Nghiên cứu một số đặc trưng của chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 30

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Ngô Thị Huyền Trang

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA CHẾ
PHẨM ARABINOXYLAN TẠO RA TỪ CÁM GẠO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Ngô Thị Huyền Trang

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA CHẾ
PHẨM ARABINOXYLAN TẠO RA TỪ CÁM GẠO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. PHAN TUẤN NGHĨA

Hà Nội - 2012


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................2
1.1. Arabinoxylan và nguồn nguyên liệu cám gạo ...............................................2
1.1.1. Giới thiệu chung về arabinoxylan .......................................................2
1.1.2. Cấu tạo của arabinoxylan ....................................................................4
1.1.3. Chức năng sinh học của arabinoxylan ................................................7
1.1.4. Nguyên liệu cám gạo chứa arabinoxylan ............................................7
1.2. Enzyme endoxylanase và các phương pháp tách chiết arabinoxylan............8
1.2.1. Giới thiệu chung về enzyme endoxylanase.........................................8
1.2.2. Các phương pháp tách chiết arabinoxylan ........................................10
1.3. Các nghiên cứu định tính và định lượng arabinoxylan ...............................12
1.3.1.Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide ..........................13
1.3.2. Phân tích định tính arabinoxylan .......................................................14
1.3.3. Phân tích định lượng arabinoxylan ....................................................14
1.4. Các nghiên cứu tinh sạch và xác định khối lượng phân tử của arabinoxylan ....18
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................20
2.1. Nguyên liệu..................................................................................................20
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................20
2.2.1. Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide .........................20
2.2.2. Phân tích định lượng arabinoxylan bằng kit D-xylose và kit Arabinan ...21
2.2.2.1. Xác định hàm lượng D-xylose có trong arabinoxylan sau khi
đươc thủy phân bằng D-xylose kit [60]. ............................................................ 21


2.2.2.2. Xác định hàm lượng L-arabinose có trong arabinoxylan sau
khi đươc thủy phân bằng Arabinan kit [59] ...................................................... 23

2.2.3. Phân tích định tính arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký bản mỏng ...25
2.2.4. Tinh sạch và cô đặc mẫu bằng màng lọc có kích thước lỗ xác định..26
2.2.5. Đánh giá tỷ lệ và kích thước của arabinoxylan bằng phương pháp sắc ký lọc gel.26
2.2.6. Xác định độ ẩm ..................................................................................28
2.2.7. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [2] ...29
2.2.8. Xác định hàm lượng asen...................................................................29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................30
3.1. Xây dựng quy trình định tính và định lượng arabinoxylan .........................30
3.1.1. Thủy phân arabinoxylan bằng acid và định tính, định lượng arabinoxylan30
3.1.2. Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase và định tính, định
lượng arabinoxylan .............................................................................................35
3.2. Phân tích một số tính chất của chế phẩm arabinoxylan được tạo ra từ cám gạo .....40
3.2.1. Xác định khối lượng phân tử của chế phẩm arabinoxylan ................40
3.2.2. Xác định độ ẩm của chế phẩm arabinoxylan được tạo ra từ cám gạo45
3.2.3. Xác định hàm lượng protein tổng số của chế phẩm arabinoxylan .....46
3.2.4. Xác định hàm lượng asen của chế phẩm arabinoxylan ......................46
KẾT LUẬN ...............................................................................................................47
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................48


BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

AX

Arabinoxylan

A340

Độ hấp thu ở bước sóng 340 nm

EtOH

Ethanol

kDa

Kilodalton

HPSEC

Sắc ký chọn lọc theo kích thước phân tử hiệu năng cao
(High Performance Size Exclusion Chromatography)

KLPT

Khối lượng phân tử

β-D-Xylp

β-D-xylopyranosyl

α -L-Araf

α-L-arabinofuranosyl

XOS

Xylan-oligosaccharide

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần các hợp chất trong thành tế bào một số hạt ngũ cốc……….4
Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của một số ngũ cốc…………………………….8
Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng định lượng D-xylose bằng D-XYLOSE KIT22
Bảng 2.2: Thành phần của phản ứng định lượng L-arabinose bằng
ARABINAN KIT………………………………………………………………….24
Bảng 3.1: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân
arabinoxylan thương mại bằng axit………………………………………………...31
Bảng 3.2: Kết quả định lượng D-xylose sau khi thủy phân mẫu chứa arabinoxylan
bằng axit…………………………………………………………………………...32
Bảng 3.3: Kết quả định lượng L-arabinose sau khi thủy phân mẫu chứa
arabinoxylan bằng axit…………………..…………………………………………32
Bảng 3.4: Hàm lượng arabinoxylan có mặt trong chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ
cám gạo được thủy phân bằng axit………………………………………………..33
Bảng 3.5: Kết quả định lượng D-xylose và L-arabinose sau khi thủy phân
arabinoxylan thương mại bằng enzyme xylanase…………………...……………..35
Bảng 3.6: Kết quả định lượng D-xylose sau khi thủy phân chế phẩm arabinoxylan
tạo ra từ cám gạo bằng enzyme xylanase…………………………………………..36
Bảng 3.7: Kết quả định lượng L-arabinose sau khi thủy phân chế phẩm
arabinoxylan tạo ra từ cám gạo bằng enzyme xylanase….……………………… 36
Bảng 3.8: Hàm lượng arabinoxylan trong chế phẩm tạo ra từ cám gạo được thủy
phân bằng enzyme…………………………………………………………………37


