Biểu hiện gen mã hoá kháng thể kháng CD20 và thử nghiệm để phát hiện CD20 trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thu Thùy

BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ
KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN
CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN
UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thu Thùy

BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ
KHÁNG CD20 VÀ THỬ NGHIỆM ĐỂ PHÁT HIỆN
CD20 TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN
UNG THƢ LYMPHO KHÔNG HODGKIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số:
62 42 01 21

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Trần Minh Đạo
2. PGS. TS. Lê Quang Huấn

Hà Nội – 2014



Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,
đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS. TS. Trần Minh Đạo và
PGS. TS. Lê Quang Huấn.
Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Hà Nội, ngày

tháng

Nghiên cứu sinh
Phạm Thu Thùy

i

năm 2014


Lời cảm ơn
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS. TS.
Trần Minh Đạo – Giám đốc bệnh viện 198 – Bộ Công an và PGS. TS. Lê Quang
Huấn – Trƣởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học –

Viện Khoa học Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để
hoàn thành luận án tiến sĩ.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.T.S. Nguyễn Thị Hồng Vân – Trƣởng bộ
môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học –
Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ bảo tận tình
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới T.S. Lã Thị Huyền, các cô chú, anh chị và
các bạn công tác tại phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học
– Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa
Vi sinh – Bệnh viện 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa giải phẫu bệnh – Học viện quân y, Trung
tâm Ung bƣớu - Bệnh viện 198 và Viện chăn nuôi đã cung cấp mẫu thí nghiệm cho
tôi.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những ngƣời thân,
bạn bè đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2014
Nghiên cứu sinh
Phạm Thu Thùy

ii


Mục lục
Trang phụ bìa
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

vii

Danh mục các bảng, biểu

ix

Danh mục các hình

x

MỞ ĐẦU

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1.

UNG THƢ MÁU

3

1.1.1.

Đại cƣơng ung thƣ máu

3

1.1.2.

Tình hình ung thƣ máu trên thế giới và Việt Nam

5

1.1.3.

Các phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị ung thƣ máu

7

1.1.4.

Bệnh

8

ung

thƣ

lympho

không

Hodgkin

(Non-Hodgkin

lymphoma)
1.2.

KHÁNG NGUYÊN CD20

11

1.2.1.

Cấu trúc gen và protein CD20

11

1.2.2.

Chức năng của CD20 trong cơ thể

12

1.2.3.

Kháng nguyên CD20 – mục tiêu phân tử trong điều trị ung thƣ
và ung thƣ máu

14

1.2.4.

Tình hình nghiên cứu kháng nguyên CD20 tái tổ hợp

16

1.3.

KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (mAb), KHÁNG THỂ SCFV VÀ

17

KHÁNG THỂ PHAGE-SCFV
1.3.1.

Kháng thể

17

1.3.2.

Kháng thể đơn dòng (mAb)

18

1.3.3.

Kháng thể đơn chuỗi (kháng thể scFv)

20

1.3.4.

Kháng thể phage-scFv

22

1.3.5.

Ứng dụng mAb trong chẩn đoán bệnh ung thƣ máu

25

1.3.6.

Tình hình nghiên cứu và sản xuất mAb đặc hiệu kháng nguyên

iii


CD trên thế giới

27

1.4.

KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CD20

28

1.4.1.

Cơ chế hoạt động của kháng thể đặc hiệu CD20

28

1.4.2.

Một số mAb đặc hiệu CD20 đang đƣợc sử dụng trong điều trị

32

1.4.3.

Tình hình nghiên cứu mAb đặc hiệu CD20 hiện nay

36

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

39

2.1.

VẬT LIỆU

39

2.1.1.

Sinh phẩm

39

2.1.2.

Mồi

39

2.1.3.

Hóa chất và trang thiết bị

40

2.2.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

41

2.2.1.

Các phƣơng pháp thao tác với DNA VÀ RNA

41

2.2.1.1.

Tách chiết RNA từ máu của bệnh nhân và tủy gà đã gây miễn

42

dịch
2.2.1.2.

RT-PCR nhân bản gen mã hóa kháng nguyên CD20 và kháng

42

thể scFv đặc hiệu CD20
2.2.1.3.

Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1

43

2.2.1.4.

Biến nạp plasmid vào tế bào E. coli

44

2.2.1.5.

Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli

45

2.2.1.6.

Tạo vector tái tổ hợp chứa đoạn gen CD20

45

2.2.1.7.

Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2

46

2.2.1.8.

Điện di gel agarose

46

2.2.1.9.

Thu đoạn DNA từ gel agarose

47

2.2.1.10.

Tinh sạch DNA và cắt, gắn DNA

47

2.2.1.11.

Phƣơng pháp nhân gen bằng PCR

48

2.2.1.12.

Xác định trình tự nucleotide

49

2.2.2.

Các phƣơng pháp thao tác với protein tái tổ hợp

49

2.2.2.1.

Biểu hiện gen trong tế bào E. coli

49

2.2.2.2.

Tinh sạch protein tái tổ hợp

50

2.2.2.3.

Điện di protein

51

2.2.3.

Kĩ thuật Western blot và Dot blot

51

iv


2.2.4.

Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20

52

2.2.5.

