TRỰC KHUẨN GRAM DƯƠNG SINH NHA BÀO

TS. Phạm Hồng Sơn *** Giáo trình Vi sinh vật học thú y *** Huế 2006

77
Chương 8
TRỰC KHUẨN GRAM DƯƠNG SINH NHA BÀO
A. CHI BACILLUS (TRỰC KHUẨN GRAM DƯƠNG HIẾU KHÍ SINH
NHA BÀO)
I. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CHI BACILLUS
1. Phân loại
Phân loại các Bacillus được trình bày ở bảng I-34. Đây là những vi khuẩn
to, hình que, Gram dương, hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, hình thành nha bào.
Chi này có trên 34 loài nhưng chỉ có 3 loài có ý nghĩa trong lĩnh vực thú y là B.
anthracis, B. cereus và B. larvae (gần đây xếp loại vào chi mới thành
Paenibacillus larvae), cùng 1 loài tương tự là vi khuẩn bệnh Tyzzer (B. piliformis)
không nuôi cấy được thường được xếp vào nhóm này vì lý do thuận tiện.
Bảng I-34. Các tính trạng giám biệt loài chủ yếu thuộc chi Bacillus

Loài
Tính trạng
B.
anthracis
B.
cereus
B.
thuringiensis
B.
megaterium
B.
subtilis
B. (P.)

larvae
Rộng (μm) 1,0 - 1,2 1,0 - 1,2 1,0 - 1,2 1,2 - 1,5 0,7 - 0,8 0,5 - 0,6
Dài (μm) 3,0 - 5,0 3,0 - 5,0 3,0 - 5,0 2,0 - 5,0 2,0 - 3,0 1,5 - 6,0
Nha bào in vivo - - - - - +
Di động - + + + + +
Hình
thái
Giáp mô in vivo + ± - - - -
ĐK yếm khí + + + - - +
Lysozyme 0,001% + + + - v +
7% NaCl + + + + + -
Phát
triển
Citrate v + + + + -
Hoàn nguyên nitrate + + + v + v
Phản ứng VT (verotoxin) + + + - + -
Arabinose - - - v + v
Xylose - - - v + -
Mannit - - - v + +
Tinh bột + + + + + -
Casein + + + + + +
Phản ứng noãn hoàng + + + - - -
Pearl test (chuỗi ngọc)
(penicillin 0,5 UI/ml)
+ - - - - -
Cảm thụ phage γ + - - - - -
Phản ứng Ascoli + + + + ± +

2. Hình thái
Các là những trực khuẩn Gram dương lớn (0,5 - 2,5 × 1,2 - 10 μm), hình

thành nha bào đề kháng cao với nhiệt. Thông thường là những chu mao khuẩn
nhưng cũng có những trường hợp mất khả năng hình thành tiêm mao.
Trực khuẩn nhiệt thán B. anthracis không có khả năng hình thành tiêm
mao nhưng hình thành giáp mô khi ở trong cơ thể động vật. Giáp mô có thể
nhuộm nha bào bằng phương pháp Hiss (xem Klebsiella...), hoặc bằng xanh

TS. Phạm Hồng Sơn *** Giáo trình Vi sinh vật học thú y *** Huế 2006

78
methylene.
3. Tính trạng sinh hóa
Đây là những vi khuẩn dinh dưỡng hữu cơ hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện,
phát triển tốt trên môi thường thạch thường dưới điều kiện nuôi cấy hiếu khí.
Phản ứng catalase dương tính. hàm lượng G+C (mol%) là 32 - 69.
4. Tính gây bệnh
Các trực khuẩn chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, phần nhiều là
những vi khuẩn hoại sinh sống dựa trên nguồn chất hữu cơ sẵn có trong đất,
nước,... các vi khuẩn gây bệnh tồn tại trong đất ở dạng nha bào giữ được tính
gây bệnh trong thời gian dài.
Ở trực khuẩn nhiệt thán, việc hình thành giáp mô dạng polypeptide từ
acid
D
-glutamic phi tự nhiên do một plasmid 60 MDa chi phối và việc sản sinh 3
độc tố do plasmid 110 MDa chi phối là yếu tố phù thũng (edema factor - EF,
factor I), kháng nguyên phòng ngự (protective antigen - PA, factor II) và yếu tố
gây chết (lethal factor - LF, factor III) là trọng yếu. EF và LF đơn độc không thể
hoạt hóa, một trong hai chất này biểu hiện hoạt tính mạnh khi cho thêm PA.
B. cereus sản sinh độc tố gây nôn, enterotoxin gây tiêu chảy,... còn
Paenibacillus larvae B. larvae (tên cũ B. larvae) sản sinh enzyme phân giải
protein.