Bảng 3.9: Khối lượng phân tử của arabinoxylan tách ra bằng sắc ký lọc gel
Sephadex G-100………………………………………………………………...…43
Bảng 3.10: Khối lượng của hộp mẫu sau khi được sấy đến khối lượng không
đổi…………………………………………………………………………………45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc các đơn vị của arabinoxylan……………………………………5
Hình 1.2: Cấu trúc của arabinoxylan ngũ cốc……………………………………….6
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử arabinoxylan…………………………………………..6
Hình 1.4: Cấu trúc của họ endoxylanase 10 và 11………………………………….9
Hình 1.5: Sự phân loại arabinoxylan theo khả năng hòa tan……………………...11
Hình 1.6: Vị trí cắt hoạt động endoxylanase………………………………………12
Hình 1.7: Vị trí hoạt động của endo-1,4-β -ᴅ-xylanase trên phân tử arabinoxylan13
Hình 3.1: Kết quả sắc ký bản mỏng chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo sau
khi được thủy phân bằng axit………………………………………………………34
Hình 3.2: Kết quả sắc ký bản mỏng chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo sau
khi được thủy phân bằng enzyme xylanase……………………………………….38
Hình

3.3:

Tóm

tắt

quy

trình

phân

tích

định

tính,

định

lượng

arabinoxylan……………….………………………………………………………39
Hình 3.4: Đồ thị tương quan giữa khối lượng phân tử và thể tích rửa chiết của các
chất chuẩn qua sắc ký lọc gel Sephadex G-100………………………………..…41
Hình 3.5: Đồ thị minh họa giá trị A340 của các phân đoạn rửa chiết từ 1 đến 70 qua
sắc ký lọc gel Sephadex G-100…………………………………………………..42
Hình 3.6: Kết quả sắc ký bản mỏng sau khi thủy phân các phân đoạn rửa chiết
arabinoxylan………………………………………………………………………44


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

MỞ ĐẦU
Arabinoxylan (AX) là polysaccharide được cấu tạo từ hai đường arabinose
và xylose có kích thước phân tử lớn có thể lên đến hàng trăm, hàng nghìn kDa và
thường được sử dụng làm thực phẩm chức năng tương đối phổ biến trên thế giới.
AX thể hiện được hoạt tính miễn dịch, phòng chống ung thư, có ưu thế vượt trội so
với các hoạt chất gây kích thích miễn dịch khác do có nguồn gốc tự nhiên và đã
được sử dụng với chức năng tăng cường miễn dịch cho bệnh nhân nhiễm HIV, viêm
gan và ung thư.

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu và sản xuất thực
phẩm chức năng chứa AX nhưng thực tế cho thấy các chế phẩm này được bán với
giá khá cao, hơn nữa, thành phần cụ thể cũng như hàm lượng AX trong các chế
phẩm đều không được các nhà sản xuất cung cấp một cách rõ ràng. Trong khi đó
AX lại có thể được tách chiết từ các phụ phẩm nông nghiệp rẻ tiền như ngũ cốc,
mày ngô, hay phổ biến hơn cả là từ cám gạo, những nguyên liệu rất sẵn có ở một
nước nông nghiệp như Việt Nam. Một số nhóm nghiên cứu trong nước đã bắt đầu
nghiên cứu tạo chế phẩm AX từ các nguồn nguyên liệu sẵn có trong nông nghiệp
như cám gạo và mở ra cơ hội cho người tiêu dùng được sử dụng AX với giá cả hợp
lý hơn. Vì vậy, việc thiết kế quy trình định tính, định lượng AX trong các chế phẩm
một cách hiệu quả và nghiên cứu một số đặc trưng của chế phẩm là rất cần thiết cho
các nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng chứa AX.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “ Nghiên cứu một số
đặc trưng của chế phẩm arabinoxylan tạo ra từ cám gạo”.

Khóa 2010 - 2012

1


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Arabinoxylan và nguồn nguyên liệu cám gạo

1.1.1. Giới thiệu chung về arabinoxylan

Ở thực vật, các polysaccharide chủ yếu tồn tại ở hai dạng: tinh bột và phi
tinh bột, hàm lượng của chúng thay đổi tùy theo loài, loại tế bào và giai đoạn sinh
trưởng [15].
Nhóm polysaccharide phi tinh bột bao gồm cellulose, hemicellulose, pectic
polysaccharide và được phân loại chủ yếu dựa vào phương pháp được sử dụng để
tách chiết polysaccharide đó như khả năng hòa tan của chúng khi được chiết bằng
kiềm. Cellulose là polymer được cấu tạo bởi các đơn vị đường glucose, nối với
nhau bởi liên kết β-(1→4) glycoside, gồm các chất không hòa tan được trong kiềm
và là nhóm hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong tự nhiên. Nhóm hemicellulose bao
gồm các hợp chất như xylan, arabinoxylan, β-glucan, galactan, xyloglucan… có khả
năng hòa tan trong kiềm. Các pectin bao gồm các gốc acid polygalacturonic có thể
là thành phần cấu tạo của arabinan, galactan và arabinogalactan [15]. Cả cellulose
và hemicellulose đều có vai trò như các vật liệu để cấu trúc nên thành tế bào thực
vật, trong khi thành phần cellulose tạo độ cứng rắn thì hemicellose tạo nên sự dẻo
dai cho cấu trúc thành tế bào nhờ các liên kết dọc với các vi sợi cellulose [10]. Các
monosaccharide thường có trong thành tế bào ngũ cốc bao gồm các hexose như Dglucose, D-galactose, D-mannose; các đường pentose như L-arabinose, D-xylose và
các đường acid như acid D-galacturonic, acid D-glucuronic và các dạng eter 4-Omethyl của chúng [15].
Các xylan là những hemicellulose phổ biến nhất trong tự nhiên và là
polysaccharide phi tinh bột có nhiều thứ hai trong cơ thể thực vật chỉ sau cellulose.
Các xylan có thể được phân chia thành 3 nhóm [41]:

Khóa 2010 - 2012

2


Luận văn Thạc sĩ Khoa học



Ngô Thị Huyền Trang

Nhóm Glucurono - arabinoxylan có mặt ở các phần gỗ mềm, mô đang

hóa gỗ của các cây thân thảo và cây hàng năm.


Nhóm Arabinoxylan ở hạt các cây ngũ cốc.



Nhóm Glucuronoxylan ở các phần gỗ cứng.

Trong đó, các hợp chất AX ở các cây ngũ cốc thường được tách chiết, tinh
sạch và phân tích thử nghiệm hoạt tính sinh học với mục tiêu sản xuất thực phẩm
chức năng dùng cho con người.
Các cây ngũ cốc là các cây thân thảo thuộc họ Hòa thảo (Poaceae) thường
được trồng lấy hạt làm thức ăn cho người và gia súc. Các cây ngũ cốc chính như
ngô (Zea mays L.), lúa gạo (Oryza sativa), lúa mì (Triticum spp), đại mạch
(Hordeum vulgare)… được trồng rộng rãi khắp thế giới. Trong đó ngô, lúa mì và
lúa gạo chiếm 87% sản lượng các loại hạt được gieo trồng và chiếm 43% lượng
thức ăn năm 2003 [68].
Hàm lượng của AX trong hạt ngũ cốc tương đối nhỏ, chiếm từ 1,2% tổng
chất khô ở lúa gạo (Oryza sativa) đến khoảng 8,5% ở lúa mạch đen (Secale
cereale). Tuy nhiên nhóm hợp chất này lại chiếm một tỷ lệ đáng kể ở thành tế bào
của nội nhũ hạt. Cụ thể hàm lượng AX trong thành tế bào hạt thay đổi từ khoảng
20% ở đại mạch (Hordeum vulgare) đến 70% ở lúa mì (Triticum aestivum) (Bảng
1.1)

Khóa 2010 - 2012

3


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

Bảng 1.1: Thành phần các hợp chất trong thành tế bào một số hạt ngũ cốc

Hạt

tế bào
Lúa mì
(Triticum
aestivum)

Arabinoxylan Cellulose

β-Glucan

Tài liệu
Hợp chất tham
khảo
khác

Vỏ nội nhũ

65

2

29

4

Nội nhũ
hạt

70

4

20

6

Vỏ nội nhũ
Đại mạch
(Hordeum
Nội nhũ
vulgare)
hạt
Lúa gạo
(Oryza
sativa)

Thành phần các hợp chất (%)

Loại thành

Nội nhũ
hạt

Ngô
Nội nhũ
(Zea mays) hạt

[3]
71

2

26

1

20

2

75

3

27

28

20

25

[51]

50

20

17

13

[19]

1.1.2. Cấu tạo của arabinoxylan
Chuỗi chính của arabinoxylan trong ngũ cốc được tạo thành từ hai loại
đường 5 cacbon là arabinose và xylose, bao gồm mạch chính chứa các liên kết β(1→4) liên kết các phân tử β-D-Xylp. Mạch xylan liên kết với α-L-Araf thông qua
liên kết 1-2 hoặc 1-3 ở nguyên tử O2 và O3 của phân tử xylosyl [13-15].
Nhóm phụ này thường liên kết 1-3 với β-D-Xylp ở tất cả các loại ngũ cốc, trong khi
đó β-D-Xylp liên kết 1-2 với nhóm α-L-Araf thường thấy trong AX tan trong kiềm
được chiết từ bột lúa mạch và trong các ngũ cốc khác với một lượng nhỏ.
Các phân tử thường liên kết vào mạch chính của AX là arabinose, có thể là
các đường hexose, acid hexuronic. Các chuỗi bên của AX thường là các hợp chất
Khóa 2010 - 2012

4


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

phenol (phenolic) và các protein. Đặc điểm đặc trưng trong cấu trúc AX ở hầu hết
các loài ngũ cốc đó là tỷ lệ liên kết của các phân tử ở cả hai nguyên tử O2 và O3.
Hầu hết các AX trong hạt ngũ cốc đều không tan trong nước do chúng bị neo giữ ở
thành tế bào bằng các liên kết chéo giống như liên kết ester không bền vững trong
kiềm. Các AX không liên kết với thành tế bào có thể tạo thành dạng dung dịch rất
nhớt và vì thế tăng khả năng hấp thụ vào nước cao hơn đến 10 lần. Khi có mặt các
tác nhân oxi hóa như H2O2/peroxide, AX có thể nhanh chóng hình thành mạng lưới
gel do có sự tái lập các liên kết chéo. Ngoài ra, khối lượng phân tử của AX rất đa
dạng, phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu và phương pháp tách chiết [15].
Ngoài α-L-Araf, mạch chính β-D-Xylp cũng có thể mang thêm acid α-Dglucopyranosyluronic (α-D-GlcA) hoặc dạng 4-O-methyl của nó (4-O-Me-α-DGlcA) và thay thế nhóm acetyl. Acid ferulic và p-coumaric có thể tạo liên kết ester
tại vị trí O-5 ở một vài đơn vị α-L-Araf. Các nhóm acetyl, acid ferulic và pcoumaric dễ dàng được giải phóng khi chiết bằng kiềm [14, 15, 65]. Các đơn vị cấu
trúc chính của AX được minh họa như hình 1.1, và cấu trúc minh họa cho AX được
thể hiện ở hình 1.2 và 1.3.

