Nghiên cứu hoạt chất sinh học từ một số cây thuốc Việt Nam dùng trong điều trị sốt rét : Đề tài NCKH. QG.98.05

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA HÀ N Ộ I
T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C K H O A H Ọ C T ự N H IÊ N

T Ê N Đ Ể T À I:
N G H IỀ N C Ứ U H O A T C H Ấ T S IN H H Ọ C T Ừ M Ộ T s ố C Â Y T H U Ố C
V I Ệ T N A M D Ù N G T R O N G Đ lỂ U T R I B Ê N H S Ố T R É T

M Ã SỐ : Q G - 98 - 05

C H Ủ T R Ì ĐỂ T À I: GS T S K H PH AN T Ố N G SƠN


Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C GIA H À N Ộ I
T R Ư Ờ N G Đ A I H Ọ C K H O A H O C T ự N H IÊ N

T Ê N Đ Ể T À I:
N G H IÊ N C Ứ U H O Ạ T C H Ấ T S IN H H O C T Ừ M Ộ T s ố C Â Y T H U Ố C
V IỆ T N A M D Ù N G T R O N G Đ IỂ U T R I B Ê N H S Ố T R É T

M Ã SỐ : Q G - 98 - 05

C H Ủ T R Ì ĐỂ T À I: GS T S K H P H A N T Ố N G SƠN
C ác cán bộ th a m gia ch ín h:

GS TSKH Phan Tống Sơn

Khoa Hoá, Trường ĐH K H TN, ĐH Q G H N

PGS TS Văn Ngọc Hướng

Khoa Hoá, Trườns ĐH K HTN, ĐH Q G H N

TS Phan Minh Giang

Khoa Hoá, Trường ĐH K HTN, ĐH Q G H N

T h ủ h o ạ t tín h c h ô n g K S T s ố t r é t in v itro

TS Lê Đình Công

V iện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùn 2

TS Nguyễn Duy Sỹ

V iện Sốt rét, Ký sinh trùns và Côn trùns

TS Trươns Văn Như

Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng

TS Đoàn Hạnh Nhân

V iện Sốt rét, Ký sinh trùns và Côn trùns

TS Nôngơ Thi• Tiến

V iên
Sốt rét, Ký
sinh trùn?
•
J

'—
' và Còn trùng
c-

H À N Ộ I - 2000


Báo cáo tóm tắt
1 T ê n đề tà i

Nghiên cứu hoạt chất sinh học từ một số câv thuốc V iệt nam dùnơ troní
điều trị bệnh sốt rét

Mã số: QG - 98 -05
2

C h ủ t r ì đề tà i

GS TSKH Phan T ốnsữ Sơn

Trường
<_ Đại học Khoa học tự nhiên
•

.

Đại học Quốc 2 ia Hà N ội

3 Các cán bộ tham gia chính
GS TSKH Phan Tống Sơn Khoa Hoá, Trường Đ H K H TN . ĐHQGHN

PGS TS Vãn N gọc Hướng Khoa Hoá, Trường ĐH K H TN , ĐHQGHN
TS Phan Minh Giang

Khoa Hoá, Trường ĐH K H TN, ĐHQGHN

T h ủ h o ạ t tín h c h ó n g K S T s ố t r é t in vitro :

TS Lê Đình c ỏ n s

Viện Sốt rét, Ký sinh trùns và Côn trùng

TS Nguyễn Duy Sỹ

Viện Sốt rét, Ký sinh trùn" và Côn trun'
>g

TS Trưons Văn Như

Viện Sốt rét, Ký sinh trùns và c ỏ n truní

TS Đoàn Hạnh Nhân

Viện Sốt rét, Ký sinh trùns và Côn trùn'
Ig
Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng

TS N ông Thi Tiến
4

C ác m ục tiê u của đề tà i

* Tìm ra một số loài cây thuốc của V iệt Nam có hoạt tính mạnh in vitro
chống ký sinh trùn? sốt rét.
* Phân lập từ các loài cây này một số sản phẩm thiên nhiên có hiệu lực
in vitro rõ rệt chống ký sinh trùng sốt rét và xác định cấu trúc hoá học
của chúng.
5

C ác nội d u n g n g h iê n cứu chủ yếu của đề tà i

* Khảo sát sự đáp ứnơ in vitro của ký sinh trùns sốt rétPỉasm odium
ỷ'alcipamm đôi với một sô cây thuốc V iệt Nam.
* Phàn lập tinh khiết một số sản phẩm thiên nhiên cho kết quả dương
trong các thử nsh iệm tác dụns chống sốt rét in vitro.

1


* Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất tinh khiết phàn lập được
bằng các phương pháp vật lý hiện đại.
* Đánh giá hoạt tính chống sốt rét in vitro của các hợp chất (sản phẩm)
phân lập được.

Các kết quả đạt được
Đã khảo sát in vitro về tác duns chống ký sinh trùn 2 sốt rét Plasmoclium
f'alciparum - chủng nhậy cũns như chủns kháng với chloroquine - của
13 loài cây thuốc Việt Nam, gồm phần lớn các cày thuốc được dùng
trons y học dân gian của Việt Nam để chữa sốt rét, theo phươns pháp
của s. Thai thong, G. H. Beale và M. Chutmonckonkul [T rans. R. Soc.
Trop. Mecl. Hyg. 77, 228 (1983)]. Bốn trons sô các loài càv nàv đã thể

hiên rõ rệt hoat tính chôn 2 sốt rét tronơ các thừ nshiêm này, đó là các
cây Thườn 2 sơn (Dichroa febrifu °a Lour., Saxifrasaceae), Cúc liên chi
dại (.Parthenium hysterophorus L., Asteraceae), Đa đa (H arrisonia
peiýorata

(Blanco)