II. BỆNH CẢM NHIỄM TRỰC KHUẨN NHIỆT THÁN
Cảm nhiễm Bacillus anthracis ở các động vật ăn cỏ, đặc biệt là động vật
nhai lại, lợn và người,... gây bệnh nhiệt thán (bệnh than hay thán thư: anthrax) là
bệnh truyền nhiễm bại huyết cấp tính. Đây là bệnh lây chung người và động vật
nhưng các loài chim nhờ có thân nhiệt cao thường đề kháng cao sự cảm nhiễm
vi khuẩn này (bảng I-35).
Bảng I-35. Các bệnh tiêu biểu ở động vật do cảm nhiễm Bacillus

Bệnh Bệnh nguyên Động vật cảm nhiễm Bệnh trạng
Bò, cừu, dê Chứng bại huyết siêu cấp
tính
Ngựa Viêm họng cấp tính
Bệnh nhiệt thán
B. anthracis
Lợn Viêm họng cấp tính, viêm
ruột
Bệnh thối ấu trùng ong
châu Mỹ
P.(B.) larvae
Âu trùng ong mật Chứng hoại huyết, hư tổ
Bệnh Tyzzer
"B. piliformis"
Động vật gậm nhấm, thỏ, chó,
mèo, vượn
Gan hoại tử dạng ổ,
Viêm ruột hoại tử xuất huyết

Bacillus anthracis phát triển tốt trên môi trường thạch thường tạo thành
dạng chuỗi dài gồm nhiều tế bào, ở 35 - 37 °C sau 16 - 24 giờ hình thành khuẩn
lạc dạng nhám (R), màu trắng tro, rìa và bề mặt khuẩn lạc có cấu trúc sợi xoắn

như tóc rối. Trên môi trường thạch máu, trực khuẩn này có dạng bóng láng hơn
nhưng không bóng láng hoàn toàn như khuẩn lạc của các trực khuẩn đường
ruột, không dung huyết. Trong môi trường lỏng, không làm đục đều môi trường

TS. Phạm Hồng Sơn *** Giáo trình Vi sinh vật học thú y *** Huế 2006

79
mà tạo thành những sợi như sợi bông bám dọc theo thành ống sau chìm xuống
đáy tạo thành lớp tủa xốp. Nha bào có kích thước nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng,
thường có dạng trứng, phân bố ở giữa hoặc lệch về một cực, chỉ hình thành khi
tiếp xúc với không khí, còn trong cơ thể động vật thì không.
Để giám biệt trực khuẩn Bacillus anthracis người ta ứng dụng 4
phương pháp:
1. Xác nhận điều kiện hình thành giáp mô: Khi phát triển hiếu khí
trên môi trường thạch thường, vi khuẩn này không hình thành giáp mô,
nhưng nếu cho thêm vào thạch thường 10 - 20% huyết thanh và nuôi cấy
trong 10% CO
2
thì hình thành, xác nhận được bằng phương pháp nhuộm
giáp mô (xem phần "Klebsiella").
2. Phản ứng "chuỗi ngọc (pearl test)": Nuôi cấy vi khuẩn nghi ngờ
(cần kiểm) trong môi trường chứa 0,5 - 0,05 IU/ml penicillin, lấy vi khuẩn
sau 3 - 4 giờ để làm tiêu bản nhuộm và hiển vi, nếu là Bacillus anthracis thì
thấy các tế bào hình cầu nối liền nhau như chuỗi ngọc, trong khi đó ở lứa
cấy đối chứng không có penicillin thì thấy các trực khuẩn dài đầu vuông. Kết
quả này là do penicillin đã gây trở ngại sự tổng hợp peptidoglycan vách tế
bào vi khuẩn.
3. Phản ứng thực khuẩn thể (phage test): Nếu nhỏ một giọt phage
γ đã pha loãng (1 - 100 lần liều thường dùng) lên môi trường đã cấy trực
khuẩn nhiệt thán sẽ thấy hình thành các điểm dung khuẩn.

