chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử ( MAS)

MARKER-ASSISTED BREEDING-MAS
Công cụ mới trong chọn giống
cây trồng
Bert Collard & David Mackill
Plant Breeding, Genetics and Biotechnology (PBGB) Division, IRRI
&

•
Cơ sở của MAS ( chỉ thị phân tử) Molecular
Markers
•
Tất cả cơ quan sống được hình thành từ các tế
bào
•
Các tế bào sống được điều khiển bằng vật liệu di
truyền gọi là DNA
•
Phân tử DNA được tạo thành chuỗi dài chứa các
N ( Adenin [A]; Ctosin [C]; Guanine [G] và
Thymine [T]
•
Chỉ mỗi phần nhỏ của chuỗi DNA tạo thành các
gen

•
Gen mang mã di truyền cho các protein
•
Phân còn lại chủ yếu của DNA không mã hóa
•
Các vật liệu di truyền tổ chức bên trong các NST ( ví dụ

cây Arabidopsis thaliana có 5 NST)
•
Tập hợp bộ nhiễm sắc thể gọi là genome
•
Trong 1 cá thể lưỡng bộ ( NST theo các cặp) có 2 allel
của một gen, mỗi allel có nguồn từ một bố mẹ
•
Chỉ thị phân tử không xem xét như các gen bình thường
khi chúng không có ảnh hưởng sinh học mà xem xét như
các mốc điểm trong genome.

•
Chúng có thể nhận biết trình tự DNA truyền đạt di
truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác
•
Chúng dựa vào kiểm tra DNA phản ảnh được chỉ thị
hình thái
•
DNA là cơ sở nhanạ biết các tính trạng quan sát được,
chỉ thị hóa sinh là cơ sở gen tạo ra protein
•
Số marker này có thể dò tìm toàn bộ genome và tìm số
lượng biến dị di truyền mỗi marker tìm ra trong một
quần thể
•
Thông tin cung cấo cho nhà tạo giống phụ thuộc vào
marker sử dụng, mỗi marker có ưu và nhược điểm riêng

•
Có các lại chỉ thị phân tử khác nhau

–
Chiều dài đoạn giới hạn đa hình- Restriction
fragment length polymorphisms (RFLPs):
–
Hình thái phóng đại ngẫu nhiên-Random amplified
polymorphic DNA (RAPDs):
–
Hình thái chiều dài đoạn phóng đại- Amplified
fragment length polymorphisms (AFLPs):
–
Lặp lại chuỗi đơn giản- Simple sequence repeats
(SSRs) or microsatellites:
–
Đa hình nucleotide đơn (SNPs) Single nucleotide
polymorphisms

NỘI DUNG
1. CHỌN GIỐNG DỰ TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ: LÝ
THUYẾT VÀ THỰC TẾ
•
MARKER ASSISTED SELECTION: THEORY AND PRACTICE
2. HỆ THỐNG CHỌN GIỐNG MAS
•
MAS BREEDING SCHEMES
3. MỘT VÍ DỤ NGHIÊN CỨU CỦA IRRI
•
IRRI CASE STUDY
4. NHỮNG THỰC TẾ SỬ DỤNG MAS
•
CURRENT STATUS OF MAS

SECTION 1
MARKER ASSISTED
SELECTION (MAS):
THEORY AND PRACTICE

Định nghĩa:
Chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử
(Marker assisted selection- MAS) là
sử dụng chỉ thị DNA liên kết chặt với
locus mục tiêu để thay cho chọn lọc
đánh giá kiểu hình
Giả định: chỉ thị DNA (DNA markers) có
thể dự đoán kiểu hình đáng tin cậy

F
2
P
2
F
1
P
1 x
large populations consisting of
thousands of plants
PHENOTYPIC SELECTION
Field trialsGlasshouse trials
Donor
Recipient
Chọn giống truyền thống CONVENTIONAL PLANT BREEDING

Salinity screening in phytotron Bacterial blight screening
Phosphorus deficiency plot

F
2
P
2

F
1
P
1
x
large populations consisting of
thousands of plants
ResistantSusceptible
MARKER-ASSISTED SELECTION (MAS)
MARKER-ASSISTED BREEDING
Phương pháp chọn lọc kiểu hình trên cơ sở DNA markers

Những tiến bộ của MAS

Simpler method compared to phenotypic
screening

Đặc biệt với những tính trạng khó đánh giá thanh lọc

Có thể tiết kiệm thời gian và nguồn lực

Selection at seedling stage


Rất quan trọng với một số tính trạng như chất lượng
hạt

Có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể chọn
ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3