Merr.,

Simaroubaceae)

và

Khổ

sâm

(Croton

tonkinensis G asnep., Euphorbiaceae).
Từ lá Khổ sâm (■Croton tonkinensis Gasnep.) đã phân lập được một
ditecpenoid mới thuộc kiểu ent-kauran. Cấu trúc của chất này la 7 a hidroxi-18-axetoxi-£Aư-kaur-16-en-15-on đã được xác định chắc chắn
bằng các phổ 'H và 13c NM R, DEPT, ‘H^H COSY, HMQC, HMBC,
NO ED. Kết quả đánh giá tác dụng chốnơ sốt rét cho thấv hợp chất này
có hoạt tính rõ rệt in vitro chống các dòng nhậy cũn 2 như d òn s kháng
vói chloroquine của P ỉasm odium ỷalciparum .
N goài ra còn phân lập được hai sản phẩm thiên nhiên nữa có hoạt tính
chốnơ sốt rét in vitro rõ rệt từ cây Đa đa (H arrìsonia p e rfo ra ĩa (Blanco)
Merr.) và Khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep.).
Đề tài đã có bốn công trình công bố ở trong và ngoài nước. M ột luận án

Thạc sĩ hoá học đã được hoàn thành trong khuôn khổ đề tài.


7

T in h h ìn h k in h p h í của để tài

Tổng kinh phí được cấp:

60.000.000 đồng (chia làm hai năm 1998 và
1999, mỗi năm 30 triệu đ ổn s)

Đã quyết toán xong toàn bộ.
Các khoản chi của đề tài đã được phán bổ như sau:
tiền

Mục

N ội dunq chi

110

Cung ứns văn phòng

3.799.700

6.33

111

Fax, thư tín

2.084.900

3.47

112

Hôi nshi
»_

1.170.000

1.95

113

C ôns tác phí

1.460.000

2.43

114

Thuê khoán chuvên môn
26.650.000

44.41

6.594.900

10,99

15.840.500

26.40

2.400.000

4.00

Số

(bao 2 ồm cả thử hoạt tính)
116

Tiếp chuyên gia

119

Nguyên liệu, hoá chất, dụns cụ
Quản lý phí
T òng cộn g

(đồ n g )

60.000.000

Tỳ lẻ (%)

99.98 (tức 100)

Kinh phí của đề tài Đặc biệt Đại học Quốc gia Q G -98-05 là hết sức quý giá
đối với đề tài, vì nhờ đó cô n s trình nshiên cứu có ý n sh ĩa về khoa học và
thực tiễn này đã được hoàn thành có chất lượn 2 .
Về tình hình kinh phí của đề tài, có hai đặc điểm:
1) Chi phí cho việc sử hoạt tính chốns

P ỉa sm o d iu m ỷ a ỉc ip a r u m

rất cao, do

cần đến các điều kiện và hoá chất đặc biệt (xem kinh phí cho m ột mẫu

thử MIC và IC50 ở phần phụ lục, đề tài đã phải thử nhiều mảu như
thê);

2) Phần nghiên cứu hoá học cũnơ đòi hỏi nhiều kinh phí, đặc biệt các chiết
tách tinh vi bằng sắc ký các loại, và các khảo sát cấu trúc hiện đại.
D o đó, ngoài nguồn kinh phí rất quí giá do Đại học Q uốc 2 Ĩa cấp, đề tài
cũng đã tranh thủ sự hỗ trợ của một số hợp tác khoa học khác, để có thể
thu được các kết quả khoa học đáng tin cậy.

3


Outline report
1 Project title
Study on bioactive substances from some Vietnam ese m edicm al plants

used in the treatment of malaria
Code-Nr.: QG - 98 -05

2 Head of the project
Prof. Dr. Sc. Phan Tons Son

C ollese
of Natural Science
CVietnam

National

Umversity

Hanoi (V N Ư )

3 M ain participating scientists
C ollese of Natural Science

Prof. Dr. Sc. Phan Tons Son

Vietnam

National

University,

Hanoi (VNU)
A ss. Prof. Dr. Van N so c Huone

VNU

Dr. Phan Minh Gian.c

VNU

k—

V—

E v a l u a t i o n o f t h e e f f e c t in v itr o a g a i n s t m a l a r u i ì p a r a s i t e :

Dr. Le Đinh Cong

Insntute of M alanolos}7, Para5 itolog\
and Entomolo£TV' ƠMPE)

4

Dr. N su y en Duy Sv

IMPE

Dr. Truone Van Nhu

IMPE

Dr. Doan Hanh Nhan

IMPE

Dr. N ong Thi Tien

IMPE

Objectives of the project
* To fmd som e Vietnam ese medicinal plants havmơ sư ong eữ ects in
viti'o against malarial parasites.
* To ìsolate from these plants some natural Products vvhich shov.
remarkable

anúm alanal

activities

chemical sưucture.

4

in vitro and to determine

theư


5

M a in research contents o f the p ro je c t

* ỉn vitro study on the response of the malarial parasite Pỉasmodium
ị'alcipanim to a number o f Vietnam ese medicinal plants.

* Isolation o f pure natural products from plants \vhich show positive
results in the in vitro tests for antimalarial efficacv.
* Determination of the chem ical structure of the isolated pure compunds
by m odem physical methods.
* Evaluation of the antimalanal effects

in vi tro o f the

isolated

compounds (products).
6

Study results
Thirteen Vietnam ese m edicinal plants, consistins of the sreater part of
plants used in the Vietnam ese folk medicine to treat malaria, vvere
studied

by

the

method

of

s.

Thaithons,

G.

H.

Beale

and

M. Chutmongkonkul [Trans. R. Soc. Trop. Med. H v°. 77. 228 (1983)] on
the efficacy in vitro against the chloroquine sensitive as well as the
chloroquine resistant strains of the malarial

parasite Plasmodium

ỷaỉciparum. Four of them showed clear antimalarial effects in these testr
namely

D ichroa

febrifuga

Lour.

(Saxiữagaceae),

Parthenium

hvsterophorus L. (Asteraceae), H arrisonia perforata (Blanco) Merr.
(Simaroubaceae) and Croton tonkinensis Gagnep. (Euphorbiaceae).
From the leaves o f Croton tonlcinensis Gasnep. a new ể^r-kaurane type

diterpenoid

was

isolated.