Kĩ thuật phage display

53

2.2.5.1.

Tạo kháng thể phage-scFv từ thƣ viện Griffin.1

53

2.2.5.2.

Sàng lọc kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên đích

53

2.2.6.

ELISA

54

2.2.7.

Xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với CD20

54

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

57

3.1.

TẠO KHÁNG NGUYÊN CD20 TÁI TỔ HỢP

57

3.1.1.

Tách chiết RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thƣ lympho
không Hodgkin

57

3.1.2.

Nhân bản các gen mã hoá CD20

58

3.1.3.

Tách dòng gen mã hoá CD20

58

3.1.4.

Xác định trình tự gen mã hóa CD20

59

3.1.5.

Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên CD20

60

3.1.6.

Biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của CD20

61

3.2.

KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH GÀ BẰNG CD20 TẠO RA

64

3.3.

THU NHẬN GEN MÃ HÓA scFv KHÁNG CD20 TỪ GÀ

65

3.3.1.

Tạo gen tái tổ hợp mã hóa cho scFv từ gà gây miễn dịch

65

3.3.2.

Tạo phage biểu lộ scFv và sàng lọc các scFv có khả năng gắn
đặc hiệu với kháng nguyên đích

68

3.4.

TẠO KHÁNG THỂ scFv KHÁNG CD20

69

3.4.1.

Tách dòng gen antiCD20 mã hóa scFv

69

3.4.2.

Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+)/antiCD20

69

3.4.3.

Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv

71

3.4.4.

Tinh sạch kháng thể scFv đặc hiệu CD20

76

3.4.5.

Khả năng liên kết của scFv với kháng thể cộng hợp

78

3.4.6.

Độ ổn định của scFv tinh sạch

79

3.5.

TẠO KHÁNG THỂ scFv-CH2 KHÁNG CD20

81

3.5.1.

Tách dòng gen antiCD20Fa mã hóa scFv-CH2

81

3.5.2.

Sàng lọc hệ vector biểu hiện scFv-CH2

82

3.5.2.1.

Nhân dòng các vector biểu hiện scFv-CH2

82

v


3.5.2.2.

Biểu hiện kháng thể scFv-CH2 trong hệ vector

83

3.5.2.3.

Chọn vector biểu hiện scFv-CH2

84

3.5.3.

Tối ƣu một số điều kiện biểu hiện scFv-CH2

85

3.5.4.

Tinh sạch kháng thể scFv-CH2

88

3.5.5.

Độ ổn định của scFv-CH2 tinh sạch

91

3.5.6.

Khả năng liên kết của scFv-CH2 với CD20

91

3.6.

THỬ NGHIỆM scFv-CH2 PHÁT HIỆN CD20 TRONG

93

HUYẾT THANH BỆNH NHÂN NHL
3.6.1.

Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot

93

3.6.2.

Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bằng ELISA

95

3.6.2.1.

Lựa chọn độ pha loãng huyết thanh

95

3.6.2.2.

Thử nghiệm scFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh
96

nhân bằng ELISA
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

100

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ

101

TÀI LIỆU THAM KHẢO

102

PHỤ LỤC

vi


Danh mục các kí hiệu, các từ viết tắt
ADCC

Antibody dependent cellular

Gây độc tế bào phụ thuộc

cytotoxicity

kháng thể

ADC

Antibody drug conjugate

Kháng thể mang thuốc

AIDS

acquired immune deficiency

Hội chứng suy giảm miễn dịch

syndrome

mắc phải

ALL

Acute Lymphocytic Leukemia

Ung thƣ tế bào lympho cấp tính

AML

Acute Myelogenous

Ung thƣ bạch cầu dòng tủy cấp

Leukemia

tính

CD

Cluster of differenciation

Cụm biệt hóa

CDC

Complement dependent

Gây độc tế bào phụ thuộc bổ

cytotoxicity

thể

Complementary

ADN bổ sung

cDNA

Deoxyribonucleic acid
CDR

Complementarity determining

Vùng quyết định bổ trợ

region
CLL

Chronic Lymphocytic

Ung thƣ tế bào lympho mạn

Leukemia

tính

Chronic Myelogenous

Ung thƣ bạch cầu dòng tủy

Leukemia

mạn tính

CR

Complete remission

Đáp ứng hoàn toàn

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleoside

CML

triphosphate
ELISA
FDA
HAMA

Enzyme-Linked

Kỹ thuật miễn dịch liên kết

ImmunoSorbent Assay

enzyme

Food and Drug

Cục Quản lý thuốc và thực

Administration

phẩm

Human against mouse allergic

Hiện tƣợng mAb có nguồn gốc

vii

từ chuột khi tiêm vào cơ thể do
không tƣơng hợp với hệ miễn
dịch của ngƣời, khiến cơ thể
sinh ra kháng thể chống lại nó
HBV

