Nghiên cứu tạo sinh khối spirulina platensis 11

62

CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN


63

3.1 Kết quả thuần chủng S. platensis
Trong dịch nuôi S. platensis xuất hiện chủ yếu một loại tạp khuẩn. Đã xác
định sơ bộ được là loại trực khuẩn, gram dương, hình que, hai đầu dạng thon.
3.1.1 Kết quả thuần chủng bằng tác nhân UV
Khi sử dụng tia UV kết quả đạt được khơng những kém xa mong đợi mà cịn
có ảnh hưởng xấu, lượng vi khuẩn tạp nhiễm có chiều hướng tăng tỷ lệ với thời gian
chiếu. Số lượng khuẩn lạc trước khi chiếu UV là 500 CFU/ml và sau khi chiếu UV
là 104 CFU/ml.
Như vậy, có thể yếu tố thời gian chiếu UV có tác động xấu đến S. platensis,
từ đó hỗ trợ cho vi khuẩn lạ phát triển.Tia cực tím có khả năng diệt khuẩn, điều đó
có nghĩa rằng S. platensis cũng là đối tượng chịu ảnh hưởng, khả năng này càng dễ
xảy ra khi S. platensis được phơi trực tiếp dưới tia cực tím.
Mặt khác, S. platensis với kích thước lớn hơn nhiều lần vi khuẩn thì lượng tia
UV nhận được cũng sẽ nhiều hơn, và sinh khối S. platensis cũng là nơi mà vi khuẩn
có thể ẩn nấp để tránh tác động của tia UV.
Thực nghiệm cho thấy, khi chiếu liên tục tia UV trong 30 phút, hầu hết dạng
sợi S. platensis bị phá hủy thành dạng đoạn ngắn hoặc đơn bào. Khi tăng thời gian
chiếu lên 60 phút, toàn bộ tế bào bị phá vỡ, giải phóng các chất chứa bên trong tế
bào.
Đối với vi khuẩn tia UV có tác động tiêu diệt tương tự, nhưng nhờ kích thước
lớn của S. platensis che chắn nên tác dụng đó sẽ giảm đi. Thêm vào đó, S. platensis
với thành phần dinh dưỡng hoàn hảo càng thúc đẩy nhanh sự phát triển trở lại của vi
sinh vật tạp nhiễm.

S. platensis với cấu trúc xoắn lị xo, nên ln tồn tại những vị trí bị che khuất
theo chiều dài sợi, đây chính là chỗ mà UV hầu như khơng thể tiếp cận để phát huy
tính sát khuẩn.
Như vậy có thể kết luận rằng, bố trí thí nghiệm tia UV như mục 2.1.1 khơng
có tác dụng làm thuần S. platensis nếu như chiếu trực tiếp vào dịch nuôi.


64

Hình 3.1 Mật độ vi khuẩn nhiễm trước khi chiếu UV

Hình 3.2 Mật độ vi khuẩn nhiễm sau khi chiếu UV 5 phút


65

3.1.2 Kết quả thuần chủng bằng môi trường Zarrouk vô trùng
S. platensis với khả năng phát triển nhanh hơn vi khuẩn tạp nhiễm trong
những giờ đầu tiên cấy trên môi trường thạch Zarrouk, nên có thể tận dụng đặc
điểm này để làm thuần chủng.
Kết quả cho thấy, sau 4 lần cấy chuyền theo phương pháp này có thể thu được
sợi sinh khối S. platensis sạch tạp khuẩn nhiễm, khơng có khuẩn lạc tạp khuẩn mọc
lên sau 48 giờ cấy.
Số lượng khuẩn lạc giảm rõ rệt sau mỗi lần cấy chuyền (bảng 3.1).
Bảng 3.1 Diễn biến số khuẩn lạc sau mỗi lần cấy chuyền
Lần cấy chuyền

Khuẩn lạc (CFU/ml)

1

500

2

47

3

9

4

(÷)

Chú giải: (÷) là có thể cịn song rất ít, khơng phát hiện được.
Vi khuẩn nhiễm bị rửa trôi phần lớn ở các ống nghiệm. Khi chưa kịp tăng số
lượng trở lại thì thao tác cấy lên môi trường thạch Zarrouk vô trùng với thành phần
hồn tồn là khống, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật dị dưỡng. Trong khi đó, S.
platensis với khả năng tự dưỡng vẫn phát triển sinh khối tạo ra những sợi mới trong
thời gian ngắn từ 6-8 giờ đồng hồ, những sợi mới này lại được chuyển sang môi
trường Zarrouk mới, vô trùng.