Its

structure

has

been

unam bisuously

established by 'H and 13c NM R, DEPT, ‘H-'H COSY, HMQC, HMBC,
NO ED

spectra

as

7a-hydroxy-18-acetoxy-ểf2f-kaur-16-en-15-one.

Antimalarial evaluation o f this compound showed a remarkable effect in
vitro on the chloroquine sensitive as w ell as the chloroquine resistant
P la sm odiu m /alcipa ru m strains.
Two further natural products with clear antimalarial effects in vitro vvere
also isolated from H arrisonia perforata and Croton tonkinensis.

The prọịect resulted in 4 publications in Vietnam and abroad. 1 Master
thesis in Chemistry has been com pleted in the framework o f the project.

5


XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA

CHỦ NHIỆM KHOA HOÁ HỌC

CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI

CiS TSKH PHAX TỐNG SƠN

PGS TS NGUYỂN XUÂN TRUNG

XÁC NHẬN CỦA Cơ QUAN CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI

6


P H Ầ N C H ÍN H B Á O C Á O

Lời mở đầu

8

N ội dung và kết quả nghiên cứu

9

Phương pháp tiếp cận

9

H oat tính in v itr o c h ố n g ký sinh trùng sốt rét
Plasmodium/alciparum của một số cây thuốc Việt Nam

11

Nguyên liệu

11

Mẫu thực vật

11

Chủns ký sinh trùnơ

11

Phương pháp nghiên cứu

11

Điểu chế phần chiết của mẫu thực vật

11

Chuẩn bị mẫu thử

12

Chuẩn bị mẫu nuôi và thử hoạt tính

12

Kết quả và nhận xét

12

Tóm tắt kết quả chính của mục 2.2

16

Phân lập và khảo sát cấu trúc hoạt chất

17

Phân lập và khảo sát cấu trúc hoạt chất từ lá khổ sâm
( C ro ĩo n to n k in e n sis G agn ep ., E uphorbiaceae)

17

Nguyên liệu thực vật

17

Phương pháp và thiết bị

17

Phân lập và khảo sát cấu trúc hoạt chất

18

Sự đáp úng in vitro của ký sinh trùng sớt rét Plasmodiiữĩi
/a lc ip a n ơ n

đôi với 7a-hidroxi-1S-axetoxi-^ư-kaur-16-erì-15-on

19

Phân lập các sản phẩm khác có hoạt tính chông
ký sinh trùng sốt rét

19

Tóm tắt các kết quả chính của mục 2.3

20

Công bố và đào tạo

20

K ế t luận

21

Tài liệu tham khảo

22

Phần phụ lục

7


1

LỜ I M ỏ ĐẦU

Vấn đề nghiên cứu các thuốc mới đê điều trị bệnh sốt rét có một tầm
quan trọng đặc biệt. Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (World Health
Organisation, W HO) ký sinh trùng sốt rét 2 ây ra nhiều bệnh hoạn và tử
vong hơn bất cứ tác nhân gây bệnh nơười nào khác đã được biết đến [ 1 ].
Hiện nay ký sinh trùng sốt rét còn đang đe dọa khoảng một nửa dân số thế
giới và ước tính có tới trên 20 0 triệu người mấc bệnh sốt rét kinh niên, và
mỗi năm có khoảng 150 triệu ca bệnh mới [2]. ơ

Mệt Nam. bệnh sốt rét

một lần nữa lại trở thành một căn bệnh phổ biến. Bệnh 2 ây ra bởi ký sinh
trùns; Plasm odium /alcipa ru m chiếm 70 đến 80% các ca bệnh sốt rét. Loài
ký sinh trùng này thể hiện tính đề khán 2 ngày càn s tăns đối với
chloroquine cũng như đối với các thuốc chống sốt rét mới và sự phối hợp
các thuốc. Vì vậy song song VỚI việc nghiên cứu các vacxin chòng sốt rét,
rất cần tìm kiếm các tác nhân điều trị hoá học mới với cơ chế tác dụng mới.

Thực vật là nguồn cung cấp nhiều tác nhàn điều trị hoá học chống sốt
rét có hiệu quả cao, mà quinin (phân lập từ các loài Cinclìona. Rubiaceae)
và artemisinin (từ cây Thanh cao hoa vàng (.Artemisia ann ua, Asteraceae) là
những thí du điển hình nhất. Vì vây hướng nshiên cứu tìm kiếm các thuốc
chống sốt rét mói từ nguồn tài nsuvèn thực vật được siới khoa học quốc tế
rất quan tâm [3,4].
Y học dân tộc của V iệt Nam sử dụns nhiều loài cây vào việc điều trị
bệnh sốt rét [5,6]. Trong nhữns năm gần đày nhiều cơ sở tập truns nghiên
cứu chiết xuất artemisinin từ cây thanh cao hoa vàng. V iệc nghiên cứu tìm
kiếm các thuốc chống sốt rét mới từ các loài thực vật khác còn chưa được
đẩy mạnh. Một vài nơi, như Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng, có
thử thăm dò tác dụng của một vài cây được dùng chữa sốt rét, nhưng khống
phân lập hoạt chất.
Đ ề tài này đã tiến hành khảo sát in vitro về tác dụng chông ký sinh
trùng sốt rét P lasm odiu m ỷalciparum của một sô loài cây thuốc Việt Nam,
bao gồm một phần khá lớn các loài đã được y học dân tộc của Việt Nam sử
dụng điều trị sốt rét; trên cơ sở các kết quả nhận được đã chọn ra loài cây
thích hợp từ đó phân lập hoạt chất để khảo sát về các mặt cấu trúc hoá học
và hoạt tính sinh học. Đề tài đã đóng góp những kết quả nghiên cứu mới

8


cho lĩnh vực nghiên cứu các chất thiên nhiên có hoạt tính chôn 2 ký sinh
trùng sốt rét từ nguồn thực vật V iệt Nam.