Increased reliability

Không bị ảnh hưởng của môi trường

Có thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp và chọn lcọ
từng cây

Lợi ích tiềm năng của MAS
•
Chọn lọc các kiểu
gen chính xác và
hiệu quả hơn
–
Phát triển giống
nhanh hơn
•
Sử dụng nguồn lực
hiệu quả hơn
–
Đặc biệt các thí
nghiệm đồng ruộng
Crossing house
Backcross nursery

(1) LEAF TISSUE
SAMPLING
(2) DNA EXTRACTION
(3) PCR
(4) GEL ELECTROPHORESIS
(5) MARKER ANALYSIS
Overview of
‘marker
genotyping’

Những vấn đề cần quan tâm khi sử dụng
DNA markers in plant breeding

Kỹ thuật đơn giản

Độ tin cậy

Mức đa hình

Yêu cầu số lượng và chất lượng DNA

Chi phí

Nguồn lực sẵn có

Markers must be
tightly-linked to target loci!
•
Ideally markers should be <5 cM from a gene or QTL

•
Sử dụng cặp marker hai đầu cải thiện mức độ tin cậy
nhưng tăng thời gian và chi phí
Marker A
QTL
5 cM
RELIABILITY FOR
SELECTION
Using marker A only:
1 – r
A
= ~95%
Marker A
QTL
Marker B
5 cM
5 cM
Using markers A and B:
1 - 2 r
A
r
B
= ~99.5%

Markers must be polymorphic
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
RM84 RM296
P
1

P
2
P
1
P
2
Not polymorphic Polymorphic!

DNA extractions
DNA EXTRACTIONS
LEAF SAMPLING
Porcelain grinding plates
High throughput DNA extractions “Geno-Grinder”
Mortar and pestles
Wheat seedling tissue sampling in
Southern Queensland, Australia.

PCR-based DNA markers
•
Nhân bằng Polymerase Chain Reaction
•
Markers thông dụng với kỹ thuật đơn giản và tiết kiệm
GEL ELECTROPHORESIS
Agarose or Acrylamide gels
PCR
PCR Buffer +
MgCl
2

+

dNTPS +
Taq +
Primers +
DNA template
THERMAL CYCLING

Agarose gel electrophoresis
/>UV light
UV transilluminator

UV light
UV transilluminator
Acrylamide gel electrophoresis 1

Acrylamide gel electrophoresis 2

SECTION 2
HỆ THỐNG TẠO GIỐNG MAS (MAS
BREEDING SCHEMES)
1. Lai lại dựa trên chỉ thị phân tử (Marker-
assisted backcrossing)
2. Quy tụ gen (Pyramiding)
3. Chọn lọc những thế hệ đầu (Early
generation selection)
4. Tiếp cận phối hợp ( ‘Combined’
approaches)

2.1 Marker-assisted backcrossing (MAB)
( Lai trở lại dự trên chỉ thị phân tử)
•

MAB có một số tiến bộ hơn lại lại truyền thống :
–
Chọn lọc các locus mục têu rất hiệu quả
–
Tối thiểu hoá những liên kết kéo theo
–
Lấy lại nhanh kiểu gen của bố qua chọn lọc chu kỳ
1

2 3 4
Target
locus
1

2 3 4
RECOMBINANT
SELECTION
1

2 3 4
BACKGROUND
SELECTION
TARGET LOCUS
SELECTION
Chọn lọc trực tiếp
locus mục tiêu
Chọn lọc lấy lại nền di truyền ( bao gồm cả
tính trạng khác)

2.2 Pyramiding ( Quy tụ gen)

•
Được sử dụng rộng rãi nhất là quy tụ
một số gen chống bệnh với các chủng
đặc thù
•
Các phương pháp truyền thống rất khó
quy tụ được một số gen
•
Phát triển giống chống bệnh bền vững
với một số chủng khác nhau

F
2
F
1
Gene A + B
P
1
Gene A
x P
1
Gene B
MAS
Select F2 plants that have
Gene A and Gene B
Genotypes
P
1
: AAbb P
2

: aaBB
F
1
: AaBb
aabbaaBbAabbAaBbab
aaBbaaBBAaBbAaBBaB
AabbAaBbAAbbAABbAb
AaBbAaBBAABbAABBAB
abaBAbAB
F
2
Quá trình tổ hợp một số gen, thường sử dụng nguồn gen từ 2
bố mẹ khác nhau đưa vao 1 kiểu gen
x
Breeding plan
Hittalmani et al. (2000). Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in
riceTheor. Appl. Genet. 100: 1121-1128
Liu et al. (2000). Molecular marker-facilitated pyramiding of different genes for powdery mildew resistance in wheat. Plant
Breeding 119: 21-24.