66

Hình 3.3 S. platensis quan sát dưới kính hiển vi sau bốn lần cấy chuyền (x1000)

Hình 3.4 S. platensis phát triển trên môi trường Zarrouk thạch sau bốn lần cấy
chuyền

67

Khuẩn nhiễm là vi sinh vật dị dưỡng, do đó cần nguồn carbon hữu cơ để phát
triển, chúng sống trong môi trường nuôi S. platensis là do các chất dinh dưỡng của
tế bào khuẩn lam bị phân hủy. Môi trường Zarrouk không chứa bất kỳ nguồn carbon
hữu cơ nào. Sợi sinh khối S. platensis mới phát triển là những sợi cịn khỏe mạnh,
do đó sẽ tiếp tục tăng sinh khối trong khoảng thời gian 12-14 giờ đồng hồ sau khi
cấy trên môi trường Zarrouk mới. Do nguồn dinh dưỡng bị hạn chế tới mức cạn kiệt
nên vi khuẩn nhiễm cũng bị hạn chế tới mức tối thiểu trong thời gian đó. Tế bào
khuẩn nhiễm cịn lại sẽ bị loại bỏ dần qua các bước rửa và cấy lên môi trường
Zarrouk thạch vô trùng tiếp theo.
Như vậy, bằng một phương pháp khá đơn giản bao gồm các bước “Môi
trường thạch – Mơi trường dịch thể - Rửa –Mơi trường thạch” thì thu được giống S.
platensis thuần sau 4 lần lặp.


68

3.1.3 Kết quả hình thái S. platensis

Hình 3.5 Sợi S. platensis (x1000)

Hình 3.6 S. platensis đang phân cắt


69

3.2 Kết quả xác định mật độ tế bào khởi đầu để ni S. platensis

Để thời gian tồn bộ q trình ni khơng q dài thì một mật độ tế bào S.
platensis khởi đầu là cần thiết.
S. platensis được nuôi trong môi trường Zarrouk với 4 nồng độ sinh khối
khác nhau, kết quả thu được như bảng 3.2.
Bảng 3.2 Tốc độ tăng sinh của S. platensis ở nồng độ sinh khối ban đầu 0,1; 0,2;
0,3; và 0,4 g/l
Nồng độ sinh khối (g/l)

Ngày
nuôi

0,10

0,20

0,30

0,40

1

0,10

0,20

0,30

0,40

2

0,11

0,21

0,34

0,46

3

0,12

0,25

0,40

0,54

4

0,14

0,29

0,48

0,63

5

0,16

0,33

0,56

0,71

6

0,19

0,39

0,64

0,79

7

0,22

0,46

0,73

0,85

8

0,26

0,56

0,80

0,88

9

0,31

0,63

0,87

0,91

10

0,39

0,72

0,91

0,93

11

0,47

0,80

0,93

0,94

12

0,58

0,87

0,95

0,96

13

0,62

0,90

0,96

0,96

14

0,66

0,92

0,96

0,95

15

0,70

0,93

0,95

16

0,73

0,94

17

0,74


70

Sự phát triển của S. platensis có đặc điểm, khi các sợi khuẩn lam đạt một mật
độ cần thiết thì sự phát triển mạnh mới bắt đầu diễn ra, điều đó giải thích cho thí
nghiệm ni ở nồng độ sinh khối 0,1; 0,2 (g/l) S. platensis có biểu hiện phát triển
yếu trong khoảng 5-6 ngày đầu và đạt giá trị cao nhất lần lượt vào ngày nuôi thứ 16,
15.
Theo bảng 3.21 (phụ lục 1), bốn nồng độ sinh khối khởi đầu đều có sự khác
biệt và theo bảng 3.2, nồng độ sinh khối khởi đầu 0,4 g/l cho thời gian tăng trưởng
ngắn nhất là 12 ngày, nhưng để có mật độ tế bào đạt 0,4 sẽ tốn nhiều thời gian nuôi
ban đầu.