2 NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN cứu
2.1 P hương ph á p tiế p cận

Công trình nghiên cứu đã được tiên hành theo một phươns pháp tiếp

cận hiện đại. V iệc phân tách các hỗn hợp và phân lập các họp chất được
thực hiện theo con đường "được hướns dẫn bời các phép thừ sinh học”

(Bioassay-guided isolation o f Natural Products), với việc sử dụnơ các
phương pháp phân tách hiện đại (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột. sắc ký cột
nhanh, sắc ký lỏnơ trunơ áp, sắc ký lỏnơ hiệu lực cao). V iệc khảo sát cấu
trúc hóa học được thực hiện nhờ các phươns pháp vật lý hiện đại (phổ khối
lượng, phổ hồng ngoại, phổ cộnơ hường từ hạt nhân proton và cacbon 13
một chiều và hai chiều).
V iệc thử hoạt tính chốnơ ký sinh trùnơ sốt rét đã được tiến hành một
cách chuẩn xác vói sự tham gia và cộnơ tác chặt chẽ của V iện Sốt rét, Ký
sinh trùng và Côn trùng.
Chúng tôi đã xây dựns phương pháp chuns nshiên cứu các cây thuốc
được dùng trons y học dân tộc cuả V iệt Nam để điều trị bệnh sốt rét được
nêu ở Sơ đồ 1 (không có phần N sh iên cứu lâm sàng nêu trons sơ đồ) để áp
dung trong khuôn khổ đề tài này.

9


Sơ đồ 1: PHƯƠNG PHÁP C H U N G N G H IÊ N c ứ u
các cây th u ố c d ù n g tro n g y học dàn tộc của V iệ t N am
đê điểu t r ị bệnh sốt ré t

10


2.2

H oạt tính in vitro chỏng ký sinh trùng sốt

rét P lasm odiu m

ý a lciparu m của một sò cày thuốc Việt Nam
N g u yê n liệu
Mẫu thực vật
Đã tra cứu các tài liệu y dược học dân tộc của Việt Nam về các cây đã
được nhân dân sử dụng điều trị sốt rét 1 để chọn ra các cây dùns cho nghiên
cứu. Mẫu thực vật đã được GS Vũ Văn Chuyên, Trườns: Đại học Dưọc, và
TS Trần N gọc Ninh, Viện Sinh thái và Tài nsuvẻn Sinh vặt. Truns tàm
Khoa học tự nhiên và Côns nshệ quốc gia, giám định. Đã dùns đúng bộ
phận cây dù ng làm thuốc để điều chế phần chiết.
Chúnẹ Ả.T sinh tnìno
Các chúns ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparu m do Viện Sốt
rét, Ký sinh trùns và Côn trùns cuns cấp, gồm:
Chủns nhậy với chloroquine của Thái Lan (T966),
Chủns kháng với chloroquine của Thái Lan (K I),
Chủns; kháns với chloroquine của Việt iNam (F25).
P h ư ơ ĩig p h á p n g h iê n c ía i

Điều c h ế phần chiết của mấu thực vật
Mẫu-thực vật sau khi diệt men được thái nhỏ? sấy khò ờ 4 5 °c , rồi xay
thành bột m ịn2. Lấy 50g bột nguyên liệu khô, đun hồi lun cách thuỷ với
70ml etanol 96% trons 7 giờ, rồi thu lấy dịch chiết,ô n lại quá trình chiết
vói etanol nón s này thèm hai lần nữa. Gộp các dịch chiết lại với nhau, cất
loại dung m ôi trên bếp cách thuỷ, cuối cùng sấy khô ở nhiệt độ thấp (-70°C)
đến khi khô ròn, thu được phần chiết etanol. Càn p h in chiết này và tính
hiệu suất so với khối lượns của nsuyênliệu khô.
Tiến hành tươngc, tư,
nhưn.s

dùng
nước cất làm dung m ỏi, ta— thu được
• 7
1—•
^
phần chiết nước của mẫu thực vật.

1 Trừ các cây Cúc liên chi dại và Hà thủ ô Griffith.
2 Riêng lá Thưcmơ sơn đã được phơi khò rồi rửa sach băng rươu trước khi sấy khô và xay
thành bột.


Chuẩn bị mẫu thử
Hoà tan các phần chiết mẫu thực vật trons duns môi thích hợp (xem
bảng 4) thành các dung dịch có nồng độ 2 ,5 m 2 /ml. Lọc các duns dịch này
qua màng lọc có kích thước lỗ 3um , sau đó lọc vô trùns qua màng lọc có
kích thước lỗ 0 ,2 2 p.m.
Từ dung dịch gốc thêm môi trườns để pha thành các duns dịch thử
(mẫu thử) có nồng độ: 0,5; 2,5; 5,0; 10; 20; 50; 100; 200: 300: 400; 500:
10 0 0 ug/m l.

Chuẩn bị mẫu nuôi và thử hoạt tính
N uôi cấv Plasmodium / 'alciparum liên tục tronc môi trườns đầy đủ
(gồm R PM I1(W0, Gentamycin, Hepes, duns dịch NaHCO? 5% và 10% huyết
thanh nơười) theo phươnơ pháp bình nến của w . Traser và J. B. Jensen
[7,8].
Sau đó tiến hành khảo sát sự đáp ứns của Plasm odium /alciparu m đối
với các duns dịch thử (mẫu thử) theo phươns pháp của s. Thaithonc, G. H.
Beale và M. Chutmonskonkul [9]. Các thử nshiệm được tiến hành trẽn
phiến nhựa 96 lỗ. Mật độ ký sinh trùng được đưa vào khi thử thuốc là từ 0,4

đến 0,7% hồng cầu nhiễm. Hematocrit 5%. Sau 24 21 Ờ và 48 2 ĨỜ thay môi
trường mói không có thuốc (với ống chứns) hoặc mòi trirờns có nống độ
thuốc tương ứng. Sau 72 siờ lấy ra làm lam siọt mỏnơ. Nhuộm Giemsa, soi
trên kính hiển vi và đếm để xác định tỷ lệ hồng cầu nhiễm ký sinh trùng.
M ỗi mẫu thử được thử tối thiểu 3 lần. Nếu kết quả không giống nhau
thì thử nghiệm được tiến hành lại. đếm số lượng ký sinh trùng / 10 .0 0 0
hổng cầu để xác đinh MIC (M inim um Inhibitory Concentration).
Có thử đối chứng với các dung môi hoà tan các phần chiêt.
K ế t q u ả và nh ận x é t
Kết quả chiết các mẫu thực vật được nêu ở bảng 1.


