Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa việt nam
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.18 MB, 128 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Lê Thị Thu Trang
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN LIÊN QUAN
ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở LÚA VIỆT NAM
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 70
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÃ TUẤN NGHĨA
Hà Nội – Năm 2011
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
MỤC LỤC
Lời cam đoan......................................................................................................................................... i
Mục lục.................................................................................................................................................. ii
Danh mục bảng.................................................................................................................................... v
Danh mục hình minh họa................................................................................................................. vi
Danh mục chữ viết tắt...................................................................................................................... vii
MỞ ĐẦU............................................................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN................................................................................................................. 4
1.1. Sự hình thành và đặc tính của đất mặn............................................................................. 4
1.2. Giới thiệu chung về đặc điểm vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam................................ 5
1.2.1. Đồng bằng sông Cửu Long....................................................................................... 6
1.2.2. Đồng bằng Sông Hồng.............................................................................................. 6
1.3. Cơ sở di truyền tính chịu mặn ở lúa.................................................................................. 7
1.3.1. Cơ chế chịu mặn của cây lúa.................................................................................... 7
1.3.2. Di truyền tính chịu mặn.......................................................................................... 10
1.4. Công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn............................................................................ 11
1.4.1. Phương pháp truyền thống..................................................................................... 11
1.4.2. Áp dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống lúa chịu mặn.................12
1.5. Đa dạng di truyền................................................................................................................ 14
1.6. Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền........................................................................ 15
1.6.1. Chỉ thị hình thái........................................................................................................ 16
1.6.2. Chỉ thị hoá sinh......................................................................................................... 17
1.6.3. Chỉ thị phân tử ADN................................................................................................ 18
1.7. Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa...................................................... 28
1.7.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái................................ 28
1.7.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hoá sinh................................. 29
1.7.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN....................................... 30
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................................. 33
Lê Thị Thu Trang
iii
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
2.1. Vật liệu................................................................................................................................... 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................... 38
2.2.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa...................................... 38
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa................................................................ 40
2.2.3. Nhận dạng di truyền các giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR............................ 41
2.2.4. Phân tích số liệu........................................................................................................ 43
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................................. 44
3.1. Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống/dòng lúa............................................ 44
3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong
điều kiện phòng thí nghiệm................................................................................... 44
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều
kiện nhà lưới 54
3.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số....................................................................................... 60
3.3. Kết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide...................61
3.4. Quan hệ di truyền liên quan đến tính chịu mặn của các giống/dòng lúa................73
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................................... 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................................. 80
PHỤ LỤC........................................................................................................................................... 93
Lê Thị Thu Trang
iv
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
Danh mục bảng
Bảng 2.1: Danh sách 40 mẫu giống/dòng lúa trong nghiên cứu……......
Bảng 2.2: Danh sách các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu………
Bảng 2.3: Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trưởng và phát
triển
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng SSR- PCR…………………………….
Bảng 2.5:
Thà
Bảng 3.1:
Các
cứu
16d
Bảng 3.2: Kết quả đánh giá cấp điểm chống chịu mặn của các
giốn
Bảng 3.3: Tỷ lệ sống sót của các giống/dòng lúa nghiên cứu trồng trong
đất v
Bảng 3.4: Kết quả đánh giá cấp điểm chống chịu mặn của các
giốn
Bảng 3.5: Tần số alen của 20 locut SSR…………………………………
Bảng 3.6: Đa hình các locut SSR ở các giống lúa nghiên cứu…………..
Lê Thị Thu Trang
v
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
Danh mục hình
Hình 1.1:
H
Hình 1.2:
C
Hình 1.3:
N
Hình 1.4:
Đ
Hình 3.1:
T
đ
Hình 3.2:
Đ
g
v
Hình 3.3:
T
Hình 3.4:
B
n
E
Hình 3.5:
Đ
g
E
Hình 3.6:
K
Hình 3.7:
K
S
Hình 3.8:
K
S
Hình 3.9:
K
S
Hình3.10:
K
S
Hình 3.11:
K
S
Hình 3.12:
Lê Thị Thu Trang
K
vi
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Hình 3.13:
Hình 3.14:
Hình 3.15:
Hình 3.16:
Hình 3.17:
Hình 3.18:
Hình 3.19:
Hình 3.20:
Hình 3.21:
Hình 3.22:
Hình 3.23: Biến động kích thước của các alen tại locut SSR khảo sát…….
Hình 3.24: Kết quả phản ứng PCR của 40 giống/dòng lúa với 20 cặp mồi
Hình 3.25:
Lê Thị Thu Trang
vii
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
AFLP
APS
AP- PCR
CAPs
Cs
CSGE
CTAB
DAF
DNA
dNTPs
EDTA
EST
EthBr
ISSR
MAS
PCR
PIC
RAPD
RFLP
SNP
SSR
STMS
STS
TAE
TEMED
VNTR
Lê Thị Thu Trang
ĐHQGHN
viii
ĐH Khoa học Tự nhiên -
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
MỞ ĐẦU
Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chiếm vị trí quan trọng hàng đầu ở
nhiều nước trên thế giới và là cây trồng chủ đạo trong nền nông nghiệp Việt Nam
[7,8]. Tuy nhiên, cây lúa lại là cây trồng nhạy cảm với độ mặn. Năng suất lúa tại
nhiều khu vực trồng lúa đang giảm dần do mặn làm tổn hại mà trong đó nước mặn
xâm thực vào nước tưới và đất trồng lúa là một trong những nguyên nhân quan trọng.
Ước tính diện tích đất bị nhiễm mặn trên toàn thế giới lên tới 1 tỷ ha. Chỉ riêng Châu
Á khoảng 21,5 triệu ha đất bị nhiễm mặn (Flower và Yeo, 1995).
