) và phuong pháp ma trận khoảng cách với thuật toán
UPGMA bằng phần mềm MEGA X.


13
1.3. Tổng quan về Dây thuờng xuân (Hedera nepalensis K. Koch)
1.3.1. Phân loại học loài Hedera nepalensis K. Koch
Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật nhu sau: Ngành Ngọc lan
Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan Magnoliopsida
Phân lớp Hoa hồng Rosidae
Bộ Hoa tán Apiales
Họ Nhân sâm Araliaceae
Chi Hedera
Loài Hedera nepalenis K. Koch Đặc diểm hình thái chung của chi Hedera: Theo
những nghiên cứu gần dây,
chi Hedera bao gồm 16 loài [19] khác nhau phân bố châu Âu, Bắc Phi, Macaronesia
và châu Á. Trong họ Nhân sâm (Araliaceae), chi Hedera (L.) là chi dại diện duy
nhất có dặc diểm hình thái dạng dây leo. Chúng là những cây leo thuờng xanh có
nhiều rễ móc khí sinh, nhẵn và không có gai. Lá mọc so le, lá don không có lá kèm,
phiến lá phân thùy, dài từ 5 – 10 cm, rộng từ 3 - 8 cm, gân chân vịt. Cụm hoa chùy,
gồm nhiều tán, có lông sao. Hoa nhỏ, màu vàng trắng và lục trắng; lá bắc rất nhỏ,
dài có 5 rang nhỏ; tràng 5, gốc rộng, có một mào cuốn ở giữa; nhị 5; bầu 5. Quả
hạch tròn, khi chín có màu den [1, 3, 5]. H. nepalnensis là loài có dây bò dài có thể
lên tới 20 m, có nhiều rễ mọc khí sinh ở các mắt, lá don, cụm hoa có lông dỏ nâu,

mọc rải rác trong rừng thua; phổ biến ở dộ cao 1000 – 3000 m [1, 2].

Hình 1.3. Cây Dây thuờng xuân H. nepalensis [61].


14
1.3.2. Đặc diểm hình thái và phân bố dịa lý
Theo các nghiên cứu về phát sinh chủng loài cho thấy Châu Á chính là trung
tâm xuất xứ của chi Hedera, sau dó các loài thuộc chi phát tán dến Châu Âu và
vùng Địa Trung Hải. Ngày nay, các loài thuộc chi Hedera phân bố chủ yếu ở các
vùng ôn dới và cận nhiệt dới nhu Châu Âu và một số vùng Châu Á với nền nhiệt
trung bình tuong dối mát từ 26 – 30oC và cần dộ ẩm cao [7]. Hai loài dến nay duợc
sử dụng rộng rãi và nghiên cứu nhiều hon cả về duợc học là Thuờng xuân (H. helix)
và Dây thuờng xuân (H. nepalensis) dều có phạm vi phân bố tuong dối hẹp trên thế
giới. Theo thống kê của Viện Duợc liệu ở Việt Nam có trữ luợng lớn Dây thuờng
xuân phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền phía Bắc nuớc ta nhu Son La, Lào Cai, Hòa
Bình, Lai Châu, Hà Giang… (Hình 1.3)

Hình 1.4. Phân bố dịa lý của H. nepalensis tại miền Bắc nuớc ta
1.3.3. Giá trị y học
1.3.3.1. Nghiên cứu duợc lý trên thế giới
Tác dụng chống ung thu
Nam 2015, Laila và cộng sự thực hiện nghiên cứu trong ống nghiệm: Phân
tích tác dụng ức chế và gây dộc các dòng tế bào ung thu của các phân doạn dịch
chiết H. nepalensis. Thí nghiệm sử dụng 05 mẫu thử là chiết xuất thô (HNC), phân
doạn n-hexane (HNN), phân doạn ethyl acetate (HNE), phần dịch chiết còn lại (HNA)
và Lupeol. Các phân doạn này lần luợt duợc tiến hành các xét nghiệm


15

Nitrate, xét nghiệm NFκB, xét nghiệm aromatase và xét nghiệm quinone reductase
1 (QR1). Tiềm nang gây dộc tế bào duợc dánh giá trên 3 dòng tế bào ung thu
là MCF-7, MDA-MB-231, Hela với xét nghiệm sulforhodamine B (SKB). Kết quả
phân tích chỉ ra rằng cả chiết xuất thô và các phần phân doạn trong H. nepalensis
dều có khả nang ức chế sự tang truởng (hon 60%) của ba dòng tế bào ung thu. Cụ
thể là chất lupeol duợc phân lập từ n-hexane, ethyl acetate có giá trị IC 50 thay dổi da
dạng 2,32 – 10,2 μM; ức chế 84,78% sản xuất oxid nitric (50 μM) với giá trị IC 50
2,1 ± 1,3 μM. Đồng thời, luợng lupeol duợc dánh giá trên HPLC dầu dò DAD trong
các mô khác nhau (rễ, thân, lá) dã chứng minh duợc lá H.nepalensis là một nguồn
lupeol phong phú (0,196 mg/100 mg trọng luợng khô). Báo cáo này là báo cáo dầu
tiên dua ra tiềm nang của H. nepalensis chứa các tác nhân hóa trị ung thu và gây
dộc tế bào [35].
Các phân tích duợc lý của T. Li và cộng sự (2015) thực hiện chứng minh
saponin từ H. nepalensis K. Koch có tác dụng chống ung thu thông qua việc gây
ra sự chết theo chu trình của các tế bào ung thu trong ống nghiệm. Họ dã tìm thấy
rằng một chiết xuất ethanol 95% từ H. nepalensis K. Koch có thể ức chế sự phát
triển của dòng tế bào ung thu phổi không phải tế bào nhỏ ở nguời A549
(28,39 ± 4,36 μg/ml). Hai hợp chất chống ung thu là pulsatilla saponin A và
hederagenin 3- O -a-L-arabinopyranoside (phân lập từ chiết xuất ethanol 95%
của H. nepalensis K. Koch) dựa trên khả nang ức chế sự phát triển của tế bào A549
trong ống nghiệm. Các hoạt dộng ức chế tang truởng của pulsatilla saponin A thông
qua việc gây ra sự chết theo chu trình cho tế bào A549 dã duợc báo cáo truớc dây
bởi những nguời khác. Tuy nhiên, các hoạt dộng ức chế tang truởng tế bào A549
của hederagenin 3- O -a-L-arabinopyranoside, cung nhu hành dộng gây ra apoptosis
của nó chua từng duợc báo cáo truớc dây. Những kết quả này có thể giúp phát triển
huớng trị liệu mới trong tuong lai chống ung thu phổi không phải tế bào nhỏ từ H.
nepalensis K. Koch [43].
Một nghiên cứu mới dây nhất của Qamar và cộng sự (2019), các tác giả dã
nỗ lực thực hiện các thí nghiệm dể sàng lọc một số cây thuốc ít duợc khám phá
truớc dó. Tổng cộng 10 cây thuốc thuộc các họ, chi khác nhau duợc sử dụng, trong

dó có H. nepalensis. Thí nghiệm chứng minh các cây thuốc lựa chọn có hoạt tính
chống ung thu mạnh với giá trị gây dộc tế bào tối thiểu (IC 50 > 3 μM) và dộc tính
thấp hoặc không dáng kể. Theo dó, những cây thuốc duợc dánh giá về gây dộc tế
bào phụ thuộc vào liều thông qua xét nghiệm MTT trong ống nghiệm và mô hình