Hepatitis B virus

Virut viêm gan B

HL

Hodgkin’s lymphoma

U lympho Hodgkin

IFN

Interferon

IPTG

Isopropyl β-D-thiogalactoside

Chất cảm ứng IPTG

IARC

International Agency for

Tổ chức Nghiên cứu ung thƣ

Research on Cancer

Quốc tế

KT

Kháng thể

mAb

Monoclonal antibody

Kháng thể đơn dòng

NHL

non-Hodgkin’s lymphoma

Ung thƣ lympho không
Hodgkin

NK cell

Nature killer cell

Tế bào giết chết tự nhiên

ORR

Overall response rate

Tỉ lệ phản ứng tổng thể

PCD

Programmed cell death

Tế bào chết theo chƣơng trình

PBS

Phosphate buffered saline

PR

Partial remission

Đáp ứng một phần

PVDF

Polyvinylidene fluoride

Màng PVDF

RA

Rheumatoid arthritis

Viêm kh ớp dạng thấp

RNA

Ribonucleic acid

ARN

RT-PCR

Reverse transcription

Phản ứng chuỗi phiên mã

Polymerase chain Reaction

ngƣợc

Single-chain variable

Đoạn biến thể đơn chuỗi

scFv

fragment
TBS

Tris-buffered saline

TMB

Tetramethylbenizidine

TTBS

Tween-20- Tris-buffered
saline

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

viii


Danh mục các bảng
Bảng 1.1.

Phân loại NHL theo WHO - 2008

8

Bảng 1.2.

Phân loại NHL trong điều trị (Working Formulation -

9

1982)
Bảng 1.3

Một số mAb kháng CD20 đã đƣợc phê chuẩn và dùng

37

trong điều trị
Bảng 2.1.

Trình tự các mồi sử dụng để tạo thƣ viện kháng thể scFv

39

từ gà gây miễn dịch
Bảng 2.2.

Trình tự các cặp mồi sử dụng để tách dòng gen mã hóa

40

scFv từ gà
Bảng 2.3.

Thành phần phản ứng RT-PCR

43

Bảng 2.4.

Thành phần phản ứng gắn (ligase)

44

Bảng 2.5.

Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn

48

Bảng 2.6.

Thành phần phản ứng gắn DNA

48

Bảng 2.7.

Thành phần phản ứng PCR

49

Bảng 3.1.

Mức độ đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau khi

64

gây miễn dịch lần thứ 3

Bảng 3.2.

Kết quả sàng lọc chọn dòng phage biểu lộ kháng thể scFv

68

đặc hiệu kháng nguyên CD20
Bảng 3.3.

Kết quả ELISA xác định hoạt tính của scFv-CH2 và so
sánh với kháng thể chuẩn

ix

97


Danh mục các hình
Hình 1.1.

Trƣờng hợp mắc mới các bệnh ung thƣ máu ở Mĩ năm 2011

6

và 2013
Hình 1.2.

CD20 biểu hiện trên màng tế bào B

12

Hình 1.3.

Tiến trình biểu hiện của CD20

13

Hình 1.4.

Sự chuyển vị trí của CD20 vào “mảng” lipid sau khi gắn
kháng thể

13

Hình 1.5.

Sơ đồ cấu tạo của kháng thể

18

Hình 1.6.

Sự biệt hóa và sinh kháng thể của lympho B

19

Hình 1.7.

Sơ đồ cấu tạo của mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv)

20

Hình 1.8.

Một số cấu trúc gắn đặc hiệu kháng nguyên

21

Hình 1.9.

Cấu trúc của phage mang gen mã hóa scFv

24

Hình 1.10.

Cơ chế hoạt động của rituximab đối với sự suy giảm của tế

29

bào B
Hình 2.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính của scFv-CH2

55

Hình 3.1.

Ảnh điện di tách RNA tổng số từ bệnh phẩm

57

Hình 3.2.

Ảnh điện di nhân bản gen mã hoá cho CD20

58

Hình 3.3.

Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn

59

NdeI và XhoI
Hình 3.4.

Ảnh điện di sản phẩm cắt và tinh sạch gen CD20, vector

60

pET21a(+)
Hình 3.5.

Ảnh điện di plasmid và sản phẩm vector pET-21a(+) mang

61

CD20

Hình 3.6.

Ảnh điện di kháng nguyên CD20 trong E. coli BL21

62

Hình 3.7.

Tinh sạch protein tái tổ hợp (kháng nguyên CD20) bằng cột

62

sắc kí ái lực Ni2+
Hình 3.8.

Kết quả Western blot của kháng nguyên CD20 với kháng thể
thƣơng mại

x

63


Hình 3.9.

Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau

65

khi gây miễn dịch lần 4 (trƣớc khi lấy tủy xƣơng và lách)

Hình 3.10.

Ảnh điện di RNA tổng số từ tủy xƣơng gà đã gây miễn dịch

66

với kháng nguyên CD20
Hình 3.11.

Ảnh điện di sản phẩm RT-PCR

66

Hình 3.12.

Sơ đồ tạo gen mã hóa scFv

67

Hình 3.13.

Ảnh điện di gen mã hóa kháng thể scFv

67

Hình 3.14.

Ảnh điện di sản phẩm PCR gen antiCD20

69

Hình 3.15.

Ảnh điện di pET22b(+) và gen antiCD20

70

Hình 3.16.

Ảnh điện di biểu hiện gen antiCD20 ở E. coli BL21

71

Hình 3.17.

Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv theo nồng độ IPTG

72

Hình 3.18.