Ở
Việt Nam diện tích đất canh tác ngập mặn khoảng 200.000ha [1]. Mặt khác
do tập quán và nhu cầu mở rộng canh tác đổi mới ngành nghề như nuôi trồng thuỷ
sản vô tình làm tăng thêm diện tích đất ngập mặn cũng như độ mặn tăng lên khoảng
từ 0,3-0,4% thậm chí còn cao hơn cả chục lần [14]. Hơn nữa, nghề trồng lúa
ở vùng nhiễm mặn đang phải đối mặn với sự tác động của biến đổi khí hậu. Theo báo
cáo về Chỉ số rủi ro khí hậu toàn cầu năm 2010 do tổ chức Germanwatch công bố tại
Đan Mạch thì Việt Nam là một trong 10 quốc gia bị thiệt hại nhiều nhất do biến đổi
khí hậu gây ra, các quốc gia khác đó là: Bangladesh, Myama, Honduras, Nicaragoa,
Haiti, Ấn Độ, Cộng hoà Đôminica, Philippines và Trung Quốc. Theo kết quả nghiên
cứu và dự báo của Uỷ ban liên chính phủ về biến đổi khí hậu của Liên hiệp quốc
(IPPC) và Ngân hàng thế giới thì trong vòng 100 năm tới, nước biển sẽ dâng 1m,
nhiệt độ sẽ tăng thêm 2 độ C. Nếu nước biển dâng cao 1m thì vùng đồng bằng sông
Cửu Long sẽ có 1,5- 2 triệu ha đất nông nghiệp bị ngập nước, còn ở vùng đồng bằng
sông Hồng sẽ có 1668 km2 đất bị ngập, trong đó có khoảng 0,3- 0,5 triệu ha đất chủ
yếu là đất lúa bị ngập.
Trước những biến đổi nghiêm trọng đó, trồng các giống lúa chống chịu tốt với
mức nhiễm mặn cao sẽ là giải pháp để khắc phục các hiện tượng trên. Các biện pháp
như xây dựng công trình thuỷ lợi bao đê ngăn chặn hay bón các loại phân hữu cơ vào
đất (bón vôi, thạch cao để cải thiện cấu trúc đất, cày sâu cải thiện tính thoát nước tốt
nhằm giảm đóng váng trên mặt đất) thường tốn kém và hiệu quả không cao
Lê Thị Thu Trang
1
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
[31]. Tuy nhiên phần lớn các giống lúa có khả năng chịu tốt thì năng suất lại thấp,
tính thích nghi kém. Do đó, hướng lai tạo tập trung vào chuyển gen chống chịu mặn ở
giống lúa chịu mặn tốt và một số giống lúa mang đặc tính ưu việt về năng suất, chất
lượng đang được phát triển. Thông thường phải mất đến 3-4 năm lai tạo để chuyển
gen. Ngoài ra, một khó khăn thường gặp trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên
hệ khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong
muốn thường được lai chuyển vào các con lai cùng một lúc. Các gen điều khiển tính
trạng mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Do đó lai tạo tính
trạng chống chịu mặn có thể kéo dài đến 10- 15 năm để phát triển một giống lúa mới
[29]. Vì vậy, phương pháp lai tạo truyền thống thường khó, mất nhiều thời gian và
không hiệu quả.
Ngày nay, nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học nên công tác chọn tạo giống đã trở
lên hiệu quả hơn. Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP, AFLP
được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di
truyền và xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể giống khởi đầu, từ
đó xác định các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp có thể cho ưu thế lai cao
nhất. Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ một cách
chính xác, không bị tác động bởi điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian và nâng cao
hiệu quả công tác lai tạo. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam” với mục
tiêu chính là xây dựng cơ sở dữ liệu ADN và tính chịu mặn của các giống/dòng lúa
nghiên cứu nhằm góp phần quan trọng cho việc khai thác
nguồn gen chịu mặn và định hướng cho chọn tạo giống lúa chịu mặn ở Vi ệt
Nam.
Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành những nội dung
nghiên cứu sau:
1.
Đánh giá khả năng chịu mặn của các mẫu giống/dòng lúa nghiên
cứu.
2.
Nhận dạng di truyền các mẫu giống/dòng lúa nghiên cứu bằng chỉ thị
phân tử SSR.
Lê Thị Thu Trang
2
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
3.
Di truyền học
Phân tích, đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu giống/dòng lúa
bằng chỉ thị SSR.
Kết quả của đề tài góp phần tạo cơ sở khoa học để xây dựng phương pháp
đánh giá đa dạng di truyền và phân loại nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở các
giống/dòng lúa, hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn mới có năng
suất cao, chất lượng tốt.
Lê Thị Thu Trang
3
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Sự hình thành và đặc tính của đất mặn
Hiện nay, diện tích đất nhiễm mặn chiếm 7% diện tích toàn thế giới. Đất bị ảnh
hưởng mặn ở đại lục thuộc Châu Âu và Bắc Mỹ rất ít có khả năng trồng trọt. Ở châu
Á, hơn 80% đất bị ảnh hưởng mặn có khả năng trồng trọt và đã khai thác cho sản xuất
nông nghiệp. Ở Châu Phi và Nam Mỹ, khoảng 30% đất bị nhiễm mặn có khả năng
trồng trọt. Hiện tượng nhiễm mặn là mối đe doạ lớn nhất đến việc gia tăng sản lượng
lương thực của các quốc gia Châu Á [32]
Nguyên nhân phát sinh mặn do nhiều yếu tố, một là mặn ven biển hoặc vùng
cửa sông do nước biển xâm thực vào mùa khô, có thể trồng trọt bình thường trong
mùa mưa; hai là mặn bên trong đất do mao dẫn từ tầng dưới lên có thể do phá rừng,
không có tán che phủ.
o
Đất mặn là đất có độ dẫn điện (EC) từ 4dS/m trở lên ở 25 C, phần trăm
sodium trao đổi ESP kém hơn 15, pH nhỏ hơn 8,5 [5]. Trong đất chứa một lượng
muối hoà tan trong nước ở vùng rễ cây, làm ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của
cây trồng. Mức độ thiệt hại của đất mặn tuỳ thuộc vào loài cây trồng, giống cây, thời
gian sinh trưởng, các yếu tố môi trường và tính chất của đất.
Đất mặn được phân thành hai loại: (1) đất mặn nhiều; (2) đất mặn ít và trung
bình.