H nh 1.1: Cấu trúc các đơn vị của arabinoxylan

Khóa 2010 - 2012

5


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

Hình 1.2: Cấu trúc của arabinoxylan ngũ cốc

H nh 1.3: Cấu trúc phân tử arabinoxylan [65]
Tỷ lệ arabinose/xylose trong AX của nội nhũ lúa mì thay đổi từ 0,5-0,71, ở
cám mì là từ 1,02-1,07, ở nội nhũ của lúa mạch đen là 0,48-0,55, AX ở nội nhũ lúa
gạo khi được chiết bằng kiềm có tỷ lệ AX/xylan khoảng 0,8, còn ở cám gạo là 0,93.
Ở gạo và cao lương mạch xylan phân nhánh nhiều hơn so với ở lúa mỳ, lúa mạch
đen và đại mạch, hơn nữa trong cấu trúc AX ở gạo có thể chứa galactose, acid
glucuronic [31].

Khóa 2010 - 2012

6


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

1.1.3. Chức năng sinh học của arabinoxylan
Arabinoxylan là hợp chất có thể kích thích hệ thống miễn dịch mạnh hơn và
an toàn hơn bất kỳ hợp chất tự nhiên hoặc tổng hợp khác. Nó làm tăng sản xuất các
cytokine tự nhiên của cơ thể - yếu tố hoại tử khối u (TNF) và interferon nội sinh
(IFN), điều này không chỉ giúp tiêu diệt một cách trực tiếp các tế bào gây hại và
virus mà còn hoạt hóa hệ thống miễn dịch bằng cách làm tăng hoạt động của tế bào
lympho - B và T và các tế bào đặc biệt - tế bào giết tự nhiên (tế bào NK) [34]. Các
tế bào B tập trung sản xuất các kháng thể, trong khi các tế bào T và NK đi trong cơ
thể trực tiếp phá hủy các tế bào bị nhiễm virus hoặc do vi khuẩn, và các tế bào ung
thư. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng AX được tạo ra từ ngũ cốc có khả năng gây
đáp ứng miễn dịch chống các khối u [49]. Ngoài ra, sử dụng AX trong điều trị có
thể làm tăng sinh đại thực bào, tế bào NK và hoạt động đại thực bào, điều này
chứng tỏ rằng AX đã thúc đẩy cả đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu đối

với khối u. Đặc biệt, các AX có khối lượng phân tử khoảng 5-300 kDa thể hiện hoạt
tính miễn dịch mạnh nhất, được sử dụng khá phổ biến trên thế giới ở dạng thực
phẩm chức năng và được khuyến cáo sử dụng cho bệnh nhân nhiễm HIV, viêm gan
và ung thư [36, 37].
1.1.4. Nguyên liệu cám gạo chứa arabinoxylan
Cám gạo là phụ phẩm chính thu được từ lúa sau khi xay xát và thường chiếm
khoảng 10% chất khô của lúa. Cám gạo được hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm
phôi của hạt, cũng như một phần từ tấm. Cám gạo có màu sáng và mùi thơm đặc
trưng. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cám gạo biến động rất lớn, phụ
thuộc nhiều vào kỹ thuật xay xát gạo. Tỷ lệ vỏ trấu sau khi xay xát ảnh hưởng nhiều
tới hàm lượng protein, chất béo và chất xơ của cám gạo thành phẩm. Tỷ lệ protein
trong cám gạo mịn có thể đạt 12-14%. Lượng protein thô ở cám gạo cao hơn so với
ở bắp hạt (chỉ đạt 8,3%). Hàm lượng chất béo, chất xơ khoảng 13-14% và 7-8%
[65], giàu các polysaccharide hemicellulose trong đó AX là thành phần chủ yếu có

Khóa 2010 - 2012

7


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

trong cấu thành chất xơ của cám gạo, chúng chiếm khoảng 60% tổng số các
polysaccharide không phải tinh bột [50, 65].
Ở Việt Nam, cám gạo là một nguyên liệu phổ biến, rẻ tiền, chứa hàm lượng
AX cao, vì thế đã trở thành sự lựa chọn tối ưu cho nguyên liệu tách chiết AX trên
quy mô lớn.
ảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của một số ngũ cốc [65]

Chỉ tiêu
Protein (%)

Bắp

Cám gạo
nguyên dầu

Cám gạo
trích dầu

Lúa mì

Cám
lúa mì

Bột mì

8

13

15

12

16

16

3,5

3,1

2,3

3,4

2,5

3,0

Xơ thô (%)

2,2

8

11

2,5

11

9

Xơ tổng số (%)

9,5

19

27

10,5

44

27

NSP tổng số (%)

9

15

21

9,5

38,2

23,5

Cellulose (%)

2,0

5

7

2,5

11

8

Lignin (%)

0,5

4

6

1

5,8

3,5

Arabinoxylan (%)

3,7

9

11

5,5

21

15

(% không hoà tan)

94

96

97

77

99

97

Năng lượng tiêu
hóa (Kcal/kg)

1.2.