Ảnh điện di protein tái tổ hợp (scFv) theo thời gian

73

Hình 3.19.

Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv ở các nhiệt độ khác nhau

74

Hình 3.20.

Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv theo mật độ tế bào

75

Hình 3.21.

Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv ở một số điều kiện tối ƣu

75

Hình 3.22.

Ảnh điện di mức độ hòa tan của kháng thể scFv tái tổ hợp

76

Hình 3.23.

Ảnh điện di kháng thể scFv tái tổ hợp tinh sạch biến tính (B)
và không biến tính (A)

77

Hình 3.24.

Nồng độ imidazol thu kháng thể scFv khi tinh sạch

78

Hình 3.25.

Hình ảnh Dot blot của kháng thể scFv đặc hiệu CD20

78

Hình 3.26.

Hình ảnh Western blot của kháng thể scFv đặc hiệu CD20

79

Hình 3.27.

Biểu đồ xác định hàm lƣợng kháng thể scFv bảo quản ở các

Hình 3.28.

thời gian và nhiệt độ khác nhau

80

Ảnh điện di sản phẩm PCR gen mã hóa CH2 và kháng thể scFv

81

(A) và nối gen mã hóa scFv và CH2 (B)
Hình 3.29.

Ảnh điện di sản phẩm PCR gen antiCD20Fa gắn vào các
vector biểu hiện

83

Hình 3.30.

Ảnh điện di biểu hiện gen mã hóa scFv-CH2 trong 3 vector

83

Hình 3.31.

Hình ảnh Western blot của kháng thể scFv-CH2 ở 3 vector

84

xi


biểu hiện
Hình 3.32.

Ảnh hƣởng của IPTG đến mức độ biểu hiện của scFv-CH2

86

Hình 3.33.

Ảnh điện di mức độ biểu hiện của scFv-CH2 theo nhiệt độ

86

Hình 3.34.

Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv-CH2 theo mật độ vi khuẩn

87

Hình 3.35.

Ảnh điện di mức độ biểu hiện scFv-CH2 theo thời gian

88

Hình 3.36.

Ảnh điện di độ hòa tan của scFv-CH2

89

Hình 3.37.

Ảnh điện di scFv-CH2 tinh sạch ở nồng độ imidazol trên cột

90

Ni+
Hình 3.38.

Ảnh điện di scFv-CH2 tinh sạch

Hình 3.39.

Hàm lƣợng scFv-CH2 bảo quản ở nhiệt độ và thời gian khác
nhau

Hình 3.40.

90
91

Hình ảnh các tế bào lympho B và kết quả ELISA xác định khả
năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với CD20

92

Hình 3.41.

Kháng nguyên CD20 trong huyết thanh bệnh nhân NHL

94

Hình 3.42.

Kết quả Western blot với huyết thanh bệnh nhân NHL

95

Hình 3.43.

Biểu đồ kết quả ELISA xác định độ pha loãng của huyết thanh

96

bệnh nhân NHL

Hình 3.44.

Biểu đồ kết quả ELISA so sánh hoạt tính liên kết của scFvCH2 với kháng thể chuẩn ở các bệnh nhân NHL

xii

98


MỞ ĐẦU
Ung thƣ máu là một trong 10 loại ung thƣ phổ biến trên thế giới. Ung thƣ máu
đƣợc chia thành 3 loại chính: lymphoma (u lympho), leukemia và myeloma. Theo
thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thƣ quốc tế (IARC) ở Mĩ năm 2011, 2013
lymphoma chiếm tỉ lệ cao nhất (54%-2011, 51%-2014), tiếp đến là leukemia (31%2011, 33%-2013) và thấp nhất là myeloma (15%-2011, 15%-2013) trong các loại
ung thƣ máu. Ung thƣ lympho không Hodgkin (NHL) là một trong 2 loại của
lymphoma và là loại ung thƣ đứng thứ 5 trên thế giới [51].
Ở Mĩ, hàng năm có hơn 66.000 trƣờng hợp mắc mới và gần 20.000 ngƣời chết
do bệnh ung thƣ lympho không Hodgkin [49]. Trong số các bệnh nhân ung thƣ
lympho không Hodgkin, 85% ngƣời mắc bệnh có nguồn gốc từ tế bào lympho B và
biểu hiện các chỉ thị kháng nguyên bề mặt tế bào B. CD20 là chỉ thị phân tử biểu
hiện chủ yếu trên tế bào B và xuất hiện khoảng 85 – 90% ở bệnh nhân NHL [52],
[79], [82]. CD20 không biểu hiện trong các tế bào gốc tạo máu, không dễ dàng bị

đồng hóa và không bị tách rời khi gắn với kháng thể đánh dấu phóng xạ nên CD20
là một đích hấp dẫn cho liệu pháp điều trị hƣớng đích hay còn gọi là liệu pháp
kháng thể đơn dòng (mAb) [37], [43].
Hiện nay có khoảng 28 mAb đƣợc Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Mĩ (FDA)
phê chuẩn dùng trong điều trị ung thƣ [80], [82]. Trong đó, có 5 mAb đặc hiệu
kháng nguyên CD20 đƣợc FDA phê chuẩn điều trị ung thƣ máu. Tuy nhiên, 4 mAb
đặc hiệu kháng nguyên CD20 (Rituximab, Y90- Ibritumomab,

