Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (semliki forest virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã thụ thể neurokinin 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Phạm Thị Hồng Nhung

NGHIÊN C ỨU PHÁT TRI ỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI
FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BI

ỂU HIỆN GEN

MÃ THỤ THỂ NEUROKININ 1 PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN C ỨU
DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRI

ỂN THUỐC Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà N ội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Phạm Thị Hồng Nhung

NGHIÊN C ỨU PHÁT TRI ỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI
FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BI

ỂU HIỆN GEN

MÃ THỤ THỂ NEUROKININ 1 PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN C ỨU
DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRI

ỂN THUỐC Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã s ố: 604270

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Đoàn Long

Hà N ội – 2012


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ...........................................................................................................
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LI ỆU
1.1 CÔNG NGH Ệ SINH HỌC PHÂN T Ử TRONG BIỂU HIỆN THỤ
THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) ..........................................................
1.1.1

Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược

1.1.2

Các hệ thống vector ............................................................

1.1.3

Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein ...............

1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) ..................
1.2.1

Virut Semliki Forest (SFV) .................................................

1.2.2

Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản ....................

1.2.3

Tiềm năng ứng dụng khác ủca hệ vector SFV ...................

1.2.4

Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV ............

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN C ỨU ....................................................................
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU ..........................................................
2.2.1

Chuẩn bị tế bào kh ả

2.2.2

Phương pháp tách c

2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trong quá trình phân lập và nhân
dòng .............................................. .............................................................
2.2.4

Thiết kế mồi. ..........

2.2.5

Khuếch đại gen nhờ

2.2.6

Cắt ADN sử dụng en

2.2.7

Tạo cácđoạn ADN s

2.2.8 Phản ứng nối cácđoạn ADN .............................................................
2.2.9
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ TH ẢO LUẬN
3.1 Chuẩn bị tế bào kh ả biến và bi ến nạp ...................................................
3.2 Cải tiến vector pSFV ............................................................................

Sàng l ọc khuẩn lạc

3.3 Tạo ADN tái ổt hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản............43
3.4 Tạo ADN tái ổt hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến...........46
3.5. Sàng l ọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1........................................ 50
KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ
Kết luận.................................................................................................................................. 52
Kiến nghị................................................................................................................................ 52
TÀI LI ỆU THAM KHẢO
Tài li ệu tiếng Việt.............................................................................................................. 53
Tài li ệu tiếng Anh.............................................................................................................. 53
Tài li ệu tiếng web.............................................................................................................. 57
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Bốn họ thụ thể chính............................................................................................... 3
Hình 2. Quy trình và th ời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái ổt hợp trong các
hệ thống biểu hiện khác nhau.............................................................................................. 9
Hình 3. Hệ gen SFV tự nhiên............................................................................................ 13
Hình 4. Cấu trúc vector pSFV cơ bản............................................................................. 15
Hình 5. Cấu trúc vector pHelper........................................................................................ 15
Hình 6. Mô hình ho ạt động của hệ vector SFV........................................................... 16
Hình 7. Cấu trúc của vector pJET1.2............................................................................... 23
Hình 8. Vị trí các mồi trên cADN mã cho thụ thể NK1.............................................. 25
Hình 9. Trình tự vị trí nhân dòng đa điểm của đoạn O-M7...................................... 25
Hình 10. Sơ đồ nghiên ứcu tạo hệ vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8.............27
Hình 11. Sơ đồ nghiên ứcu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong
vector pSFV cải tiến............................................................................................................. 27
Hình 12. Sơ đồ nghiên ứcu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong
vector pSFV cơ bản.............................................................................................................. 28

Hình 13. Đường cong sinh trưởng của E.coli DH5α.................................................. 35
Hình 14. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mã v ỏ capsit của SFV................38
Hình 15. Một phần kết quả giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen
mã v ỏ capsit của SFV......................................................................................................... 39
Hình 16. Vị trí của đoạn chèn thứ 2 trong pHelper...................................................... 39
Hình 17. Ảnh điện di đoạn chèn 2 trên gel agarrose 1%............................................ 40
Hình 18. Ảnh điện di sản phẩm colony PCR kiểm tra khuẩn lạc mang vùng
cải biến.................................................................................................................................... 41
Hình 19. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M7........................... 42
Hình 20. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M8........................... 43
Hình 21. Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA
polymerase.............................................................................................................................. 43
Hình 22. Ảnh điện di sản phẩm cắt pSFV đã m ở vòng b ằng SmaI......................45
Hình 23. Ảnh điện di sản phẩm cắt thu cADN mã cho NK1 t ừ pJET1.2.............46