Enzyme endoxylanase và các phương pháp tách chiết arabinoxylan

1.2.1. Giới thiệu chung về enzyme endoxylanase
Enzyme endoxylanase thủy phân khung đường xylan của AX một cách ngẫu

nhiên, làm giảm mức độ polymer hóa của cơ chất và giải phóng các oligomer,
đường xylose, xylobiose.

Khóa 2010 - 2012

8


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

Hiện nay, endoxylanase được phân loại chủ yếu dựa trên thông tin gen mã
hóa và phân tích cấu trúc. Phân tích mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa và
nhóm kỵ nước có thể phân chia endoxylanase thành 2 họ: họ 10 và họ 11, đều là họ
enzyme thủy phân liên kết glycoside [32].
Họ endoxylanase 10 có khối lượng phân tử tương đối cao và cấu trúc phức
tạp hơn so với họ endoxylanase 11 [32]. Các enzyme này có xu hướng hình thành
dạng oligo với mức độ polymer hóa thấp hơn [9] (Hình 1.4A).
Họ endoxylanase 11 có khối lượng phân tử thấp hơn so với họ endoxylanase
10, có xu hướng đặc hiệu hơn với cơ chất xylan và tạo ra các đoạn oligo dài hơn
(Hình 1.4B).

B

A

Hình 1.4: Cấu trúc của họ endoxylanase 10 (hình A) và 11 (hình B) [55]
Ngoài ra, endoxylanase thủy phân cơ chất xylan (hay endo-β-(1→4)-Dxylanase [β-(1→4)-D-xylan xylano hydrolase]) còn được phân chia thành bốn loại,
bao gồm:

- Các endoxylanase thủy phân không giải phóng arabinose (I): các enzyme này
không phân cắt ở các điểm nhánh L-arabinosyl bắt đầu liên kết β-(1→4), vì thế sản
phẩm thủy phân chỉ tạo ra phần lớn là xylobiose và xylose. Chúng cũng có thể thủy
phân một lượng nhỏ xylo-oligosaccharide cũng như xylobiose.
- Các endoxylanase thủy phân không giải phóng arabinose (II): các enzyme
này không phân cắt các điểm nhánh α-(1→2) và α-(1→3) và vì thế sản phẩn thủy

Khóa 2010 - 2012

9


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

phân chủ yếu gồm các xylo-oligosaccharide có kích thước lớn hơn xylobiose. Các
enzyme này không thủy phân xylotriose và xylobiose.
- Các endoxylanase thủy phân xylan có tạo thành arabinose (III): Các enzyme
này phân cắt mạch xylan ở các điểm nhánh và tạo ra sản phẩm chủ yếu là xylobiose,
xylose và arabinose.
- Các endoxylanase thủy phân xylan có tạo thành arabinose (IV): Các enzyme
này thủy phân xylan ở các điểm nhánh, tạo ra arabinose và các sản phẩm xylooligosaccharide có kích thước trung gian [4].
Endoxylanase ở một số ngũ cốc như lúa mì, lúa mạch, lúa mạch đen và trong
những mô khác nhau của lúa mì thường có hoạt tính yếu [12, 46]. Sau khi nảy mầm,
các enzyme nội sinh endoxylanase thủy phân các tế bào nội nhũ vỏ, làm cho các
thành phần dự trữ tinh bột và các protein gluten có thể tiếp cận tới amylase và
protease.
Endoxylanase cũng được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, côn trùng, ốc, động vật
giáp xác, tảo biển. Một số sinh vật này đã được ứng dụng trong sản xuất

endoxylanase công nghiệp, nghiên cứu, nhân bản các gen mã hóa cho endoxylanase.
Các tiêu chí quan trọng để lựa chọn endoxylanase bao gồm tính đặc hiệu cơ chất, độ
bền và phạm vi nhiệt độ và pH hoạt động của enzyme. Ví dụ, endoxylanase của
nấm thường hoạt động tốt nhất ở điều kiện acid (pH 3,5-5,5) và bền trong một phạm
vi pH rộng (pH 3,0-10,0), trong khi đó endoxylanase của vi khuẩn có pH tối ưu cao
hơn (pH 6,0-7,0) và có dải pH hoạt động hẹp hơn (pH 5,0-7,3). Endoxylanase của vi
khuẩn thông thường có nhiệt độ hoạt động tối ưu khoảng 40 - 50oC và thường được
tiết vào môi trường ngoại bào [16].
1.2.2. Các phương pháp tách chiết arabinoxylan
Arabinoxylan được phân chia thành 2 dạng: dạng có thể tan trong nước và
dạng không thể tan trong nước. Dựa vào tính tan của cấu trúc AX có 3 phương pháp
chính thường được sử dụng để tách chiết AX gồm: tách chiết bằng nước, tách chiết
bằng kiềm và tách chiết bằng enzyme.
Khóa 2010 - 2012