(1)
Đất mặn nhiều (Hyper Salic Fluvisols) chiếm 0,03% diện tích đất tự nhiên.
Đất được hình thành do sự bồi tụ của phù sa sông, biển hoặc hỗn hợp sông biển,
nhưng do phân bố ở địa hình thấp, ven đầm phá, chịu trực tiếp của nguồn nước mặn
-
nên đất bị mặn nhiều (hàm lượng Cl dao động từ 0,05- 0,15%). Đất thường có màu
tím hoặc nâu, hơi xám đen. Thành phần cơ giới rất khác nhau tùy thuộc vào nguồn
gốc đất bị mặn. Nơi đất cát bị mặn thì có thành phần cơ giới nhẹ, nơi đất phù sa bị
mặn thì thành phần cơ giới lại rất nặng. Đất có phản ứng ít chua đến trung bình,
nghèo mùn, đạm tổng số nghèo đến trung bình, nghèo lân tổng số, nồng độ
Lê Thị Thu Trang
4
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Ca
2+
và Mg
2+
Di truyền học
khá. Loại đất này có độ mặn cao, có thể dùng để trồng cói hoặc nuôi
trồng thủy sản, nếu giải quyết được có nước ngọt và chọn được giống lúa chịu mặn
thì có thể trồng lúa 1 vụ hoặc 2 vụ [5].
(2)
Đất mặn ít và trung bình (Molli Salic Fluvisols): Diện tích chiếm khoảng
1,22% diện tích đất tự nhiên, phân bố tập trung ở ven đồng bằng tiếp giáp vùng đất
mặn nhiều, ven sông lớn hoặc các kênh rạch, đầm phá. Loại đất này có địa hình cao
hơn, được hình thành do ảnh hưởng của mạch nước ngầm mặn hoặc do ảnh hưởng
của nguồn nước mặn tràn vào không thường xuyên. Hình thái phẫu diện thường có
màu xám hơi tím hoặc nâu tím nhạt, các lớp dưới có màu xám nâu hoặc xám xanh.
Thành phần cơ giới cũng rất khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc phát sinh [5].
1.2. Giới thiệu chung về đặc điểm vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam
Ở
Việt Nam, đất nhiễm mặn tập trung ở vùng đồng bằng Sông Hồng và đồng
bằng Sông Cửu Long. Tổng diện tích đất nhiễm mặn khoảng 1triệu ha, trong đó
139.610 ha đất mặn nhiều, tập trung ở vùng đồng bằng Sông Cửu Long khoảng
102.000ha, vùng Đông Nam Bộ khoảng 19.590ha, duyên hải miền Trung 11.420ha,
khu IV cũ 6.600ha. Đất mặn trung bình và ít có diện tích 722.580 ha, trong đó ở vùng
đồng bằng Sông Hồng với diện tích 586.420ha, đồng bằng Sông Cửu Long là
53.300ha, Khu IV cũ 38.350ha, duyên hải miền Trung 35.560ha và một ít ở Đông
Nam Bộ (theo Hội Khoa học Đất Việt Nam, 2002).
Hình 1.1: Hình ảnh lúa ngập mặn
Lê Thị Thu Trang
5
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
1.2.1. Đồng bằng sông Cửu Long
Đồng bằng sông Cửu Long có nhiệt độ khí hậu trung bình hàng năm trên 2728oC, Số giờ nắng trung bình là 6giờ/ngày. Năng lượng bức xạ năm đạt 752
80Kcal/cm . Lượng mưa trung bình hàng năm toàn vùng là 1.520-1.800mm, phân bố
không đều theo thời gian và không gian. Mưa lũ tập trung vào tháng 5 đến tháng 10;
lượng mưa chiếm khoảng 90% lượng mưa cả năm. Do đó, thuỷ triều có ảnh hưởng rất
lớn đến toàn bộ đồng bằng sông Cửu Long. Nước mặn từ biển tràn vào sâu trong đất
liền vào mùa khô. Các vùng lúa ven biển đồng bằng sông Cửu Long đều bị nhiễm
mặn. Mức độ xâm nhập mặn tuỳ thuộc vào sự xâm nhập mặn của nước biển và tuỳ
vào mùa trong năm, cao điểm vào khoảng tháng 3-4 là các tháng có lượng mưa ít [1].
Theo Lê Sâm (2003), đồng bằng sông Cửu Long có khoảng 1,8-2,1 triệu ha đất tự
nhiên chịu ảnh hượng của mặn tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Kiên Giang,
Trà Vinh, Sóc Trăng, Bến Tre, phần lớn là đất bị nhiễm mặn kết hợp với phèn, ngập
nước.
Bộ Nông nghiệp và PTNT (2001) chia vùng đồng bằng sông Cửu Long ra làm
6 vùng: vùng ven và giữa sông Tiền và sông Hâu, vùng Đồng Tháp Mười, vùng Tây
sông Hậu, vùng Tứ giác Long Xuyên, vùng Bán đảo Cà Mau, vùng ven biển Đông.
Trong đó các vùng bị ảnh hưởng mặn chính là:
Vùng bán đảo Cà Mau: diện tích tự nhiên là 946.000ha. Diện tích đang sử
dụng 676.000ha, gồm các loại đất: đất mặn và đất phèn chua. Yếu tố chính ảnh hưởng
đến sản xuất của vùng là thiếu nước ngọt và ảnh hưởng mặn
Vùng ven biển Đông: diện tích tự nhiên 1.073.000ha. Diện tích đang sử dụng
844.000ha, gồm các loại đất phù sa, đất mặn và đất cát giồng. Yếu tố chính ảnh
hưởng đến sản xuất của vùng là không ngập lũ, thiếu nước ngọt và ảnh hưởng của
mặn.