Bảng 1

K ế t quả ch iế t các m ảu th ự c vậ t

Chiết bằns etanol
Số
thứ
tự

Tên cây

1

Dây ký ninh
(Tinosporu crispa L. Miers.)

2

Khối
Bộ
lượn 2 Ký
phận
mẫu hiệu
dùn2
(g) mẫu

Chiết bầng nước

Khối
Khỏi
lượng Hiệu Ký lượng Hiệu
phần suất hiệu phần suất
chiết (^ y mẫu chiết (%)'
1
(g)
(g)

Thân
dày
leo

50

la

2.0

4.0

lb

1,25

95 ỉ

Thường sơn
ó
(Dichroa febrifuga Lour.)

Lá

50

2a

1.5

3,0

2b

0,52

1,04

3

Hồns bì núi

('Clausena indica (Dalz.) Oliv.)

Lá

50

3a

1,55

3.1

3b

0,8

1,6

4

Na
(Anno/ia squamosa L.)

Lá

50

4a

1,72 3.44 4b

0,68

1,36

Lá
lẫn

50

5a

1,6

3

5b

0,75

1,5

Lá

50

6a

1.5

3.0

6b

0,6

1,2

Đa đa
(Han isonia peiýorata (Blanco) Merr.)

Lá

50

7a

1,4

2.8

7b

0,55

Cây sữa

Vỏ

(.Alstonia scholaris (L.) R. Br.)

cây

50

Sa

1,7

3-4

8b

0,7

1,4

Hà thủ ô đỏ
{Polygonum multiỷlorunỉYhunb.)

Rễ

50

9a

6,5

13,0 9b

7,2

14,4

50

lOa

2,6

5,2

lOb

2,8

5,6

50

1 la

3,0

6,0

llb

2,4

4,8

50

12 a

5,6

1 1 ,2

12 b

6,0

12,0

50

13a

2,7

5.4

13b

1,3

2 ,6

Ngải cứu
5
(Artemisia vuỊgaris L.)
6

7
8

9
10
11
12

13

Cúc

liên chi dại

(Parthenỉưm lìỴSterophorus L.)

Cỏ

roi ngựa

ngọn

củ
Hoa

(Verbena ojficinalis L.)

và lá

Thảo quả
{Amomum aromaticum Roxb.)

Ruột

quả

Hà thủ ô Griffĩth

Rễ

(,Streptocaulon griffĩthii Hook.f.)

củ

Khổ sâm cho lá
(C ro ton

tonkinensis Gagnep.)

ị

Lá

1 So với khối lượng nguyên liệu khò

13

■•'Ị


Đ ể điều chê các dung dịch gốc, đã hoà tan các phần chiết trons dung
môi thích hợp tương ứng, như etanol, đimetyl suníoxit (DM SO). nước, hoặc
hoà tan ngay trong môi trường RPM I 1640 (xem bảns 4). Ảnh hưởns của
etanol và của DMSO lên sự phát triển của ký sinh trùns Plasmodium
ị'alciparum đã được khảo sát và nêu ờ các bản 2 2 và 3 .
Bảng 2 Ảnh hưởng của etanol lên sự phát triển cùa
P lasm od iu m /a lc ip a ru m
Mât
. đô k\/ sinh trùns {% hổns cầu nhiẻm)

Nồng đô etanol
trong môi trường

Chủng T966

Chủns KI

Chủns F25

1/20 0

15,5

77
' ĩ —

130

1/10 0

10,7

6.8

13,3

1/50

7,1

3,8

5.5

1/32

2,5

0,4

3,6

1 o

->

1/25

-

-

-

1/20

-

-

-

B ản ° 3 Ảnh hương của D M SO lèn sự phát triến cua
P lasm o diu m f'alciparum

Nồng độ DMSO

Mật độ ký sinh trùng {% hồns cầu nhiễm)

trong
o môi trường
w

Chủng T966

Chủns KI

Chủng F25

1/10 0 0

14,0

9,5

10,6

1/500

9,1

10.0

8,4

1/250

8,6

6,6

1/160

8,6

7,5

1/125

0,75

5,0

7,9
9,7
5,8

1/10 0

-

2,9

5,7

Bảng 4 tổng hợp các kết quả khảo sát sự đáp ứns của Plasmodium
ị'alciparum đối với các dung dịch thử (mẫu thử), với các số liệu MIC nhận

được thông qua việc khảo sát sự đáp ứng đối với các mẫu thử có nồng độ
giảm dần.

14


Bảng 4 Sự đáp ứng của P la s m o d iu m /a lc ip a r u m đối với các mảu thư

Mẫu

Dung môi hoà

thử

tan

Nồng độ

MIC (|ig/ml)
T966

duns mỏi

KI

F25

tại MIC

la

Etanol 99%

lb

RPMI1W0

2a

Etanol 99%

0.5

0,5

0,5 1/20 0

2b

RPMI1W0

2,5

2,5

2,5

3a

Etanol 99%

3b

RPMI1640

4a

DMSO

4b

RPMI1W0

5a

DMSO

5b

RPMI1W0

6a

DMSO

6b

Nước cất hai lần

7a

100

100

1.000

1.000

1.000

200

200

200

1.000

1.000

1.000

o
o

100

300

300

500

500

500

200

200

200

1.000

1.000

1.000

30

30

30

100

100

100

DMSO

15

15

15

7b

Nước cất hai lần

60

60

60

8a

DMSO

500

500

500

8b

Nước cất hai lần

>1.000

>1.000

>1.000

Ghi chú
....