131

I-Tositumomab,

Ofatumumab) có nguồn gốc từ chuột nên khi điều trị có nguy cơ bị hiện tƣợng
HAMA và 1 kháng thể Obinutuzumab có nguồn gốc từ ngƣời đƣợc FDA phê chuẩn
tháng 11 năm 2013 [78] và ở Việt Nam cũng mới dừng lại ở việc ứng dụng các
kháng thể này trong chẩn đoán và điều trị bệnh.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và góp phần vào việc nghiên cứu tạo kháng
thể mới hiệu quả trong chẩn đoán và điều trị ung thƣ máu dạng ung thƣ lympho
không Hodgkin, chúng tôi thực hiện đề tài: “Biểu hiện gen mã hoá kháng thể

1


kháng CD20 và thử nghiệm để phát hiện CD20 trong huyết thanh của bệnh nhân
ung thư lympho không Hodgkin”.
Mục tiêu của luận án
1. Tạo đƣợc kháng thể dạng đơn chuỗi (scFv-CH2) có khả năng nhận biết, gắn
kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20.
2. Thử nghiệm kháng thể tạo ra (scFv-CH2) phát hiện CD20 trong huyết thanh
bệnh nhân ung thƣ lympho không Hodgkin.

Nội dung đề tài
1. Tạo kháng nguyên CD20 tái tổ hợp
2. Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CD20 tạo ra
3. Thu nhận gen mã hóa kháng thể scFv từ gà gây miễn dịch
4. Tạo kháng thể scFv kháng CD20
5. Tạo kháng thể scFv-CH2 kháng CD20
6. Thử nghiệm kháng thể scFv-CH2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh
nhân ung thƣ lympho không Hodgkin.
Ý nghĩa của luận án
 Lí luận: Góp phần hoàn thiện qui trình tạo kháng thể tái tổ hợp, kháng thể đơn
chuỗi đặc hiệu kháng nguyên CD20 bằng công nghệ gen ở Việt Nam.
 Thực tiễn: Sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để tạo ra kháng thể scFv, scFvCH2 đặc hiệu CD20 có thể sử dụng trong chẩn đoán bệnh NHL.
Đóng góp mới của luận án
1. Kháng thể đơn chuỗi dạng scFv, scFv-CH2 và kháng nguyên CD20 đƣợc tạo ra
bằng công nghệ gen.
2. Kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với kháng nguyên CD20.

2


3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

UNG THƢ MÁU

1.1.1. Đại cƣơng ung thƣ máu
Ung thƣ máu là sự tăng sinh các tế bào máu một cách không bình thƣờng, các

tế bào này thƣờng là các tế bào bạch cầu và các tế bào tạo thành các tế bào máu.
Ung thƣ máu có thể ảnh hƣởng đến tủy xƣơng, các tế bào máu, hạch bạch huyết và
các phần khác của hệ thống bạch huyết. Nguyên nhân thực sự của ung thƣ máu hiện
vẫn chƣa biết rõ nhƣng các nhà khoa học xác định đƣợc rằng khi cơ thể nhiễm các
virus (HBV, HIV) hoặc rối loạn trong quá trình phát triển của các tế bào thuộc hệ
lympho đều dẫn tới các bệnh ung thƣ máu. Các nhà khoa học đang cố gắng xác định
khi nào và tại sao cơ thể bắt đầu tạo ra các tế bào bất thƣờng, và khi nào các tế bào
này bắt đầu xâm nhập vào hệ thống máu. Ở một chừng mực nào đó, những câu hỏi
này đã đƣợc trả lời. Các thông tin đã đƣợc sử dụng để cải thiện các ứng dụng phòng
và chữa trị bệnh ung thƣ máu.
Phân loại ung thƣ máu
Dựa trên cơ sở nhóm bệnh và cơ chế sinh bệnh các nhà khoa học chia ung thƣ
máu thành 3 nhóm lớn: Leukemia, myeloma và lymphoma [68].
Leukemia, lymphoma và myeloma đều có một số đặc điểm chung và những
điểm khác biệt, chúng đại diện cho một số lƣợng lớn các bệnh về máu. Các bệnh
ung thƣ máu khác nhau về nguyên nhân, về mức độ phân tử và sự tiến triển tự nhiên
của mỗi bệnh. Trong thập kỷ vừa qua, cuộc cách mạng trong lĩnh vực sinh học phân
tử cùng hàng loạt kinh nghiệm, phƣơng pháp và thiết bị hiện đại giúp quá trình sàng
lọc phân loại các bệnh ung thƣ máu thuận lợi và chính xác hơn. Có sự khác biệt về
mặt phân tử giữa tế bào bình thƣờng với tế bào ung thƣ và sự khác biệt rõ ràng giữa
các tế bào của các loại ung thƣ khác nhau.
 Leukemia (bệnh bạch cầu)
Leukemia là dạng ung thƣ các tế bào máu, thƣờng là các tế bào bạch cầu.
Các tế bào leukemia nhìn khác biệt so với các tế bào thông thƣờng và không có khả