1.2.2. Đồng bằng Sông Hồng
Sự nhiễm mặn tại các cửa sông thuộc các tỉnh đồng bằng Sông Hồng lên cao
và xâm nhập vào trong nội địa từ 30-40km làm cho diện tích nhiễm mặn lên tới
Lê Thị Thu Trang
6
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
100.000ha ở một số tỉnh: Hải Phòng, Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình, Thanh Hoá…
Trong đó, diện tích đất mặn ở tỉnh Thái Bình khoảng 18.000ha tập trung chủ yếu ở
các huyện Thái Thuỵ, Tiền Hải, Kiến Xương… Tỉnh Hải Phòng khoảng 20.000ha tập
trung ở huyện Tiên Lãng, Vĩnh Bảo, Kiến Thuỷ… Tỉnh Thanh Hoá có khoảng
22.000ha đất nhiễm mặn ở các huyện Hậu Lộc, Hà Trung, Hoằng Hoá… Ở Nam Định
có khoảng 10.000ha chủ yếu ở các huyện Nghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thuỷ…
Các giống lúa mùa địa phương trước đây thường được gieo trồng là : Cườm, Nhộng,
Tẻ Tép, Chiêm Bầu …năng suất thấp, chỉ đạt 18-20tạ/ha. Gần đây một số giống chịu
mặn trung bình như: Mộc Tuyền X21, VD97… cho năng suất khá cao nhưng có dạng
hình cây yếu, ít chịu phân, cao cây, lá lướt. Dọc theo ven biển miền Trung đất cũng bị
nhiễm mặn như Hà Tĩnh có khoảng 17.919ha, Quảng Bình có hơn 9.300ha, Ninh
Thuận có gần 2300ha. Các giống lúa địa phương thường được canh tác tại các vùng
này là: Thuận Yến, nếp Bờ Giếng, Trắng Điệp.
Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố gây khó khăn chính cho
nghề trồng lúa ở Việt Nam. Những năm gần đây, xu hướng chuyển đổi từ trồng lúa
sang nuôi tôm nước lợ nhiễm mặn ở các tỉnh ven biển đã làm cho một số vùng lúa lân
cận trở nên bị nhiễm mặn, gây ảnh hưởng xấu đến sản lượng lúa.
1.3. Cơ sở di truyền tính chịu mặn ở lúa
1.3.1. Cơ chế chịu mặn của cây lúa
Lúa là cây lương thực thích hợp nhất trên đất mặn, dù nó luôn được đánh giá
là nhiễm mặn trung bình với mặn. Vì đất mặn luôn ở dưới điều kiện bị ngập nước,
những cây trồng khác không thể sinh trưởng được ngoại trừ lúa [26]. Theo
Ponnamperuma (1984) cây lúa chịu mặn trong suốt giai đoạn nẩy mầm; giai đoạn
sinh trưởng dinh dưỡng; giai đoạn chín nhưng lại bị nhiễm trong giai đoạn mạ non và
giai đoạn thụ phấn. Tuy nhiên, một nghiên cứu khác cho rằng, tại giai đoạn trỗ, cây
lúa không mẫn cảm với mặn [26]. Do đó, sinh trưởng và phát triển của cây lúa phải
được chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế chống chịu
mặn của lúa.
Lê Thị Thu Trang
7
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
Trong điều kiện nhiễm mặn cao cây lúa sẽ chết, tuy nhiên trong môi trường
mặn trung bình đến thấp chỉ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây.
Hầu hết các cây bị mặn làm tổn hại thường có những triệu chứng biểu hiện như trắng
đầu lá sau đó cháy, đẻ nhánh kém, sinh trưởng còi cọc, tỉ lệ hạt lép cao, số hạt/bông ít,
thay đổi thời gian trỗ, rễ sinh trưởng kém, cuốn lá và năng suất thấp. Bên cạnh đó,
cây lúa cũng có thay đổi sinh lý và sinh hoá dưới điều kiện mặn cao biểu hiện như
+
vận chuyển Na cao đến đỉnh sinh trưởng, tích lũy natri nhiều hơn ở các lá già, hút Cl
-
+
, hút K , P và Zn thấp, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của đỉnh và rễ thấp…
Hình 1.2: Các cơ chế chịu mặn ưu thế ở lúa
Nghiên cứu sự tác động của yếu tố mặn làm tổn hại đến lúa cho thấy do cây
tích lũy quá nhiều ion Na+ và Cl-; mà ion Na+ lại có tác động phá vỡ và cản trở vai trò
sinh học của tế bào chất trong cây [85]. Ngược lại những cây được xem là chịu mặn
(kháng mặn) thì nó có khả năng giảm hấp thu Na + và gia tăng hấp thu K+ để duy trì
+
cân bằng lượng natri và kali trong cây bởi ion K có vai trò làm kích hoạt các enzyme
và đóng, mở khí khổng tạo ra tính chống chịu mặn của cây
Lê Thị Thu Trang
8
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
[70]. Bên cạnh đó, vai trò của kẽm (Zn) trong chồi cũng có liên quan đến tính chịu
mặn của cây lúa. Khi hàm lượng kẽm trong chồi cao thì tính chống chịu mặn cao.
Điều này được giải thích là do kẽm làm gia tăng hàm lượng nitơ trong chồi, dẫn đến
việc sinh trưởng nhanh hơn và năng suất lúa cao hơn trong điều
kiện mặn [26]. Như vậy giống lúa chịu mặn sẽ duy trì nồng độ Na + và Cl- thấp, nồng
độ của K+ và Zn2+ cao hơn và tỷ lệ Na+/K+ thấp trong mầm lúa.
Kết quả nghiên cứu của Flowers và Yeo (1988) cho thấy, có mối tương quan
giữa số lượng muối được đi vào rễ cây lúa với nồng độ muối trên chồi. Mối quan hệ
này được xác định bởi mối quan hệ giữa tốc độ sinh trưởng của chồi với sự di chuyển
thực của những ion ngoài rễ. Giá trị này là số lượng thực của những ion được di
chuyển tới chồi trên đơn vị trọng lượng của rễ trong một đơn vị thời gian. Bằng
chứng là ở giống lúa Pokkali (giống chống chịu mặn), hàm lượng natri ở chồi trung
bình thấp hơn của giống IR29 (giống nhiễm mặn). Bởi vì hàm lượng natri ở chồi của
giống lúa Pokkali được pha loãng do sự sinh trưởng dinh dưỡng nhanh của nó. Với cơ
chế này, cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng muối nhờ tăng cường tốc độ phát triển
nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi.