1/20 0

1/50
1/125
1/250
1 / 2.000

1/4.000
1/40
ờ 1.000us/ml KST
,

vãn phát triên

DMSO
lOa DMSO

1.000

1.000

1.000

500

500

500

lOb Nước cất hai lần

>500

>500

>500

9a

1/100
1/40
ờ 500|ig/ml KST
vẫn phát triển

1 la

DMSO

200

200

200

llb

Nước cất hai lần

400

400

400

500

500

500

>500

>500

>500

1 2 a DMSO
12 b Nước cất hai lần

1/800
1/40
ở 500|is/m l KST
vẫn phát triển

13a Etanol 99%

62,5

62,5

62,5

13b Nước cất hai lần

100

100

100

N hận xét
Phần chiết nước của các mẫu thực vật được khảo sát (xem bảng 4)
thường không thể hiện hoạt tính rõ rệt, hoặc có hoạt tính thấp hơn nhiều so
với phần chiết etanol của mẫu tương ứng. Chỉ có mẫu thử 2b (phần chiét


nước lá Thường sơn) là có tác dụng rõ rệt đối với Plasm ođium ỹalciparum
cả chủng nhậy lẫn chủng kháng, MIC = 2,5 Ịig/ml. Mẫu 7b (phần chiết

nước lá Đa đa) ức chế sự phát triển của ký sinh trùns ở nồns độ 60|W mlmẫu 6 b (phần chiết nước lá Cúc liên chi dại) ờ nồns độ lOOus/ml. Các phần
chiết nước khác cần nồng độ cao hơn để ức chế sự phát triển của ký sinh
trùng.
Trong số các phần chiết etanol, các mẫu thử 3a (phần chiết etanol lá
Hồng bì núi, MIC = 200|ig/m l), 4a (phần chiết etanol lá Na, MIC =

300|ig/m l), 8 a (phần chiết etanol vỏ Cây sữa, MIC = 500ụg/m l), 9a (phần
chiết etanol rễ Hà thủ ô đỏ, MIC = 1.000ug/m l). lOa (phần chiết etanol hoa
và lá Cỏ roi ngựa, MIC = 500jag/ml) và 12a (phần chiết etanol rễ Hà thù ô
Griffith, MIC = 500|ig/m l) đều có MIC ở nồn s độ trùns với non? độ ức chê
của dung m ôi (etanol hoặc DM SO, xem các bảnơ 2, 3 và 4 ). vì vậy khỏn^
thể được xem là có tác dụng.
Các mẫu thử la (phần chiết etanol thân Dây ký ninh, MIC = 100200uơ/m l), 5a (phần chiết etanol lá lẫn n sọn Ngải cứu, MIC = 200ịig/rnl)
và 1 la (phần chiết etanol ruột Thảo quả, MIC = 150-200uơ/m l) thể hiện tác
dụng ức chế ký sinh trùng, tuv khônơ thật mạnh.
Các mẫu thử 2a (phần chiết etanol lá Thường sơn, MIC = 0 ,5 uơ/ml),
6 a (phần chiết etanol lá Cúc liên chi dại, MIC = 30u2/m l), 7a (phần chiết

etanol lá Đa đa, MIC = lS u s/m l) và 13a (phần chiết etanol lá Khổ sâm,

MIC = 62,5|ig/m l) có tác dụng ức chế rõ rệt sự phát triển của Plasm odium
/ 'alciparum, cả chủng nhậy lẫn chủng kháng.
Tóm tắt k ế t q u ả chính của m ụ c 2.2
Đã khảo sát in vitro về tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét
Pỉasmodium /a lc ip a ru m (chủng nhậy và chủng kháng với chloroquine) của
13 loài cây thuốc V iệt Nam. Kết quả cho thấy phần chiết etanol của các
mẫu thực vật có tác dụng ức c h ế in vitro đối với Plasmodium f.alciparum
mạnh hơn so với phần chiết nước tương ứng. Cả phần chiêt etanol lẫn phần
chiết nước của lá Thường sơn (D ichroa febrifiiga Lour.) đều có tác dung
manh lên chủng nhậy cũng như chủng kháng với chloroquine. Các phần
chiết etanol của lá Cúc liên chi dại (parthenium hysterophorus L.), lá Đa đa

16


(Harrisoma p e r/o ra ta (Blanco) Merr.) và lá Khổ sâm (C roĩon ĩonkinensis

Gagnep.) cũng thể hiện hoạt tính lìì vi tro rõ rệt lèn Pỉasm odium /alciparum ,
cả chủng nhậy lẫn chủng kháns với chloroquine.
2.3 P hân lậ p và kh ả o sát cấu tr ú c hoạt chất

Phân lập và khảo sát cấu trúc hoat chất từ lá K hổ sâm (Croton
tonkinensis G agn ep ., E u ph orb iaceae)
Sau khi cân nhắc dựa trên cơ sở hoạt tính, dược lý học dãn tộc, ncuổn
nguyên liệu và hiệu suất các phần chiết, chúns tôi đã chọn lá Khổ sâm làm
nguyên liệu để tiến hành phàn lập hoạt chất.
N g u y ê n liệ u th ự c v ậ t

Lá cây Khổ sâm (Croton tonkinensis Gasnep.) được thu thập ờ ngoại
thành Hà Nội tronơ thời kỳ cây đan 2 ra hoa. Mẫu thực vật đã được TS Trần
Ngọc Ninh, V iện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Truns tàm Khoa học tự
nhiên và Công nghệ quốc gia, siám định.
P h ư ơ n g p h á p và th iế t bị

Độ quay cực được đo trên máy Polartronic D (Schmidt T Haensch).