Nồng độ sinh khối (g/l)

1,2
1
0,1 g/l

0,8

0,2 g/l

0,6

0,3 g/l
0,4 g/l

0,4
0,2
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Ngày nuôi

Đồ thị 3.1 Tốc độ tăng sinh của S. platensis ở nồng độ
tế bào ban đầu 0,1; 0,2; 0,3; và 0,4 g/l
Theo đồ thị 3.1, trong ba giá trị 0,1; 0,2 và 0,3 thì từ khi sinh khối đạt khoảng
0,3 g/l S. platensis có thể tăng sinh nhanh chóng đến nồng độ sinh khối cao nhất
khoảng 10-12 ngày sau.
Do đó, giá trị sinh khối 0,3 g/l được chọn làm nồng độ sinh khối ban đầu để
tiến hành các thí nghiệm sau.


71

3.3 Kết quả hệ thống nuôi S. platensis
3.3.1 Kết quả xây dựng hệ thống
3.3.1.1 Hệ hở
Hệ hở là chậu có diện tích mặt thống mơi trường là 0,07 m2, độ sâu 0,1 m,
tốc độ sục khí 1 l/phút, điều kiện ánh sáng có mái che (bảng 3.8).

Hình 3.7 Mơ hình hệ hở
3.3.1.2 Hệ kín
Có bốn loại hệ kín được thiết kế và xây dựng nên theo các đặc điểm phân biệt
sau.
Hệ các ống thuộc một mặt phẳng song song với mặt đất (hệ 1).
Hệ các ống thuộc mặt phẳng vuông góc với mặt đất, các ống nối tiếp và song
song với nhau (hệ 2).
Hệ các ống thuộc một mặt phẳng vng góc với mặt đất, các ống song song
với nhau, nhưng không nối với nhau trực tiếp mà nối bằng hai ống chung ở hai đầu
trên và dưới (hệ 3).

72

Hệ các ống thuộc một mặt phẳng vng góc với mặt đất, các ống nối tiếp với
nhau và tạo một góc 300 với đường thẳng song song với mặt đất (hệ 4).

Hình 3.8 Hệ 1

Hình 3.9 Hệ 2

Hình 3.10 Hệ 3

Hình 3.11 Hệ 4


73

Bốn kiểu hệ trên đều có diện tích bề mặt là 1,17 m2, được xem xét về khả
năng hoạt động và năng suất sinh khối để tìm ra một thiết kế tối ưu cho nghiên cứu
kế tiếp.
a) Về khả năng hoạt động của các hệ kín
Hệ 1 và hệ 2
Hệ 1 với thiết nằm, các ống có độ cao bằng nhau so với mặt đất khiến môi
trường không tự di chuyển trong hệ thống, nên việc đưa dịch nuôi vào hệ gặp khó
khăn. Khi sục khí khơng tạo ra lực đảo trộn mơi trường mà tạo thành một dịng khí
liên tục nằm trên bề mặt dịch nuôi từ đầu đến cuối hệ. Hệ 1 gây tốn diện tích do
phải trải rộng trên mặt đất. Nguyên nhân chính khiến hệ 1 khơng thể đưa vào để
ni S. platensis là hồn tồn khơng có khả năng đảo trộn mơi trường ni.
Hệ 2 có cùng kiểu nối tiếp như hệ 1 nhưng được dựng đứng lên theo chiều
các ống vng góc với mặt đất. Hệ này có một số ưu, nhược điểm như sau:
Ưu điểm

¾

Tốn ít diện tích nhờ tận dụng khoảng khơng theo chiều cao.

Nhược điểm
¾

Mơi trường chỉ vào các ống 1, 3, 5, 7, 9.

¾

Khí khơng sục vào hệ thống được.

¾

Khó lấy mẫu làm thí nghiệm.

¾

Dễ xảy ra hiện tượng rị rỉ mơi trường ni.

¾

Thu hoạch sinh khối khó.

¾

Áp lực nước cao.

Những nhược điểm trên dẫn đến hệ không thể hoạt động để ni S. platensis.

Có thể làm các lỗ thơng khí phía trên mỗi ống, khi đó mơi trường vào đầy tất cả các
ống nhưng không khắc phục được nhược điểm cịn lại. Vì vậy hệ 2 khơng được tiếp
tục nghiên cứu thêm trong luận văn này.
Những kết quả kém của hệ 1 và 2 đã dẫn đến những thay đổi trong thiết kế hệ
và đã có hai hệ kín được tạo ra.
Hệ 3 và hệ 4


74

Hệ 3 và 4 mang lại khả năng hoạt động cao khi nuôi S. platensis cả về năng
suất lẫn chất lượng sinh khối. Để có thể đánh giá đầy đủ về hệ 3 và 4 trong vai trị
ni S. platensis, thì các thí nghiệm về thiết kế và năng suất đã được thực hiện và
cho một số kết quả như sau.
Ưu và nhược điểm trong thiết kế
™ Cả hai hệ 3 và 4 đều mang những ưu điểm như dưới đây:
¾

Tiết kiệm diện tích.