Khi cây lúa bị ảnh hưởng của mặn thì diện tích lá sẽ giảm, trọng lượng khô của
chồi và của rễ sẽ giảm tương ứng với độ mặn. Ở giai đoạn mạ, lá già hơn sẽ mất khả
năng sống sót hơn lá non [39]. Khi phân tích trên lá lúa sống trong môi trường mặn có
sự chênh lệch hàm lượng muối từ lá cây này sang lá cây khác, muối luôn được tích
lũy với nồng độ cao trong lá già và hiện tượng chết ở lá già là một cơ chế loại muối ra
khỏi cây. Như vậy, rụng lá là một hiện tượng thông thường ở cây lúa để chống chịu
mặn. Mặt khác, nghiên cứu nồng độ Na + trong các lá lúa cho thấy có sự thay đổi rõ
rệt về hàm lượng Na+ từ những lá non sang những lá già; ion Na + tích lũy cao nhất ở
những lá già nhất và giảm dần trên những lá non nhất.
+
Các cơ chế nêu trên cho thấy khi cây lúa bị nhiễm mặn nồng độ Na trong các
+
+
+
+
mô chức năng bị giảm đi, do đó làm giảm tỷ lệ Na /K trong chồi. Tỷ lệ Na /K
trong chồi được xem như là chỉ tiêu chọn lọc giống lúa chịu mặn.
Lê Thị Thu Trang
9
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
1.3.2. Di truyền tính chịu mặn
Nghiên cứu di truyền về tính kháng mặn ở lúa cho thấy rằng nó được điều
khiển bởi nhiều gen và muốn chọn tạo giống lúa chịu mặn có hiệu quả, cần phải
nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền nhằm xác định rõ các gen điều khiển tính chịu
mặn, từ đó giúp chúng ta chủ động và khai thác hiệu quả nguồn gen trong chọn tạo
giống lúa chịu mặn [25, 50].
Qua những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ trong
dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao với độ dẫn điện (EC)=
12dS/m, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, trọng lượng khô
của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống kháng mặn và
giống nhiễm mặn, các tính trạng này chủ yếu được điều khiển qua hoạt động của
nhóm gen cộng tính và hệ số di truyền tính chống chịu của tính trạng này rất thấp
[80]. Ở giai đoạn trưởng thành, tính trạng chiều cao cây, năng suất của lúa trong điều
kiện mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính [57].
Khi phân tích di truyền số lượng về tính trạng chống chịu mặn được thông qua
hàm lượng Na+, K+; tỷ lệ Na+/K+ và điểm chống chịu mặn cho thấy nó được kiểm
soát bởi 2 nhóm gen cộng tính và không cộng tính. Tính trạng thể hiện khả năng hấp
thu K+ được kiểm soát bởi gen đối xứng. Nghiên cứu của Gregorio và Senadhira
(1993) còn cho thấy, tính trạng tỷ lệ Na +/K+ thấp còn thể hiện ảnh hưởng siêu trội và
được điều khiển bởi ít nhất hai nhóm gen trội. Một số nghiên cứu cho thấy chiều dài
bông và khối lượng 1000 hạt ít bị tác động bởi các yếu tố môi trường; trong khi đó
khối lượng bông, số hạt chắc trên bông chịu tác động lớn bởi tác động của môi trường
và 3 tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường
mặn [61].
Qua nhiều nghiên cứu di truyền phân tử tính kháng mặn, bản đồ
QTL( Quantitative Trait Loci)/gen được xây dựng trên cơ sở chỉ thị AFLP và STS cho
thấy, gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số
1. Bên cạnh gen chủ lực Saltol, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng
Lê Thị Thu Trang
10
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
hấp thu K cao, 4 QTL có quan hệ với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan hệ
với tính trạng tỷ số Na/K thấp. Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số 1, 3, 4,
10 và 12 [27, 52, 65].
1.4. Công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn
Hiện nay, công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn có thể là hợp lý và ít tốn kém
cho các vùng canh tác nhiễm mặn. Ngoài một số phương pháp truyền thống (chọn lọc
cá thể, đột biến...) với sự pháp triển của khoa học kỹ thuật- nhất là công nghệ sinh học
nhiều công nghệ mới đã được áp dụng cho hiệu quả vượt trội so với các phương pháp
truyền thống.
1.4.1. Phương pháp truyền thống
Chương trình lai tạo giống lúa chịu mặn ở các nước trên thế giới đều dựa trên
yêu cầu thực tế của từng nơi nhưng đều hướng tới mục tiêu nâng cao tính chịu mặn,
năng suất và cải thiện chất lượng. Các phương pháp lai tạo giống lúa chịu mặn truyền
thống như chọn lọc cá thể, lai giống, đột biến, chọn giống ưu thế lai được áp dụng
khá phổ biến.
Nhiều giống lúa chịu mặn đã được chọn tạo và canh tác hiệu quả trên thế giới.
Trong những năm 1977- 1980, Viện nghiên cứu lúa quốc tế đã tiến hành chọn được
những dòng chịu mặn tốt như IR4595-4-1, IR 42, IR9894-54-3, năng suất đạt 3,6
tấn/ha cao hơn so với giống lúa cổ truyền 2 tấn/ha [70]. Các giống lúa chịu mặn do
Viện nghiên cứu lúa quốc tế lai tạo và hợp tác với các quốc gia trong mạng lưới đang
được phát triển như PSBRC84, PSBRC88 ở Bangladesh, giống CRS27, CRS10 ở Ấn
Độ [5]. Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chịu mặn khá
tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29. Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển gen
chống chịu mặn từ Pokkali và một số giống lúa mùa địa phương có tính chống chịu
mặn bằng phương pháp lai hồi giao các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với từng
vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt [45].