Các phổ hổng ngoại (LR) được shi trên thiết bị Nicolet Impact-410 FT-IR
Spectrometer (viên nén KBr).
Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H NM R (400M H z) và 13c NM R
(100M H z) được ghi trên thiết bị A M X -400 spectrom eter trong CDCI3, các
độ chuyển dịch hoá học ( 5 ) được thôns báo bằng ppm với các tín hiệu cua
dung môi làm chất chuẩn nôi. Đã tiên hành các khảo sát phổ NM R một
chiều (*H N M R , 13c N M R , DEPT, NOED) và hai chiều (COSY, HMQC và
HMBC).
Các phổ khối lượng (EIMS) được ghi trên thiết bị MS 9 0 2 Spectrometer.
Silica gel (M erck 6 0 -1 0 0 |im ) được dùng cho sắc ký cột (C Q , và silica gel
(Merck 15-40p.m) được dùns; cho sắc ký cột nhanh (F Q . sắ c ký lớp mỏng

(TLC) được thực hiện với các bản silica gel tráng sẵn (M erck. DC-Alufolien
60 F254).
, ỉ
M ị

'.

r

• .
*

/ t o u ?
17

V ' 1
'

* ĩ ỆLị


P h ân lập và kh ả o sát cấu trúc h oạt chất
Sau khi hong khô ngoài không khí, lá cây Khổ sâm được sấv ờ 4 0 ° c
đến khô ròn, rồi xay thành bột. Bột lá khô này được chiết chọn lọc với các
dung môi khác nhau để thu các phần chiết tươns ứns. Các phấn chiết được

phân tách nhiều lần bằng sắc ký cột và sắc ký cột nhanh trên silica gel với
các hệ dung m ôi rửa giải có độ phân cực tãns dần. Đ ể định hướns cho việc
phân lập, một số phân đoạn đáns lưu ý đã được thừ hoạt tính in vitro chôn 2
ký sinh trùng P lasm odium ỷaỉciparum (B ioassay-gu ided fractionation).

Kết quả đã phân lập được - bên cạnh nhiều hợp chất khác - chất
ditecpenoid mới 1 .
Chất rắn vô định hĩnh
[ a ]D16 -121°(c 1.0, CHC13)
HR-EIMS: m/z 360,2311 (M + )

(Tính được cho C „ H 3-,04 360,2300)
EIMS m/z (cường độ tương đối): 360 (15), 332 ( 8 ), 269 (10), 227 ( 6 ), 161
(11), 135 (27), 105 (61), 91 (59), 67 (59), 55 (73), 43 (100), 41 (72), 39
(56).
IR: v m3X (cm-1) 3482, 1735, 1729, 1649, 1387, 1367, 1252.
Cấu trúc của ditecpenoid mới này đã được khẳnơ định là 7a-hidroxi18-axetoxi-e/?f-kaur-16-en-15-on (1) nhờ các khảo sát kỹ lưỡng về phổ
Cộng hưởng từ hạt nhân:
‘H NM R,

N M R , DEPT 90, DEPT 135, ‘H^H COSY, HMQC, HMBC,

các thí nghiệm NO ED.

Hóa học lập thể ent được thừa nhân đã được ủng hộ bởi độ quay cực
âm của hợp chất

1 (xem

ở trên).

18


S ự đáp ứng in

vitro của k ý sinh trừng sốt rét Plasrnodium

/ alciparum đ ố i với 7 a-hidroxi-18-axetoxi-en t-kau r-16-en-15-on (1)
Đã đánh giá hoạt tính chống sốt rét in vitro của 1 đối vói ký sinh trùng
Pỉasmodium ýaỉciparum (chủng T 966 nhậy với chloroquine. và chùnơ KI
kháng với chloroquine của Thái Lan) theo phươns pháp của s. Thaithonơ,
G. H. Beale và M. Chutmongkonkul [9]. Kết quả được shi ờ b ỉn s 5.
Bảng 5 Đ á n h giá hoạt tính chòng sốt rét
của 7 a -h id roxi-18-ax etoxi-ể/zí-k au r-16-en -15-on ( 1 )
Chủns Plasmodium falciparum
T966
(nhậy với chloroquine)

KI
(kháns với chloroquine)

MIC (|!g/m l)

31,20

31.20

IC50 (|ig/m l)

16,47

17.34

Phân lập các sàn phẩm khác có hoạt tính

chốnơ

ký sinh trung sót rét

Bằng các phươns pháp chiết chọn lọc, đã phân lập một số sản phẩm

khác có hoạt tính chống P ỉasm odium /aỉciparum in virro:
Từ lá cây Đa đa (H arrisonia perỷorata (Blanco) Merr.): Sản phẩm Đ3; hiệu
suất 0 , 1 2 % so với lượng nguyên liệu khô).
Từ lá cây khổ sâm (C roton tonkinensis Gaơnep.): Hỗn hợp ancaloid C rA
(hiệu suất 0,32 % so với lượng n suyên liệu khô).
Hoạt tính chống Plasmodiumỷaỉcipamm của Đ3 và CrA được nêu ở bảng 6 .

Bảng 6

Đ á n h giá h o ạ t tín h chống sốt ré t của Đ 3 và C r A

Chủng

P ỉa sm o d iu m /a lc ip a r u m

T 966

KI

(nhậy với chloroquine)

(kháns với chloroquine)

Đ3, MIC (|ig/m l)

250

250

CrA, MIC (n g/m l)

62,5

62,5

19


T ó m tá t các k ế t q u ả ch ín h của m ục 2.3

Từ lá cây Khô sâm (Cvoton tonkineiìsis G asnep., Euphorbiaceae) đã
phân lập được m ột ditecpenoid mới thuộc kiểu ể/ư-kauran có hoạt tính
chống Plasmodium f'alciparum rõ rệt; cấu trúc của chất này đã được xác
định chủ yếu băng phương pháp phổ Cộns hưởng từ hạt nhàn proton và
cacbon 13 là 7a-hidroxi-18-axetoxi-ể/zf-kaur-16-en-15-on.
Ngoài ra đã phân lập được một số sản phẩm cũns có hoạt tính chône
ký sinh trùng sốt rét Plasm odium /alciparum : sản phẩm Đ3 từ lá cây Đa đa
(Harrisonia perỷorata (Blanco) Merr., Simaroubaceae), hỗn hợp ancaloid
CrA từ lá cây Khổ sâm (Croton tonkinensis Gasnep.).