Hình 24. Ảnh điện di cADN mã cho NK1 ( XhoI/Klenow/ XbaI) sau khi tinh
sạch........................................................................................................................................... 47
Hình 25. Ảnh điện di mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8............................................. 48
Hình 26. Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn
chèn NK1................................................................................................................................. 50
Hình 27. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809.......................................... 51


DANH MỤC CÁC B ẢNG
Bảng 1. Một số promoter được bổ sung vào các vectơ biểu hiện............................ 6
Bảng 2. Trình tự, kích thước một số đuôi ái lực........................................................... 8
Bảng 3. Các vị trí cắt của một số protease phổ biến..................................................... 8
Bảng 4. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên ứcu.................................................. 24
Bảng 5. Trình tự các oligonucleotit ửs dụng trong nghiên ứcu................................ 24

Bảng 6. Phản ứng cắt với enzym giới hạn................................................................... 31
Bảng 7. Điều kiện của phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN....................... ..32
Bảng 8. Thành ph ần của phản ứng nối ADN và vector đầu bằng.........................33
Bảng 9. Thành ph ần của phản ứng nối ADN và vector đầu dính.......................... 33
Bảng 10. Điều kiện của phản ứng nối linker................................................................ 34
Bảng 11. Tần số biến nạp của một số lô t ế bào kh ả biến....................................... 36
Bảng 12. Thành ph ần và điều kiện của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen
mã v ỏ capsit của SFV......................................................................................................... 38
Bảng 13. Thành ph ần và điều kiện phản ứng cắt thu đoạn chèn 2........................ 40
Bảng 14. Thành ph ần và điều kiện phản ứng PCR sàng l ọc khuẩn lạc chứa
vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8................................................................................ 41
Bảng 15. Quy trình cho phản ứng nhân dòng đoạn cADN mã hóa cho th ụ thể
NK1........................................................................................................................................... 44
Bảng 16. Thành ph ần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV bằng SmaI.............44
Bảng 17. Thành ph ần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV đã m ở vòng b ằng
XhoI........................................................................................................................................... 45
Bảng 18. Thành ph ần và điều kiện của phản ứng chống tự đóng vòng c ủa
pSFV......................................................................................................................................... 46
Bảng 19. Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính.........47
Bảng 20. Quy trình mở vòng pSFV c ải biến và ki ểm tra hiệu suất mở vòng. .48
Bảng 21. Quy trình tạo 1 đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến.......................49
Bảng 22. Thành ph ần và điều kiện của phản ứng colony PCR để xácđịnh
khuẩn lạc tái ổt hợp pSFV-NK1....................................................................................... 50


BẢNG CÁC KÝ HI

ỆU VÀ T Ừ VIẾT TẮT

ADN

Axit deoxyribonucleic

bp

Base pair (Cặp bazơ nitơ)

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Axit ethylene diamine
tetraacetic)

GPCR

Thụ thể kết cặp G- protein

kb

kilobase (= 1000 bp)

LB

Lubertani Broth

NK1

Neurokinin-1

Nu

Nucleotit

OD

Optical density (Mật độ quang học)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