4. Phản ứng Ascoli: là phương pháp xác nhận sự hiện diện của
kháng nguyên chịu nhiệt (kháng nguyên giáp mô có bản chất là polypeptide
acid
D
-glutamic bằng việc sử dụng kháng huyết thanh có chứa ngưng kết tố
(kháng thể ngưng kết: agglutinin) tương ứng. Để có kháng nguyên Ascoli
nghi ngờ (kháng nguyên bị kiểm), nếu con vật mắc bệnh chết thì lấy bệnh
phẩm là lách đem nghiền nhỏ, thêm 10 phần nước sinh lý, đun cách thủy
trên nước sôi 15 - 20 phút, để nguội, ly tâm hoặc lọc lấy nước trong, nếu
bệnh phẩm là da, lông, xương,... thì đem hấp ướt ở 120 °C trong 30 phút để
khử trùng, cắt nhỏ, thêm 10 phần nước sinh lý ngâm ở 5 °C trong 24 giờ,
lọc lấy nước trong. Kháng nguyên âm tính cũng làm tương tự nhưng với
lách, gan của con vật bình thường. Còn kháng thể là huyết thanh kháng
nhiệt thán chiết từ máu ngựa đã được gây tối miễn dịch bằng vi khuẩn nhiệt
thán. Để làm phản ứng Ascoli, cần có hai ống nghiệm nhỏ (một làm thí
nghiệm, một đối chứng âm tính. Ở ống th
ứ nhất cho sẵn 0,5 ml kháng
nguyên cần kiểm còn ở ống thứ hai cho 0,5 ml kháng nguyên âm tính. Dùng
ống hút có đầu nhỏ và dài (ống hút Pasteur dài) hút kháng huyết thanh nhiệt
thán cho vào tận đáy mỗi ống 0,5 ml, thật cẩn thận sao cho kháng huyết
thanh đội cả cột kháng nguyên lên. Để yên 10 - 15 phút ở nhiệt độ phòng thì
đọc kết quả. Vòng kết tủa trắng xuất hiện tại nơi tiếp xúc giữa kháng nguyên
và kháng thể giữa cột chất dịch chứng tỏ ph
ản ứng dương tính, trong khi
phản ứng đối chứng âm và phản ứng âm tính không hình thành tủa. Để
kiểm tra bệnh nhiệt thán trong các thú sản phẩm như da, lông, xương,...
người ta dùng phản ứng Ascoli là chính. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn là phụ
chỉ để khi cần xác nhận lại.

TS. Phạm Hồng Sơn *** Giáo trình Vi sinh vật học thú y *** Huế 2006

80
1. Bệnh nhiệt thán ở trâu bò (anthrax in cattle)
BKD21

Cảm nhiễm B. anthracis ở trâu bò và các động vật nhai lại khác thường
dẫn đến chứng bại huyết quá cấp tính, nhiều trường hợp sau khi phát bệnh 1 - 2
giờ thường là chết. Phát sốt, lách sưng, xuất huyết từ các lỗ tự nhiên, máu khó
đông là những triệu chứng đặc trưng.
Sự cảm nhiễm trong tự nhiên là do cảm nhiễm nha bào qua các chỗ tổn
thương, qua đường miệng, đường hô hấp. Sau khi nẩy mầm, vi khuẩn sinh sản
ở các hạch lympho, lách, hình thành giáp mô đề kháng thực bào và 3 loại ngoại
độc tố gây ra bệnh quá cấp tính. Thời kỳ nung bệnh thường 1 - 5 ngày. Do
chứng nhiễm độc huyết, mạch máu tăng thẩm thấu, dẫn đến phù thũng làm tắc
mao mạch dẫn đến sốc thứ nguyên, ngạt thở và tác dụng trực tiếp của các độc
tố tổn hại trung khu thần kinh dẫn đến chết.
Để phòng bệnh nhiệt thán người ta sử dụng vaccine nhược độc. Trước
đây sử dụng các vaccine Pasteur, nhưng nay trên toàn thế giới thường sử dụng
vaccine từ chủng biến dị nhược độc không nha bào của Sterne có tính sản sinh
kháng nguyên bảo vệ (PA) ổn định và vaccine nha bào chủng 34 F
2
.
2. Bệnh nhiệt thán ở ngựa (anthrax in hourse)
BKD21

Ngựa có tính cảm thụ tương đối thấp đối với B. anthracis, thông thường
bệnh diễn ra ở dạng viêm họng hầu cấp tính.
3. Bệnh nhiệt thán ở lợn (anthrax in pig)
BKD21