Ở Việt Nam, nhiều giống lúa chống chịu mặn như OM732, OM861,
Lê Thị Thu Trang
11
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
OM1314, OM 1490, OM2031, OM1314, OM576, IR42, OM344, OM924, Trắng
Điệp, Móng Chim Rơi, Móng Chim, Nếp Áo Già, Nếp Bờ Giếng, Nàng Quốc Đỏ,
Rồng Xanh, Đốc Phụng, Nhỏ Đỏ, Tám Vuốt, TD2, Thuận Yến, nếp Bờ Giếng, Trắng
Điệp, X19, VD97, VD920, CM6 .v.v. đã được triển khai ở vùng đồng bằng sông Cửu
Long và Sông Hồng [3, 5, 20].
Từ năm 2001-2005, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã nghiên cứu
chọn tạo giống lúa chịu mặn cho các vùng lúa ven biển phía Bắc và đã tạo ra giống
lúa chịu mặn M6 (Bầu Hải Phòng/1548) và một số giống khác như MT6, MT163,
BM9855, BM9820 và BM9830. Các giống này tỏ ra thích ứng trên các chân đất ven
biển và vùng bị nhiễm phèn mặn ở phía Bắc. Ngoài ra Viện Cây lương thực và Cây
thực phẩm cũng đã chọn lựa được 44 giống/dòng lúa chịu mặn, trong đó 15
giống/dòng lúa có khả năng chịu mặn cao và 10 giống/dòng lúa có khả năng chịu mặn
trung bình đang được sử dụng trong công tác chọn lọc giống lúa chịu mặn [8]. Bên
cạnh đó Viện Di truyền Nông nghiệp đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong
cải tạo một số giống lúa địa phương vùng đồng bằng ven biển Bắc bộ. Kết quả gây
đột biến nguồn Coban (Co60) đã chọn được các giống lúa CM1 và CM5 là những
giống chịu mặn tốt, cứng cây, kháng bệnh và cho năng suất cao.
Do đặc điểm di truyền và nông sinh học của cây lúa mà phương pháp lai tạo
truyền thống thường tốn nhiều thời gian và công sức (3-4 năm lai tạo). Đôi khi trong
quá trình lai tạo giống mới có các tính trạng không mong muốn được lai chuyển vào
con lai cùng lúc, các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu
đến biểu hiện của con lai. Vì vậy, thời gian để phát triển một giống lúa chịu mặn mới
có thể mất đến hơn 10 năm [29].
1.4.2. Áp dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống lúa chịu mặn
Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học được áp dụng mạnh mẽ trong
công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn. Nhằm khắc phục những điểm yếu của phương
pháp truyền thống, công nghệ sinh học đã hỗ trợ hoặc thay thế một số công
Lê Thị Thu Trang
12
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
đoạn trong quá trình lai tạo giống, phổ biến nhất là hai mảng công nghệ chỉ thị phân
tử và nuôi cấy mô tê bào.
Năm 2002, Gregorio và cs. tiến hành nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo các biến
dị soma chống chịu mặn đã thu được dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 chịu
mặn cao từ giống lúa Pokalli. Đặng Minh Tâm và Nguyễn Thị Lang (2003) nuôi cấy
mô 10 giống, bao gồm lúa mùa địa phương và cao sản chống chịu mặn khá (cấp 3-5),
trong môi trường có chứa NaCl ở mức 1,0 và 1,5% cho tỷ lệ cây tái sinh cao. Ngô
Đình Thức (2006) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và nuôi cấy túi phấn trong chọn tạo
giống lúa chịu mặn. Kết quả tạo được 8 dòng biến dị soma từ OM576, IR64, Basmati
và VD20 có khả năng chống chịu mặn ở cấp 5 khi thanh lọc
ở giai đoạn mạ với EC=12dS/m. Từ nuôi cấy túi phấn từ 12 tổ hợp lai, 12 dòng cây
xanh lưỡng bội có khả năng chống chịu mặn ở cấp 5 khi thanh lọc ở giai đoạn mạ với
EC=12dS/m được tuyển chọn.
Với mục tiêu nhằm làm chủ việc khai thác các gen qui định tính chịu mặn
trong công tác chọn tạo giống lúa một cách hiệu quả, các nhà khoa học đã tiến hành
phân tích xác định những QTL/gene điều khiển tính chịu mặn và chỉ thị liên kết với
gene để sử dụng theo hướng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Trong nhiều năm qua,
một số nghiên cứu của: Bonille et al. (2002) và Niones (2004) đã xác lập bản đồ
QTL/gen (gen Saltol) nằm trên nhiễm sắc thể số 1, đóng góp tới 65% tính chống chịu
mặn của lúa. Lin et al., (1998) đã phát hiện QTL qui định tính chịu mặn nằm trên
nhiễm sắc thể số 5. Sử dụng chỉ thị RFLP và SSR, Singh et al., 2007 đã lập bản đồ
QTL tính chịu mặn ở lúa. Mohammadi-Nejad et al. (2008) đã sử dụng 33 chỉ thị SSR
trên nhiễm sắc thể số 1 để xác định khoảng cách liên kết của các chỉ thị này với gen
Saltol. Trong số 33 chỉ thị, có 6 chỉ thị gồm: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412,
RM493 và RM140 liên kết với gen Saltol ở khoảng cách 10.8 đến 12.28Mb; gen
Saltol có thể liên kết gần nhất với các chỉ thị: RM8094 và RM10745. Các giống lúa:
IR70023, IR65858, IR69588, IR74105, IR71832, IR74099, Cherivirrupo và IR669463R-178-1-1 (FL478) có sản phẩm PCR giống như sản phẩm PCR của Pokkali khi
được nhân bản bởi Marker RM8094 và cho tính chống
Lê Thị Thu Trang
13
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
chịu rất tốt hoặc tốt đối với mặn. Tác giả cũng khuyến cáo việc sử dụng hai chỉ thị
RM8094 và RM10745 trong xác định kiểu gen của cây lúa chống chịu mặn có mang
gen Saltol trong các chương trình lai tạo lúa chịu mặn.