3


năng thực hiện chức năng của mình. Ung thƣ có thể xảy ra hoặc trong các tế bào
bạch cầu trong hệ lympho hoặc trong các tế bào tủy. Khi ung thƣ phát triển ở các tế

bào lympho thì ngƣời ta gọi là lymphocytic leukemia, khi ung thƣ phát triển ở các tế
bào hạt hoặc tế bào đơn nhân thì ngƣời ta gọi là myelogenous leukemia.
Mỗi loại leukemia trên lại gồm có hai dạng: cấp tính và mạn tính [9]. Dạng
ung thƣ máu cấp tính là tình trạng bệnh lí cấp tính của tế bào sinh máu non - tế bào
chƣa chín, tủy xƣơng có trên 30% tế bào non trong tổng số tế bào có nhân, chúng
đƣợc chia hai nhóm chính: Ung thƣ tế bào lympho cấp và ung thƣ dòng tuỷ cấp.
Còn dạng leukemia mạn tính là một nhóm bệnh tăng sinh tủy đơn dòng hay nhiều tế
bào sinh máu trong tủy hoặc tăng tạo máu các cơ quan ngoài tủy (lách và gan). Các
tế bào này sinh trƣởng chậm và số lƣợng tăng cũng chậm do đó bệnh tiến triển từ
từ.
Theo theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thƣ quốc tế năm 2011 ở Mĩ
có 274930 ngƣời mắc các bệnh Leukemia [49], tỉ lệ mỗi loại là:
-

Ung thƣ tế bào lympho cấp (Acute lymphocytic leukemia-ALL): 13%

-

Ung thƣ tế bào lympho mạn tính (Chronic lymphocytic leukemia-CLL): 33%

-

Ung thƣ dòng tuỷ cấp (Acute myelogenous leukemia-AML): 29%

-

Ung thƣ dòng tuỷ mạn tính (Chronic myelogenous leukemia-CML): 12%

-

Các dạng ung thƣ leukemia khác: 14%

 Myeloma (u tủy)
Là bệnh ung thƣ tƣơng bào (plasma cells - cơ quan chịu trách nhiệm sản xuất
kháng thể), thuộc tủy xƣơng với sự có mặt của tổn thƣơng xƣơng, tăng tƣơng bào
non, xuất hiện protein đơn dòng trong huyết tƣơng và nƣớc tiểu, đau xƣơng, tăng
Ca++ máu và thiếu máu [9].
Nguyên nhân của bệnh hiện chƣa đƣợc làm rõ, nhƣng chúng thƣờng có các
triệu chứng sau: đau xƣơng, xuất hiện vết nứt trong xƣơng, ốm yếu, mệt mỏi, giảm
cân, có vấn đề trong hệ tiêu hóa, đau hoặc tê cóng chân. Các triệu chứng này của u
tủy thƣờng khá giống so với các triệu chứng bệnh khác về xƣơng nên để xác định rõ
ràng cần phải có các xét nghiệm lâm sàng cụ thể.

4


Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới năm 2001 tỉ lệ mắc bệnh nam/nữ là
1:1 [68]. Theo Tổ chức Nghiên cứu ung thƣ quốc tế năm 2011 ở Mĩ có 74.814
ngƣời mắc bệnh myeloma, trong đó có 20.520 trƣờng hợp mắc mới (11.400 nam
và 9.120 nữ) [49].
 Lymphoma (u lympho/u bạch huyết)
“Lymphoma” là thuật ngữ chung cho nhiều loại ung thƣ máu có nguồn gốc
từ hệ bạch huyết. Lymphoma là kết quả khi một loại tế bào bạch cầu trải qua sự
thay đổi ác tính và phát triển không có sự kiểm soát. U lympho ác tính liên quan
trực tiếp tới sự tăng sinh của dòng tế bào lympho, khác với bệnh leukemia,
lymphoma xuất phát chủ yếu từ hạch bạch huyết, trong khi leukemia có nguồn gốc
chủ yếu từ tủy xƣơng.
Do đặc điểm của lymphoma là liên quan trực tiếp tới sự tăng sinh dòng tế
bào lympho B tại các cơ quan của hệ bạch huyết, nên lymphoma liên quan trực tiếp
tới hệ miễn dịch của cơ thể, trong đó hệ bạch huyết đóng vai trò chủ đạo.

Biểu hiện rõ nét của lymphoma là sự tăng sinh các tế bào lympho B trong các
cơ quan bạch huyết và tạo nên các khối u, nhất là tại các hạch bạch huyết ở vùng cổ,
vùng nách, ngực và háng. Tuy nhiên, vì các tế bào lympho còn phân bố ở khắp nơi
trong cơ thể nên lymphoma có thể phát sinh ở ngoài hệ thống hạch và ngoài tổ chức
bạch huyết nhƣ ở xƣơng, dạ dày, ruột, vú, tuyến giáp trạng, não.
Lymphoma đƣợc phân loại dựa trên hai cơ sở: hình dạng tế bào và mô hình
phát triển của các quần thể tế bào ung thƣ. Dựa trên hai đặc điểm này, ngƣời ta chia
lymphoma thành hai nhóm chính: nhóm ung thƣ lympho không Hodgkin (NHL) và
u lympho Hodgkin (HD) [68].
1.1.2. Tình hình ung thƣ máu trên thế giới và ở Việt Nam
Tình hình ung thƣ máu trên thế giới
Ung thƣ máu là một trong 10 loại ung thƣ phổ biến ở các nƣớc trên thế giới.
Theo thống kê của IARC năm 2011 ở Mĩ [49], khoảng 4 phút có một trƣờng hợp
đƣợc chẩn đoán ung thƣ máu và có 140310 trƣờng hợp phát hiện mới, chiếm 9%
tổng số các loại ung thƣ. Đến năm 2013, số trƣờng hợp mắc mới tăng lên là 156420,