¾

Sục khí vào hệ thống dễ dàng.

¾

Dễ lấy mẫu để làm kiểm tra.

¾

Dễ thu hoạch sinh khối.

Bảng 3.3 Một số đặc điểm khác biệt của hai hệ 3 và 4
Hệ 3

Hệ 4

Số lượng các ống bằng với số đường khí

Chỉ có duy nhất một đường khí sục vào

sục vào

hệ

Áp lực lên các mối lắp ghép cao

Áp lực lên các mối lắp ghép thấp

Dễ rị rỉ dịch ni

Dịch ni hầu như khơng bị rị rỉ

Khó lắp ráp do các ống phải có độ dài

Dễ lắp ráp, các ống khơng cần dài bằng

bằng nhau

nhau

Vệ sinh hệ khó khăn

Vệ sinh dễ dàng

Nhiều mối nối

Khơng cần nhiều mối nối

Khó đưa mơi trường nuôi vào hơn do phải

Dễ đưa môi trường nuôi vào, có thể đưa

đưa từ dưới vào

từ trên vào

Khơng thể hoạt động riêng từng phần hệ

Có thể hoạt động riêng từng phần hệ

thống

thống

Khó tìm vật liệu do phải có độ cứng

Dễ tìm vật liệu

75

b) Về ưu nhược, điểm trong khi tiến hành nuôi S. platensis của hai hệ 3 và 4
Cả hai hệ 3 và 4 đều cho thời gian nuôi ngắn và nồng độ cao hơn hệ hở cũng
như không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện xung quang như gió, bụi, các vi khuẩn lạ
xâm nhiễm, ít thất thốt nước và khí CO2. Mẫu được lấy từ van của hệ thống (xem
hình 3.11).
Bảng 3.4 Một số ưu, nhược điểm khi ni S. platensis của hai hệ 3 và 4
Hệ 3

Hệ 4

Nồng độ tế bào thấp hơn

Nồng độ tế bào cao hơn

Cần khí sục hơn nhiều lần

Cần ít khí sục hơn

S. platensis phát triển không đồng đều ở

S. platensis phát triển ở các ống dưới

các ống khác nhau

cùng trước nên thu hoạch dễ dàng


76

Theo bảng 3.5, hệ 4 với nồng độ sinh khối cao hơn nên cho năng suất cao
hơn, nồng độ sinh khối cao nhất của hệ 3 và 4 lần lượt là 2,49 g/l và 3,44 g/l tương
ứng với năng suất trung bình 0,27 g/l/ngày và 0,52 g/l/ngày ở thời điểm thu hoạch
sinh khối. Kết quả về sự tăng trưởng sinh khối của hai hệ 3 và 4 như bảng 3.5.
Bảng 3.5 Sự tăng trưởng của S. platensis khi nuôi trong hai hệ 3 và 4, sục khí
1 l/phút, ở điều kiện phịng thí nghiệm
Nồng độ sinh khối (g/l)
Ngày ni
Hệ 3

Hệ 4

1

0,30

0,30

2

0,33

0,35

3

0,41

0,55

4

0,72

1,18

5

1,20

1,88

6

1,49

2,84

7

1,98

3,44

8

2,41

3,16

9

2,49

10

2,23

Theo bảng 3.5, khi nuôi trong hệ 4 S. platensis tăng sinh nhanh hơn so với hệ
3. Thời điểm thu hoạch của hệ 4 là ngày 7, hệ 3 là ngày 9.


77

Theo bảng 3.22 (phụ lục 2), nồng độ sinh khối ở 9 ngày ni đều có tăng
trưởng mang ý nghĩa khác biệt, do đó nên thu hoạch sinh khối ở hệ 4 vào ngày nuôi
thứ 7.
4

N ồng độ sinh khối (g/l)