10


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

H nh 1.5: Sự phân loại arabinoxylan theo khả năng hòa tan [49]
Phương pháp tách chiết bằng nước dựa trên nguyên tắc: do các AX liên kết
với thành tế bào khá lỏng lẻo, dễ dàng bị phá vỡ vì thế có thể dùng nước để chiết
AX ra khỏi nguyên liệu [39]. Phương pháp có ưu điểm là tương đối đơn giản, dễ
dàng áp dụng để sản xuất AX ở quy mô nhỏ, không bị lẫn protein. Tuy nhiên nhược
điểm là hiệu suất thu hồi kém, không đem lại hiệu quả kinh tế cao khi sản xuất ở
quy mô công nghiệp.
Phương pháp chiết bằng kiềm: Phương pháp này thường được sử dụng để

chiết các AX không thể chiết được bằng nước, do chúng có liên kết chặt chẽ với
thành tế bào, có các tương tác liên kết cộng hóa trị và không cộng hóa trị với các
AX khác hoặc liên kết với các thành phần khác của tế bào như protein, lignin hoặc
cellulose [38]. Rất nhiều các liên kết trong số đó không bền với kiềm, do đó AX có
thể được tách chiết bằng phương pháp sử dụng kiềm như Ba(OH)2, KOH, NaOH,
trong đó Ba(OH)2 được sử dụng phổ biến nhất vì sau khi tách chiết không bị lẫn βglucan như hai loại kiềm còn lại [27, 29]. Phương pháp có ưu điểm là hiệu quả tách
chiết AX cao, tuy nhiên sản phẩm AX sau tách chiết tồn tại trong môi trường kiềm,

Khóa 2010 - 2012

11


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

cần có bước loại bỏ kiềm, nếu loại bỏ không hết có thể gây ảnh hưởng tới hoạt tính
của sản phẩm.
Phương pháp tách chiết bằng enzyme: Ngoài phương pháp tách chiết bằng
kiềm, các AX không thể chiết được bằng nước còn có thể được chiết bằng cách sử
dụng enzyme cắt nhỏ mạch AX, làm giảm khối lượng phân tử AX, tăng khả năng
hòa tan của AX trong nước. Trong các nghiên cứu tìm phương pháp tách chiết AX
bằng enzyme, enzyme 1,4-endoxylanase được sử dụng rất phổ biến. Enzyme này sẽ
cắt ngẫu nhiên liên kết β-1,4-xylan trong các cấu trúc AX mạch dài, giải phóng ra
những phân tử AX tan được trong nước (Hình 1.6) [27, 28].

Hình 1.6: Vị trí hoạt động của endoxylanase [65]
Phương pháp tách chiết bằng enzyme có ưu điểm cho hiệu quả tách chiết
cao, thu hồi được những dạng cấu trúc không chiết được trong nước, sản phẩm thu

hồi an toàn, không gây tác dụng phụ. Tuy vậy, phương pháp này có nhược điểm về
thời gian tách chiết kéo dài, thời gian ủ enzyme có thể lên tới 24 giờ.
1.3.

Các nghiên cứu định tính và định lượng arabinoxylan
Do AX có kích thước và những khác nhau nhất định trong cấu trúc, nên cho

đến nay chưa có nghiên cứu nào chỉ ra được phương pháp định tính và định lượng
AX trực tiếp không thông qua quá trình thủy phân AX thành các đường đơn. Có
nhiều phương pháp thủy phân AX khác nhau như thủy phân bằng acid HCl,
H2SO4… thủy phân bằng enzyme xylanase. Dựa trên sự định tính và định lượng các
Khóa 2010 - 2012

12


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

sản phẩm sau khi thủy phân AX có thể suy ra hàm lượng và khẳng định sự có mặt
của AX có trong mẫu nghiên cứu.
1.3.1. Thủy phân arabinoxylan thành các monosaccharide
Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase: Khung đường xylan của
arabinoxylan có thể được thủy phân bởi nhóm các enzyme có khả năng cắt các liên
kết β-(1→4) glycoside giữa các β-D-Xylp. Điển hình là endo-1,4-β-D-xylanase (EC
3.2.1.8), enzyme này có khả năng cắt ngẫu nhiên giữa khung đường tạo thành hỗn
hợp các oligosaccharide và đường đơn. Sản phẩm oligosaccharide ngắn nhất thu
được sau phản ứng là α-L-Araf-(13)-β-D-Xylp-(14)-D-Xylp (A3X) [7].
Bên cạnh các enzyme endo-1,4-β-D-xylanase còn có các enzyme có khả

năng thủy phân khung đường xylan từ các đầu tận cùng hay còn được gọi là các
exo-1,4-β-D-xylosidase (EC 3.2.1.37). Chúng có tác dụng giải phóng các đơn phân
xylose từ các đầu không khử của XOS, nhưng hiệu quả phản ứng giảm dần theo độ
dài chuỗi XOS và hoạt động của chúng bị ức chế bởi các chuỗi bên α- L-Araf [6].

Hình 1.7: Vị trí hoạt động của endo-1,4-β -D-xylanase trên phân tử arabinoxylan
Thủy phân arabinoxylan bằng các phương pháp khác
Arabinoxylan có thể được thủy phân bằng HCl ở 100oC trong 4 giờ, thủy
hoặc phân bằng acid formic ở 100oC trong 30 phút, kết hợp với thủy phân bằng acid
sulfuric trong 2-4 giờ [18, 35, 57].