5


chiếm 9,4% tổng số các loại ung thƣ. Trong 3 loại ung thƣ thì tỉ lệ mắc mới ở
lymphoma cao nhất (54% - 2011; 51% - 2013), tiếp đến là leukemia (32% - 2011;
33% - 2013) và myeloma (15% - 2011; 15% - 2013) (Hình 1.1).

Hình 1.1. Trƣờng hợp mắc mới các bệnh ung thƣ máu ở Mĩ năm 2011(A) và
2013 (B) [49], [50]
(TH mắc mới: Trƣờng hợp mắc mới)

Tần suất mắc mới trên 100.000 dân năm 2011 xấp xỉ bằng năm 2013 ở 3 loại
ung thƣ máu (leukemia: 12,5 - 2011; 12,8 - 2013); (lymphoma: NHL 19,8 - 2011;
19,7 - 2013; HL 2,8 - 2011, bằng 2013); (Myeloma: 5,7 - 2011; 5,9 - 2013) [49],

[50]. Trong đó, NHL và HL là loại ung thƣ phổ biến nhất ở trẻ em từ 0 đến 19 tuổi.
Số ngƣời chết vì ung thƣ máu mỗi ngày có gần 145 ngƣời, hơn 6 ngƣời chết trong 1
giờ. Tuy nhiên, tỉ lệ chết vì ung thƣ máu đã giảm từ năm 1999 đến 2008.
Tình hình ung thƣ máu ở Việt Nam
Theo ghi nhận của Nguyễn Trần Anh Thƣ và cộng sự trong 2 năm (20062007) bệnh nhân điều trị u lympho Hodgkin/bệnh lympho ác tính chung tại Bệnh
viện Ung bƣớu Thành phố Hồ Chí Minh là 6,2%, tỉ lệ mắc bệnh nam/nữ là 1,7/1,
chiếm tỉ lệ cao là 15-35 tuổi (46,2%) và trên 55 tuổi (32,3%) [11].
Năm 2008, ung thƣ máu đƣợc thống kê ở 5 tỉnh (Hà Nội, Hải Phòng, Huế,
Cần Thơ, Thái Nguyên) là chiếm vị trí hàng đầu trong các loại ung thƣ phổ biến ở
trẻ em [1]. Năm 2010, tỉ lệ mắc bệnh NHL chuẩn theo tuổi là 6,3 và 3,7/100.000
dân, đứng thứ 7 ở nam giới và đứng thứ 9 ở nữ trong các loại ung thƣ. Bệnh có tỉ lệ
mắc cao ở nhóm tuổi 35-40 và 50-55 [2]. Năm 2013, theo nghiên cứu của Nguyễn

6


Kim Lƣu và cộng sự cho thấy bệnh NHL tuổi mắc trung bình là 50,9 ± 15,3, ung
thƣ tập trung lứa tuổi 40 – 60 và tỉ lệ mắc theo giới nam/nữ là 2,3/1 [8].
1.1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị ung thƣ máu
Các phƣơng pháp chẩn đoán
Chẩn đoán xác định ung thƣ máu là bƣớc đầu tiên quan trọng nhất khi bệnh
nhân ung thƣ đến khám bệnh. Quá trình chẩn đoán ung thƣ từ đơn giản nhƣ hỏi,
khám bệnh bằng nhìn, sờ, gõ, nghe đến phức tạp hơn nhƣ làm các xét nghiệm cận
lâm sàng gồm có:
(1) Xét nghiệm máu; (2) Sinh thiết tế bào. Trong một số trƣờng hợp, cần nhuộm
hóa mô miễn dịch với một số chỉ thị phân tử: tế bào B (CD10, CD20, CD21, CD23,
CD20, CD55, CD19), tế bào T (CD3, CD5, CD43, CD45R0) để chẩn đoán phân
biệt hay chẩn đoán xác định; (3) Chụp Xquang đƣợc chỉ định cho những bệnh nhân
có triệu chứng ung thƣ phổi hay ung thƣ máu ở các vị trí khác có thể di căn vào
phổi. Siêu âm, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hƣởng từ; (4) Chẩn đoán bằng xác