3

CÔNG BỐ VÀ Đ À O TẠO

* Đề tài đã có 4 c ô n s trình công bò ở trons và ngoài nước:

1. Phan Tống Sơn, Văn N gọc Hướnơ, Nguyễn Văn Đậu, N suyẻn Duv Sỹ,
Ngô Việt Thành, N su y ễn Mai Hươns, Trươns Văn Như, Nồng Thị Tiến,
Trần Bạch Kim, Gerd Lindsrerụ R olf Johansson,

Sự đáp ứng in vitro của ký sinh trùns sốt rét Plasm odium ỷalcipanim đổi
với một số câv thuốc ở V iệt Nam,
Tạp chí Dược học 38 (1), 1998, 13-17.
2. Phan Tống Sơn, Văn N gọc Hướns, Phan Minh Gians, Walter c . Taylor,
Đóng góp vào việc nghiên cứu hoạt chất sinh học từ cày khổ sâm cho lá
(Croton tonkinensis G agnep., Euphorbiaceae),
Tạp chí Hoá học 37 (4), 1999, 1-2.
3. Phan Minh Gianơ, Phan Tong Son and Walter c . Taylor,
A N ew Diterpenoid with Antimalarial Activity from C roton tonkinensis
Gagnep. o f V ietnam ,
Tenth Asian Sym posium on Medicinal Plants, Spices and Other Natural
Products (ASOM PS X ), 18-23 November 2000, Dhaka, Bangladesh, OP 97.
4. Phan Tong Son, Phan Minh Giang and Walter c . Taylor,
An ể/ư-kaurane-type diterpenoid from Croton tonkinensis Gagnep..
Australian J. o f Q iem istry, in the press.

20


* Một luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài:
Học viên: Lê H uyền Trâm
Đề tài luận án Thạc sĩ: N ghiên cứu hoạt chất sinh học trons cây Khổ sâm
0Croton tonkinensis Gagnep.) và cây Đa đa (.Harrisonia perýorata ).

4

KẾT LU ẬN

Đã khảo sát in vitro về tác dụng chống ký sinh trùns sốt rét Plasmodium
ịaỉciparum - chủng nhậy cũng như chủns kháns với chloroquine - của
13 loài cây thuốc V iệt Nam , 2 ổm phần lớn các cây thuốc được dùng
trong y học dân gian của V iệt Nam để chữa sốt rét, theo phươnc pháp
của s. Thaithong, G. H. Beale và M. Chutmonskonkul [Trans. R. Soc.
Trop. Med. Hvg. 77, 228 (1983)]. Bốn trons số các loài càv này đã thể

hiện rõ rệt hoạt tính chốns sốt rét trong các thử nshiệm này, đó là các
cây Thườns sơn (Dichroa febrifuga Lour., Saxiữagaceae). Cúc liên chi
dại (Parthenium hysterophorus L., Asteraceae), Đa đa (.Harrisonia
perforata

(Blanco)

M eư .,

Simaroubaceae)

và

Khổ

sàm

(Croton

tonkinensis G asnep., Euphorbiaceae).
Từ lá Khổ sâm (Croton ĩonkinensis Gagnep.) đã phân lập được một
ditecpenoid mới thuộc kiểu ent-kauran. Cấu trúc của chất này là 7 a hidroxi-18-axetoxi-e«í-kaur-16-en-15-on đã được xác định chắc chấn

bằng các phổ ‘H và 13c NMR, DEPT, ‘H -lH COSY, HMQC, HMBC,
NOED. Kết quả đánh giá tác dụng; chống sốt rét cho thấy hợp chất này
có hoạt tính rõ rệt in vitro chống các dòng nhậy cũng như dòng kháng
với chloroquine của P lasm odium ỷalciparum .
Ngoài ra còn phàn lập được hai sản phẩm thiên nhiên nữa có hoạt tính
chống sốt rét in vitro rõ rệt từ cây Đa đa (H arn sonia perforata (Blanco)
Merr.) và K hổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep.).
Đề tài đã có bốn công trình công bô ở trong và ngoài nước. Một luận án
Thạc sĩ hoá học đã được hoàn thành trong khuôn khổ đề tài.


5

T À I L IỆ U T H A M K H Ả O

1. World Health Organisation,

W eekly

ep idem ioỉogical

record

56, 281

(1984).

2. G. Davidson, N e w Scientist 96, 1117 (1982).
3.

c. F.

Spencer, F. R. Kontuszy, E. F. Rogers, J. Shavel. Jr.. N. R. Easton,

E. A. Kaczka, F. A. Kuehl, Jr., R. F. Phillips, A. Walti and K. Folkers,
Lloydia 10, 145 (1947).
4. M. J. 0 'N eill, D. H. Bray, p. Boardman, J. D. Phillipson and D.

c.

Warhurst, Planta M edica 1985, 394.

5. Đỗ Tất Lợi, N hững cây thuốc và vị thuốc Việt N am . NXB Khoa học và
Kỹ thuật (1991).
6 . Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học (1997).

7. w . Trager and J. B. Jensen, Science 193, 673 (1976).
8 . J. B. Jensen and w . Trager, J . Parasitol. 63, 883 (1977).

9. s. Thaithons, G. H. Beale and M. ChutmonekonkuỊ Trans. R. Soc. Trop.

Med.Hyg. 7 7 , 2 2 8 (19 83 ).

Hà Nội nsàv 28 th ỉn s 12 nãm 2000
Chủ trì đề tài

GS TSKH Phan Tỏng Sơn

PHAN PHỤ LỤC
C Á C C Ô N G T R ÌN H Đ Ã C Ô N G B ổ

MỘT SỐ KẾT Q U Ả T H Ử HOẠT TÍNH IN VITRO CHUNG
KÝ SINH TRỪNCÌ S ố T RÉT PLASM ODIƯM FALCW ARƯ M