3,5
3
Hệ 3

2,5

Hệ 4

2
1,5
1
0,5
0
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Ngày nuôi

Đồ thị 3.2 Sự tăng trưởng của S. platensis khi nuôi trong hai hệ 3 và 4

Cùng một xuất phát điểm nhưng mang lại hai kết quả khác nhau, điều này là
do khác biệt về kiểu thiết kế gây nên. Theo như nghiên cứu ban đầu thì nguyên nhân
là cách sục khí vào hệ tạo nên chế độ dịng chảy mơi trường ni.
Hệ 3 với dịng khí sục từ dưới lên trên, trong khi di chuyển các bọt khí va
chạm một cách trực diện với sợi S. platensis, nhiều va chạm liên tục khiến các sợi tế
bào bị yếu và gẫy làm nhiều đoạn bào. Khi thời gian sục khí kéo dài thì lượng sinh
khối bị ảnh hưởng cũng sẽ tăng theo và làm cho toàn bộ thời gian ni dài thêm.
Bên cạnh đó, do thiết kế đứng nên các sợi tế bào có xu hướng chìm xuống đáy hệ,
nơi mà ít chịu tác động của việc sục khí, làm cho nồng độ sinh khối của hệ bị giảm.
Hệ 4, dịng khí sục vào di chuyển bên trên bề mặt môi trường nên lực va
chạm nhỏ. Thiết kế tạo một độ dốc để khí sục vào tự chuyển động về phía sau hệ
thống, đồng thời tạo ra lực đảo trộn môi trường nên sinh khối không lắng xuống,


78

song có xu hướng chuyển dồn xuống các ống phía dưới, nên các ống càng thấp thì
hàm lượng sinh khối càng cao và càng dễ thu hoạch. Kết quả quan sát hình thái S.
platensis trong hai hệ 3 và 4 như hình 3.12 và 3.13.

Hình 3.12 Kích thước S. platensis khi sục khí ở hệ 3

Hình 3.13 Kích thước S. platensis khi sục khí ở hệ 4


79

Sinh khối thu được từ hệ 4 có hàm lượng protein, các sắc tố chlorophyll,
phycocyanin và carotenoid cao hơn so với hệ 3.
Bảng 3.6 Hàm lượng các chất trong S. platensis nuôi ở hai hệ 3 và 4, sục không khí

1 l/phút
Protein

Carbohydrate Lipid Chlorophyll

% trọng lượng khơ

Phycocyanin

Carotenoid

mg/g

Hệ 3

56,00

14,06

6,91

11,52

89,67

2,78

Hệ 4

58,42

13,27

6,05

13,65

110,53

3,95

Trong hệ 4, do trong mỗi ống dịng khí chuyển động ở phần trên bề mặt môi
trường dịch, chỗ tiếp xúc nhiều với ánh sáng và khi đi từ ống dưới lên ống trên dịng
khí làm đảo trộn mơi trường và tạo dịng mơi trường chuyển động ngược lại với
hướng đi của dịng khí, vì vậy mơi trường được đảo trộn đều hơn và sinh khối được
tiếp xúc với ánh sáng tốt hơn nên quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học xảy
ra mạnh hơn, lượng protein cao hơn (58,42 so với 56,0 khác biệt 4,3%) đặc biệt các
sắc tố chlorophyll, phycocyanin, carotenoid cao hơn đáng kể (18,5; 24,2 và 1%
tương ứng). Chỉ riêng hàm lượng carbohydrate và lipid thấp hơn (5,6 và 14,2%
tương ứng). Điều này có thể giải thích do việc chuyển động nên chi phí năng lượng
của ngun liệu dễ chuyển hóa (carbohydrate) nhiều hơn và tích lũy năng lượng
(dưới dạng lipid) thấp hơn. Chính xu hướng này làm cho sinh khối Spirulina có giá
trị hơn về mặt thực phẩm chức năng: giàu protein năng lượng thấp, các chất chống
oxy hóa cao…
Với kết quả thu được, hệ 4 được sử dụng tiếp trong các thí nghiệm sau.
3.3.2 Kết quả hoạt động hệ thống


80

3.3.2.1 Hệ hở
Do những hạn chế về ánh sáng và sự đảo trộn mà nồng độ tế bào cao nhất đạt
1,31 g/l.


81

Bảng 3.7 Nồng độ sinh khối S. platensis nuôi trong hệ hở
Ngày nuôi

Nồng độ sinh khối (g/l)

1
2
3
4
5

0,30
0,33
0,38
0,45
0,54

6

0,69

7

0,81

8

0,97

9

1,08

10

1,15

11

1,21

12

1,26

13

1,29

14

1,31

15

1,31

16

1,29

17

1,25

18

1,23

19

1,19

20

1,18

21

1,17

22

1,17

23

1,15

24

1,14

25

1,01

26

0,6