Ở
Việt Nam, ứng dụng marker phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn
cũng được phát triển. Năm 2000, Vương Đình Tuấn và cs. đã xác định được 3 chỉ thị
RFLP đó là: R1928, R674 và G257 liên kết với các QTL điều khiển tính chịu
mặn trên các nhiễm sắc thể số 1, 6 và 11. Bùi Chí Bửu và cs. (2000) sử dụng 30 chỉ
thị SSR để lập bản đồ gen cho tính chống chịu mặn của quần thể F 3 gồm 257 cá thể
phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28/Đốc Phụng và đã xác định được chỉ thị RM223
liên kết với gen chịu mặn với khoảng cách là 6.3cM trên nhiễm sắc thể số 8. RM223
nhân bản đoạn DNA kích thước 120bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống
Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160bp từ giống nhiễm IR28. Hai chỉ thị
OSR1 và RM315 liên kết với QTL chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1
[63].
1.5. Đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học là vấn đề rất được quan tâm hiện nay. Giữ gìn và bảo tồn đa
dạng sinh học là mục tiêu sống còn trong việc duy trì cân bằng sinh thái, đảm bảo môi
sinh của các sinh vật trên trái đất, trong đó có con người. Khái niệm đa dạng sinh học
được hiểu theo nhiều cấp, đó có thể là sự đa dạng của các quần xã sinh vật trong hệ
sinh thái, là sự đa dạng giữa các loài trong quần xã hay sự đa dạng ở cấp độ di truyền
giữa các cá thể trong cùng một loài. Mặc dù là cấp độ thấp nhất, nhưng đa dạng di
truyền lại có vai trò vô cùng quan trọng trong tiến hoá và thích nghi của các sinh vật,
mọi biến động ở cấp độ đa dạng di truyền đều có tác động đến những cấp độ cao hơn
và cuối cùng là ảnh hưởng đến đa dạng sinh học [76].
Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở nguồn gen và kiểu gen trong mỗi
loài. Mỗi loài có một bản đồ nhiễm sắc thể và số lượng nhiễm sắc thể khác nhau, cho
nên hiếm có các cá thể của cùng một loài hoặc cùng một giống có trật
Lê Thị Thu Trang
14
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
tự các gen trong hệ gen giống hệt nhau. Trong quá trình tiến hoá, các nhiễm sắc thể
luôn biến đổi từ nhiễm sắc thể tâm cân đến nhiễm sắc thể tâm lệch và hơn nữa là sự
có mặt của thể kèm. Mỗi một sự biến đổi bên trong của cơ thể đều được thể hiện ra
bên ngoài để tạo ra các dạng khác biệt nhau [19].
Những nghiên cứu trước về mức độ đa dạng di truyền chủ yếu dựa trên các đặc
điểm hình thái. Với các phương pháp phân tích mới, người ta đã thấy rằng biến dị di
truyền bên trong loài được cấu trúc có thứ bậc giữa các nhóm có đặc hiệu bên trong
như dưới loài, thứ và quần thể. Xét về thực chất, mức độ đa dạng di truyền phụ thuộc
vào số lượng và sự khác biệt của các gen bên trong loài. Nếu biến dị xảy ra giữa các
alen bên trong locut và tế bào thì được gọi là dị hợp tử và biến đổi như vậy ở các tế
bào đa bội có thể lớn hơn các tế bào lưỡng bội. Mức độ khác biệt giữa các locut trong
tế bào lớn hay nhỏ phụ thuộc vào việc các gen có được lặp lại trong hệ gen hay
không.
Nghiên cứu đa dạng di truyền có vai trò và ý nghĩa rất quan trọng trong chọn
giống. Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể chọn lọc
và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ cho quá
trình lai tạo giống thông qua chọn lựa các cặp bố mẹ trong các phép lai nhằm thu
được ưu thế lai cao nhất. Đó là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì được nòi giống,
kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi trong điều kiện ngoại
cảnh [10].
1.6. Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền
Chỉ thị di truyền là một thuộc tính hay một đặc điểm có thể đo đếm được và có
khả năng di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Chỉ thị di truyền nhất thiết thiết
phải đảm bảo hai tiêu chuẩn: (i) phải khác biệt giữa bố và mẹ, (ii) phải được truyền lại
chính xác cho thế hệ sau [68].
Các nhà di truyền và chọn giống luôn quan tâm đến chỉ thị di truyền vì tính ưu
việt của nó trong việc nghiên cứu sự kế thừa dấu hiệu di truyền và những biến đổi của
chúng trong quần thể, đặc biệt là tính trạng nông sinh học có lợi cho con
Lê Thị Thu Trang
15
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
người. Chỉ thị di truyền cho phép phát hiện sự sai khác về mặt thông tin di truyền
giữa hai hay nhiều cá thể. Sự sai khác này có thể được phát hiện với nhiều phương
pháp tiếp cận khác nhau, thông qua dữ liệu kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành phần
protein và hoạt chất (chỉ thị hoá sinh) hay sự khác biệt (đa hình) trong ADN (chỉ thị
ADN). Mỗi loại chỉ thị đều có những ưu, nhược điểm cũng như khả năng đánh giá
mức độ đa dạng di truyền khác nhau. Trong đó, chỉ thị hình thái được sử dụng sớm
nhất và là cơ sở ban đầu trong đánh giá phân loại sinh vật, còn chỉ thị hoá sinh và đặc
biệt là chỉ thị ADN hiện nay được sử dụng rộng rãi nhất không chỉ đánh giá đa dạng
di truyền mà còn là công cụ hữu hiệu trong chương trình chọn giống.
1.6.1. Chỉ thị hình thái
Chỉ thị hình thái là loại chỉ thị có thể nhìn thấy, đo đếm được và dễ dàng nhận
biết được ở dạng trội lặn. Thông thường, chỉ thị hình thái biểu hiện dưới một tính
trạng được kiểm soát bởi một locut đơn lẻ thường xuyên điều khiển các đặc điểm
hình thái như các gen qui định màu sắc, hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận
(hạt, vỏ, …). Với ưu điểm dễ dàng tiếp cận và nghiên cứu, không đòi hỏi thiết bị đặc
biệt cũng như quy trình thực hiện phức tạp, chỉ thị hình thái được áp dụng khá rộng
rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật. Trong đánh giá và chọn tạo giống
truyền thống, chỉ thị hình thái được áp dụng phổ biến và hiệu quả ở một số loại cây
trồng như lúa, đậu tương, ngô, khoai [9, 22, 25, 86].