định biến đổi gen: Kazenwadel J. và cộng sự đã phát hiện biến đổi gen GATA2 có
thể gây bệnh u tủy và bệnh bạch cầu cấp tính (AML) [71]. Đây là một phát hiện
khoa học đột phá và quan trọng đối với việc điều trị và phát hiện sớm căn bệnh
nguy hiểm này.
Phƣơng pháp điều trị
Năm 1960, chỉ có 4% trẻ em chẩn đoán mắc bệnh leukemia đƣợc cứu sống.
Ngày nay, 79% hy vọng sống sót nếu họ nhận đƣợc sự điều trị tốt. Bệnh nhân ung
thƣ máu đƣợc cứu sống với tỉ lệ rất cao, điều này cho thấy việc nghiên cứu chẩn
đoán và chữa trị bệnh trong những năm qua rất thành công. Hóa trị liệu và xạ trị là
các liệu pháp đã đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ máu từ rất lâu. Tuy nhiên, các
liệu pháp này gây ra nhiều tác dụng phụ cho ngƣời bệnh và kết quả điều trị không
nhƣ mong muốn. Những liệu pháp mới hơn nhƣ ghép tủy và các liệu pháp sinh học
(liệu pháp miễn dịch, liệu pháp gen và điều trị đáp ứng nhân tố gây bệnh (RiskAdapted Therapy) đang đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu và cũng đã thu đƣợc
những kết quả nhất định [49].

7


1.1.4. Bệnh ung thƣ lympho không Hodgkin (Non-Hodgkin lymphoma)
U lympho ác tính là nhóm bệnh của hệ lympho ngoại vi, chia 2 nhóm:
Hodgkin lympho với đặc điểm có tế bào RS (Reed Sternberg) và non Hodgkin
lympho (NHL) với đặc điểm thâm nhiễm lympho nhiều nơi.
Bệnh NHL là sự tăng sinh các tế bào lympho B trong các cơ quan bạch huyết
và tạo nên các khối u, nhất là tại các hạch bạch huyết ở vùng cổ, vùng nách, ngực và
bẹn. NHL là ung thƣ phổ biến thứ 5 trên thế giới [51]. NHL tăng hơn 82,5% từ năm
1975 đến 2008, trung bình hàng năm tăng khoảng 2,4%. Tỷ lệ bệnh NHL cao hơn
nhiều so với bệnh ung thƣ lympho Hodgkin (HL) và có xu hƣớng tăng ở cả nam và
nữ. Theo thống kê của IARC tỷ lệ bệnh NHL năm 2011 và 2013 bằng nhau (chiếm
88,5%) trong tổng số ngƣời mắc bệnh u lympho ở Mĩ và phụ thuộc theo tuổi [49],
[50].

Phân loại NHL
Có nhiều cách phân loại NHL khác nhau nhƣng có 2 cách phân loại đƣợc sử
dụng phổ biến trong chẩn đoán và điều trị hiện nay là phân loại theo WHO [42] ở
bảng 1.1 và Working Formulation ở bảng 1.2 [106].
Bảng 1.1. Phân loại NHL theo WHO - 2008
STT
1

Phân loại NHL
Tế bào lympho nhỏ (Small Lymphocytic Lymphoma)


Tế bào B

10 (90.9%)



Tế bào T

1 (9.1%)

2

Tế bào nang (Follicular Lymphoma)

3

Tế bào lympho lớn, lan tỏa (Diffuse Large Cell Lymphoma)


Tế bào lympho B lớn, lan tỏa (Diffuse Large B Cell

6 (100%)
11 (55%)

Lymphoma)


Tiền tế bào lympho T (Peripheral T Cell Lymphoma)

5(25%)



Tế bào lympho T lớn (Anaplastic Large T Cell

3 (15%)

Lymphoma)


Tế bào lympho T nguyên bào miễn dịch

8

1 (5%)


(Angioimmunoblastic T Cell Lymphoma)

4

5

U lympho nguyên bào (Lymphoblastic Lymphoma)


T Lymphoblastic Lymphoma

4 (80%)



B Lymphoblastic Lymphoma

1 (20%)

U lympho nguyên bào miễn dịch (Immunoblastic Lymphoma)

3 (100%)

Bảng 1.2. Phân loại NHL trong điều trị (Working Formulation - 1982)
STT
1

2

3

4

Độ ác tính
Độ ác tính thấp


Tế bào lympho nhỏ, lan tỏa



Tế bào nang, nhỏ, nhân chẻ



Tế bào nang hỗn hợp: to, nhỏ xen kẽ

Độ ác tính trung gian


Tế bào lympho nhỏ, lan tỏa, nhân chẻ



Tế bào lan tỏa, hỗn hợp (to, nhỏ)



Tế bào lan tỏa, tế bào lớn



Tế bào nang lớn

Độ ác tính cao


U lympho nguyên bào miễn dịch



Thể Burkitt

Hỗn hợp

Các triệu chứng của NHL
Mỗi ngƣời có thể gặp các triệu chứng khác nhau nhƣ sƣng các hạch bạch
huyết ở cổ, nách và háng. Sốt, đổ mồ hôi đêm, mệt mỏi, giảm cân, ngứa da, nhiễm
trùng định kỳ. Các triệu chứng NHL có thể giống nhƣ rối loạn máu khác nhƣ bệnh
cúm hoặc nhiễm trùng. Tuy nhiên, một số ngƣời bị NHL không nhận thấy bất kỳ
triệu chứng nào. NHL của họ chỉ có thể phát hiện khi xét nghiệm máu [9].
Các yếu tố nguy cơ

9