Tính cảm thụ tương đối thấp đối với B. anthracis cũng thấp, thông thường
bệnh trải qua dạng viêm họng hầu cấp tính hoặc dạng viêm ruột với những bệnh
tích như phù thũng và xuất huyết ở họng hoặc ở các hạch lympho của ống ruột.
Rất hiếm khi lợn chết do bại huyết cấp tính.
III. NHỮNG LOÀI BACILLUS KHÁC VÀ BỆNH CẢM NHIỄM
1. Trúng độc thực phẩm
B. cereus có khả năng phân giải các chất cao phân tử như protein và
carbohydrate rất mạnh gây hư thối nhanh chóng các loại thức ăn, bên cạnh đó
lại sản sinh độc tố gây nôn và enterotoxin gây tiêu chảy. Đây là những trực
khuẩn di động, phản ứng chuỗi ngọc âm tính, không cảm thụ phage gamma,
phát triển ở nhiệt độ từ 10 đến 40 °C.
Trúng độc do vi khuẩn này chỉ xảy ra khi ăn phải thức ăn trong đó đã có
lượng lớn tế bào hình thành (10
4-6
CPU/g). Chứng trúng độc có thể là dạng nôn
mửa và dạng tiêu chảy. Trúng độc dạng nôn mửa có triệu chứng chủ yếu nôn
mửa và tim loạn nhịp, là do vi khuẩn phát triển trong thức ăn và sản sinh nhiều
độc tố gây nôn chịu nhiệt (100 °C, 30 phút). Thời kỳ nung bệnh khoảng 1 - 5 giờ.
Trúng độc dạng tiêu chảy có triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy, đau bụng, vi
khuẩn từ thức ăn vào đường ruột và phát triển ở đó mà sản sinh enterotoxin
không chịu nhiệt mà gây trúng độc.
2. Bệnh thối ấu trùng ong châu Mỹ (American foulbrood)
BKD83

Paenibacillus (Bacillus) larvae là trực khuẩn di động, khi hình thành nha
bào thường hơi trương to trở nên có dạng của bào tử nang (sporangium). Vi

TS. Phạm Hồng Sơn *** Giáo trình Vi sinh vật học thú y *** Huế 2006

81

khuẩn phát triển tốt trên môi trường hiếu khí có thêm thiamin ở 35 - 37 °C, không
phát triển ở môi trường có thêm 7% NaCl, thủy phân mannit và casein, phân giải
gelatin, không thủy phân tinh bột.
Nha bào của vi khuẩn này xâm nhập vào ấu trùng ong mật trong vòng 2
ngày sau khi nở, phát triển mà gây bệnh thối ấu trùng. Bệnh này gây chết do bại
huyết ở các ấu trùng ở kỳ chưa đậy nắp và chết do thối hủy ở ấu trùng đã đậy
nắp.
3. Bệnh Tyzzer (Tyzzer's disease)
Là bệnh truyền nhiễm ở gậm nhấm, thỏ, chó, mèo, vượn,... với những
triệu chứng chủ yếu là hoại tử cục bộ ở gan, cơ tim, và hình thành những chỗ
viêm hoại tử xuất huyết ở đường ruột, nhưng nhiều khi bệnh trải qua một cách
ẩn tính. Bệnh nguyên của bệnh này gọi là vi khuẩn Tyzzer hay "Bacillus
(Actinobacillus) piliformis" là những vi khuẩn không nuôi cấy được và vị trí
phân loại còn chưa rõ (được xếp vào mục này vì lý do thuận tiện).
Vi khuẩn này bắt màu Gram âm trong tiêu bản vết in (print-smear) từ
vùng bệnh tích ở bệnh phẩm, không kháng acid, PAS (periodic acid - Shiff's
stain) dương tính (có màu đỏ), là trực khuẩn chu mao khá dài (0,3 - 0,5 × 2,0 -
20 μm). Trong tế bào cảm nhiễm, nha bào có hình ellip kéo dài (1,0 × 3,0 - 4,0
μm), bằng phương pháp nhuộm Møller hay phương pháp khác đều thấy có nha
bào.
Phương pháp nhuộm nha bào của Møller như sau: 1. Làm làn
mỏng, hong khô, cố định bằng nhiệt hay bằng cồn; 2. Phủ làn mỏng bằng
dung dịch acid chromic 1% (trong nước) trong vòng 30 giây đến 10 phút, tùy
loại vi khuẩn; 3. Rửa bằng nước; 4. Phủ làn mỏng bằng dung dịch Ziehl (30
ml dung dịch fuchsine gốc [3 - 7 g fuchsine +100 ml ethanol] 90 ml dung
dịch phenol 5% trong nước), hơ nóng mạnh trên ngọn lửa (đến mức thuốc
nhuộm bốc hơi nhưng không bị khô) 3 - 4 phút; 5. Rửa bằng nước; 6. Tẩy
màu trong 5 giây bằng cồn ethanol pha 3% acid chlorhydric; 8. Rửa nước;
9. Nhuộm tương phản bằng dung dịch Loeffler (30 ml dung dịch gốc
methylene blue [5 - 7 g methylene blue + 100 ethanol] pha vào 100 ml KOH

0,01%, để lâu càng tố
t) 1 - 2 phút; 10. Rửa nước, hong khô, hiển vi. Nha
bào có màu đỏ của fuchsine còn tế bào sinh dưỡng có màu xanh tương
phản.
PAS (periodic acid - Shiff's stain) là phương pháp nhuộm nấm, tế
bào nấm bắt màu đỏ khi được nhuộm bằng phương pháp này (xem Phần II:
Nấm...").