Mặc dù chỉ thị hình thái thường được sử dụng là một chỉ thị trội hoặc đồng
trội, nhưng trong nhiều trường hợp các đặc điểm hình thái lại chịu ảnh hưởng của quá
trình tương tác gen, nhân tố gen nhẩy, điều kiện ngoại cảnh và chỉ thể hiện ở những
giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể. Do đó, kết quả thường có sự sai
lệch giữa các lần đánh giá hoặc trong điều kiện đánh giá khác nhau. Hơn nữa, số
lượng chỉ thị hình thái không nhiều cho mỗi loài sinh vật nên khả năng ứng dụng của
chúng trong nghiên cứu di truyền và chọn giống bị hạn chế rất nhiều. Bên cạnh đó,
việc đánh giá kiểu hình mang tính chất thống kê nên cần thực hiện trên số lượng lớn
đối tượng để đảm bảo độ chính xác. Chính vì vậy sẽ cần diện tích đất đai lớn
Lê Thị Thu Trang
16
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
cũng như nhiều nhân lực và thời gian để gieo trồng và đánh giá đối tượng. Ngoài ra,
do đặc điểm dựa trên kiểu hình để đánh giá kiểu gen nên chỉ thị hình thái không thể là
thước đo chính xác để đánh giá tính đa dạng di truyền giữa các cá thể, nhất là khi
không phải toàn bộ các gen đều thể hiện ra kiểu hình có thể đo đếm được.
1.6.2. Chỉ thị hoá sinh
Protein và các hoạt chất trao đổi khác là sản phẩm của quá trình biểu hiện gen
ở sinh vật. Nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của các sản phẩm này có thể
giúp xác định những khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể và loài khác nhau.
Điện di protein trên gel là phương pháp hữu hiệu có thể giúp phân biệt, nhận diện
giữa các loài và phân loại sinh vật. Các protein, sản phẩm trao đổi chất…được sử
dụng như những chỉ tiêu đánh giá, phân biệt các sinh vật được gọi là chỉ thị hoá sinh.
Chỉ thị hoá sinh được sử dụng phổ biến nhất là các isozyme (các enzyme có trình tự
amino acid khác nhau nhưng cùng xúc tác cho một phản ứng hoá học). Isozyme được
trích ly, tinh sạch và điện di trên gel. Các thành phần trong gel biến tính (thường là
SDS) phá vỡ các cấu trúc bậc cao của chuỗi amino acid và khi đó dưới tác động của
điện trường, các isozyme biến tính sẽ phân tích trên gel dựa trên khối lượng và độ tích
điện. Từ sự đa hình giữa các băng điện di thu được sẽ giúp nhận diện từng cá thể và
đánh giá được sự đa dạng trong quần thể nghiên cứu.
So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị hoá sinh đáng tin cậy hơn bởi mỗi protein là
sản phẩm của một gen, do đó sự đa hình các protein cũng phản ánh gián tiếp sự đa
hình trong kiểu gen của sinh vật. Tuy nhiên, đối với các cá thể có quan hệ di truyền
gần gũi (đặc biệt là giữa các giống cây trồng) thì các sản phẩm biểu hiện gen (protein,
enzyme…) không cho sự đa hình rõ ràng. Cho nên loại chỉ thị này cũng chưa phản
ánh thật chính xác bản chất di truyền của mỗi tính trạng. Do đó khả năng ứng dụng
của chỉ thị hoá sinh còn hạn chế rất nhiều. Bởi vậy trong hầu hết những nghiên cứu
đa dạng di truyền ngày này, chỉ thị ADN được sử dụng phổ biến hơn cả.
Lê Thị Thu Trang
17
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Di truyền học
1.6.3. Chỉ thị phân tử ADN
Đầu những năm 80 của thế kỷ 20, kỹ thuật RFLP ra đời và được biết đến là
loại chỉ thị mới- chỉ thị ADN thế hệ đầu tiên - với những ưu điểm vượt trội so với
những chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá sinh đang được sử dụng trong đánh giá đa dạng
di truyền lúc đó. Tuy nhiên mốc đánh dấu quan trọng nhất của công nghệ chỉ thị phân
tử nói riêng và sinh học phân tử nói chung chính là phát minh phản ứng chuỗi
polymerase (Polymerase Chains Reaction- PCR) của Karl Mullis (1983). Với khả
năng tạo ra vô số bản sao của một đoạn ADN chỉ từ một vài phân tử ADN ban đầu,
đây là phát minh mang tính bước ngoặt, làm thay đổi hoàn toàn cách thức tiếp cận nghiên cứu sinh học phân tử và là cơ sở nền tảng ra đời cho thế hệ chỉ thị phân tử tiếp
theo.
PCR (Polymerase Chains Reaction) là phản ứng nhân gen in-vitro, dựa trên
hoạt tính của loại enzym ADN polymerase chịu nhiệt.
Phản ứng PCR chuẩn có ba giai đoạn nhiệt độ được kiểm soát bởi máy gia
nhiệt. Thành phần phản ứng bao gồm:
1.
2.
Đệm phản ứng bao gồm KCl, MgCl2 và Tris- HCl.
Enzym ADN polymerase chịu nhiệt có khả năng gắn nucleotit vào đầu 3’
của đoạn mồi gắn với ADN khuôn sợi đơn.
3.
Bốn loại deoxyribonucleotit triphosphate (dNTP) là dATP, dCTP,
dGTP và
dTTP.
4.
Hai đoạn mồi oligonucleotit được thiết kế bổ sung đặc hiệu với đoạn ADN
cần nhân lên.
5.
ADN khuôn.
Nguyên lý của phản ứng PCR được thể hiện ở hình 1.3. Dựa trên nguyên lý
của phản ứng PCR, sử dụng các loại mồi oligonucleotit khác nhau (mồi ngẫu nhiên,
mồi đặc hiệu) nhằm nhân lên các vùng trình tự ADN, nhiều chỉ thị ADN đã được phát
triển và ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền như SSR, RAPD AFLP,
Lê Thị Thu Trang
18
ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