Khóa 2010 - 2012

13


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

1.3.2. Phân tích định tính arabinoxylan
Các nghiên cứu về định tính arabinoxylan thường gián tiếp định tính các
đường đơn arabinose và xylose sau khi thủy phân hoàn toàn arabinoxylan.
Kubuta và tập thể [33] đã sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) để
khẳng định sự có mặt của xylose và các oligoxylose và hiệu quả của các phản ứng
thủy phân xylan bằng các enzyme xylanase được tách từ vi khuẩn Aeromonas
caviae, sử dụng hệ dung môi n-butanol : acid axetic : H2O với tỷ lệ 2:1:1, hiện màu
ở 100oC bằng dung dịch acid sulfuric có 99,5% ethanol với tỷ lệ 1:1. Đây là một
phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và cho các kết quả trực quan, dễ quan sát. Hiện
nay, phương pháp này vẫn được sử dụng trong các nghiên cứu định tính xylan và

arbinoxylan như trong các nghiên cứu của Rantanen và tập thể [45], Pastell và tập
thể [42], Garófalo và tập thể [26] đã thủy phân AX trong bột mì thành các
monosaccharide và được chạy sắc ký bản mỏng với hệ dung môi MeOH : CHCl3 :
C3H6O : NH4OH với tỷ lệ 42:17:25:17 và hiện màu bằng dung dịch orcinol 0,2% và
EtOH : H2SO4 tỷ lệ 90:10 ở 110oC trong 2 phút. Tỷ lệ arabinose/xylose được xác
định bằng phương pháp sắc ký khí sau khi AX được thủy thân và được chuyển
thành alditol acetate.
Một số tác giả khác đã và đang nghiên cứu nhằm tạo ra kháng thể đa dòng
nhận biết liên kết β (1→4) xylan và kháng thể đơn dòng nhận biết các vị trí khác
trên mạch xylan được thay thế bởi phân tử arabinose [40].
1.3.3. Phân tích định lượng arabinoxylan
Hiện nay có một số phương pháp khác nhau để định lượng AX, chủ yếu
gồm phương pháp so màu, phương pháp sắc ký và một vài phương pháp khác.
Hàm lượng pentosan trong bột mì được định lượng bằng các phương pháp so
màu sử dụng orcinol-HCl [26] hoặc phloroglucinol [20, 48]. Mẫu được thủy phân
với HCl ở 100oC, sau đó được trung hòa bằng natri carbonate, sau cùng là xử lý với
nấm men để loại bỏ các đường có thể lên men. Dịch nổi được trộn với sắt chlorua

Khóa 2010 - 2012

14


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

và orcinol, sau đó được ủ trong bể nước sôi, được xử lý và đo độ hấp thụ ở bước
sóng 670 nm [56] hoặc được phân tích bằng phương pháp orcinol-HCl [26].
Phương pháp của Douglas [20] cho phép định lượng tương đối tỷ lệ phần

trăm về khối lượng của các đường pentosan trong một mẫu phân tích. Phương pháp
được tiến hành dựa trên nguyên tắc: các đường pentosan được chiết ra khỏi mẫu
phân tích bằng các acid như HCl sau đó được nhuộm màu bằng phloroglucinol. Tỷ
lệ phần trăm của pentosan được xác định bằng hiệu độ hấp thụ của mẫu ở bước
sóng 552 nm và độ hấp thụ ở bước sóng 510 nm sau khi được thủy phân và đối
chiếu với giá trị đo được đối với đường chuẩn D-xylose. Đây là phương pháp được
sử dụng tương đối phổ biến với ưu điểm đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi phí.
Hiện nay một số hệ thống bán tự động đã được phát triển dựa trên phương pháp này
với ưu điểm có thể điều khiển tự động các thành phần của phản ứng và phân tích kết
quả trên máy tính điện tử [48]. Ngoài ra các đường pentose có thể được nhuộm màu
bằng orcinol 1% pha trong cồn tuyệt đối thay thế cho phloroglucinol. Kết quả được
xác định bằng hiệu chỉ số hấp thụ ở bước sóng 670 nm và độ hấp thụ ở bước sóng
580 nm rồi so sánh với giá trị đo được đối với đường chuẩn xylose [21, 26, 43]. Cải
tiến phương pháp của Douglas để có thể định lượng được cả AX tổng số và AX
không hòa tan, Finnie và tập thể [23] đã hòa tan mẫu vào nước, mẫu sau đó được
vortex, dịch nổi được sử dụng để định lượng AX tổng số, phần mẫu còn lại được
chiết nhiều lần để thu AX không tan. Các mẫu sau đó sẽ được định lượng theo
phương pháp của Douglas.
Phương pháp sắc ký khí dựa trên sự thủy phân và khử nước của các đường
pentosan tạo thành furfurl và được chiết với dibutylether [25]. Các đường pentose
đã thủy phân có thể được chuyển hóa thành alditol acetate [22] hoặc được chuyển
thành trimethylsilyl ester [8] và sau đó được định lượng nhờ bộ phận phát hiện của
máy [56]. Revanappa và tập thể đã thủy phân AX, sau đó xử lý với acid
trifluoroacetic 2N [58] hoặc bằng methanolysis [54] và được cho qua cột sắc ký khí
HP-5 (Agilent Technologies) trong điều kiện thay đổi nhiệt độ theo chu trình
150oC-5 phút; 260oC-2 phút trong 60 phút. Sắc ký khí có thể dùng để định tính và
Khóa 2010 - 2012

15

Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

định lượng các đường bằng cách so sánh thời gian lưu giữ của các mẫu với các
đường chuẩn được pha với nồng độ nhất định.
Phương pháp sắc ký trao đổi ion kết hợp với sự phát hiện các ion trong dung
dịch xung đẩy (IEC-PAD: Ion Exchange Chromatography – Pulsed Amperometric
Detection): trong phương pháp này, các polysaccharide được thủy phân hoàn toàn
thành xylose, arabinose, galactose, sau đó được phân tích bằng sắc ký trao đổi ion
sử dụng cột Carbopac 1 (Dionex Corp.) với pha động là NaOH 1 mM và bộ phận
phát hiện xung đẩy. Sự ảnh hưởng của glucose được loại bỏ bằng cách chuyển
glucose thành acid gluconic nhờ enzyme glucose oxidase. Tuy vậy, để loại bỏ acid
gluconic, cột sắc ký phải được rửa kỹ với NaOH 500 mM trước khi được cân bằng
với NaOH 1 mM. Để duy trì sự phát hiện với độ nhạy cao, dòng chảy qua cột cần
được trộn với NaOH 250 mM trước khi cho qua bộ phận phát hiện hóa điện tử. Các
tác giả đã thực hiện một số cải tiến so với phương pháp của Houben: pha động sử
dụng NaOH 15 mM có thể nâng cao độ nhạy của detector, cho phép định lượng
chính xác mà không cần bổ sung thêm NaOH; xylose và galactose có khả năng hòa
tan tốt khi glucose ở nồng độ cao mà không cần loại bỏ enzyme glucose oxidase,
hơn nữa có thể tránh được giai đoạn rửa cột với gradient nồng độ NaOH 500 mM
[56].
Các phương pháp định lượng trên có một số nhược điểm, do trong cấu trúc tự
nhiên của các pentosan không có chứa các nhóm mang màu, vì thế rất khó để phát
hiện và định lượng được ở nồng độ thấp nếu sử dụng các hệ thống phát hiện bình
thường. Hầu hết các cột HPLC pha đảo đều không lưu giữ và phân tích pentose một
cách đầy đủ, vì thế để duy trì sự phân tích giữa glucose, xylose và giữa glucose,
galactose, cần phải điều chỉnh nồng độ NaOH thích hợp. Tuy vậy, sử dụng phương
pháp IEC-PAD rất lý tưởng để định lượng các pentosan trong bột mì do có ưu điểm

là độ nhạy cao, không cần phải chuyển hóa chất phân tích thành các chất khác, kết
quả phân tích thành phần cụ thể, rõ ràng. Trong khi với phương pháp so màu, kết
quả dễ bị ảnh hưởng bởi các chất như glucose, không cho được kết quả cụ thể thành

Khóa 2010 - 2012

16


Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Ngô Thị Huyền Trang

phần các đường đơn, còn phương pháp sắc ký khí lại có độ nhạy không cao, cần
thiết phải chuyển hóa chất phân tích thành chất trung gian khác [56].
Ngoài ra, để phân tích các đường mono, oligo là sản phẩm của các phản ứng
thủy phân AX có thể sử dụng các phương pháp sắc ký khác như sắc ký lỏng cao áp.
Trong nghiên cứu của Bataillon và tập thể [5], đường đơn xylose, arabinose và
glucose trong mẫu AX sau khi được thủy phân được chạy qua cột sắc ký Biorad
Aminex column HPX-87H, rửa chiết bằng acid sulfuric 5 mM. Zheng và tập thể
[58] đã định tính và định lượng các monosaccharide cấu tạo nên AX bằng pháp sắc
ký trao đổi ion cao áp (HPAEC), hàm lượng đường không phải cellulose được xác
định bằng tổng hàm lượng các monosaccharide đo được với hệ số nghịch đảo của
pentose (0,88) hoặc hexose (0,9) so với hàm lượng polymer. Khi đó hàm lượng AX
được tính theo công thức 0,88 x (% arabinose + % xylose). Khối lượng phân tử của
AX được xác định bằng sắc ký lọc rây phân tử cao áp (HPSEC). Cerning và tập thể
[11] đã định lượng pentosan tổng số trong ngũ cốc và các sản phẩm ngũ cốc.
Pentosan được chuyển thành furfural bằng cách sử dụng HCl 4,15 N và được phân
tách bằng chưng cất hơi nước. Phương pháp này có ưu điểm: thủy phân hoàn toàn
pentosan thành pentose và sau đó được chuyển thành furfural, sự chưng cất diễn ra

không cần sử dụng trực tiếp nhiệt của môi trường phản ứng. Phản ứng định lượng
furfural được thực hiện dựa trên phản ứng màu của aniline acetate và được đo ở
bước sóng 530 nm. Nhược điểm của phương pháp là tính kém bền của phức màu
aniline furfural nếu không sử dung dung dịch đệm thích hợp để làm bền màu của
phản ứng. Ngoài ra furfural có thể được định lượng khi có mặt lượng lớn hydroxy
methyl furfural (HMF). Acid uronic và glucuronic không ảnh hưởng đến 10% nồng
độ pentosan tổng số. Englyst và Cummings [21] đã thủy phân polysaccharide bằng
acid sulfuric 2N ở 100oC trong 2 giờ. Các đường đơn sau đó được chuyển thành
aldidol acetate và được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí lỏng. Hàm lượng
AX được tính bằng tổng arabinose và xylose, trong đó arabinose được thủy phân từ
arabinogalactan

Khóa 2010 - 2012

được

ước

lượng

từ

hàm

17

lượng

galactose

với

tỷ

lệ