ARN

Axit ribonucleic

SFV

Semliki Forest Virut

SOC

Super Optimal broth with Catabolite repression

TAE

Đệm Tris/Axit acetic/EDTA

BẢNG VIẾT TẮT CÁC AXIT AMIN
Ala (A): alanin

Leu (L): leucin

Arg (R): arginin

Lys (K): lysin

Asn (N): asparagin

Met (M): methionin

Asp (D): axit aspartic

Phe (F): phenylalanin

Cys (C): cystein

Pro (P): prolin

Gln (Q): glutamin

Ser (S): serin

Glu (E): axit glutamic

Thr (T): threonin

Gly (G): glycin

Try (W): trytophan

His (H): histidin

Tyr (Y): tyrosin

Ile (I): isoleucin

Val (V): valin



Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

MỞ ĐẦU
Mặc dù là m ột ngành m ới ra đời nhưng những thành t ựu mà công ngh
ệ sinh học phân t ử (molecular biotechnology) đã mang l ại là r ất lớn. Những
bước phát triển nhanh chóng c ủa công ngh ệ sinh học phân t ử trong các ĩlnh
vực như điều chế dược liệu, tạo ra kháng thể đơn dòng, s ản xuất vacxin,
thành công trong giải trình tự hệ gen người... đã góp ph ần đắc lực giúp con
người trong công cu ộc đấu tranh chống bệnh tật và không ng ừng cải thiện,
nâng cao ch ất lượng cuộc sống.
Ngày nay, bi ểu hiện protein tái ổt hợp là m ột phần quan trọng của công

nghệ sinh học phân t ử với nhiều ứng dụng rộng rãi trong l ĩnh vực y dược. Biểu
hiện được protein quan tâm trên tế bào động vật và ng ười có th ể giúp thiết lập
những mô hình điều trị bệnh bằng liệu pháp gen, bao gồm cả điều trị ung thư. Biểu
hiện protein tái ổt hợp đặc biệt là các protein thụ thể kết cặp G-protein (G-protein
coupled receptor, viết tắt là GPCR) ph ục vụ hữu ích cho các nghiênứcu phát triển
thuốc, tìm hiểu cấu trúc và chức năng sinh học của các thụ thể, qua đó làm sáng tỏ
các conđường truyền tin nội bào. Các protein thụ thể kết cặp G-protein liên quan
trực tiếp đến sự phát sinh nhiều bệnh lý ở người, là “ đích” có vai trò quan tr ọng
bậc nhất trong các chương trình sàng l ọc các dược chất mới . Các nhà khoa học
luôn mong mu ốn xây d ựng được các hệ thống biểu hiện GPCR chủ động ở mức
độ cao để dùng cho các nghiênứcu dược lý h ọc phân t ử, các thí nghiệm sàng l ọc
để phát hiện các dược chất mới và phát triển dược phẩm.
Trên thế giới, một số hệ thống biểu hiện GPCR tiềm năng đã được thiết
lập và th ử nghiệm, chẳng hạn như hệ thống dịch mã phi t ế bào, các hệ thống biểu
hiện ở tế bào nhân s ơ (E.coli và Halobacterium salinarum) và nhân chu ẩn (nấm
men, côn trùng và động vật có vú). Một số GPCR đã được biểu hiện thành công
trên các ệh thống này ở mức độ cao từ 1 đến 10 mg/l môi tr ường nuôi c ấy
[19]. Trong các hệ thống biểu hiện trên, hệ thống sử dụng hệ vector Semliki

Forest Virut (SFV) được ghi nhận là m ột trong những hệ thống có nhi ều đặc
điểm ưu việt và giàu ti ềm năng ứng dụng [34]. Tuy vậy, hiện nay SFV không
1


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

được thương mại hóa r ộng rãi do s ự độc quyền sử dụng tại một số phòng thí
nghiệm của các hãng dược phẩm (như Roche, Novartis).

Với tiềm năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực sinh – y – d ược và h ệ vector
SFV cơ bản được tặng từ GS. Kenneth Lundstrom (hãng d ược phẩm Roche, Thụy
Sĩ) và ngu ồn cADN mã hóa cho th ụ thể kết cặp G-protein neurokinin 1 (NK1) của
người Việt Nam đã được phân l ập và nhân dòng thành công t ừ đề tài ĐTPTNTĐ.2011-G/04, chúng tôi đề xuất và th ực hiện đề tài: “ Nghiên ứcu

phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và bi ểu hiện
gen mã hóa th ụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiênứcu dược lý và phát
triển thuốc ở Việt Nam” v ới mục tiêu lâu dài là xây đựng được hệ thống biểu
hiện các protein GPCR có thể được dùng như một công c ụ công ngh ệ sinh học
hiệu quả trong các nghiênứcu về sinh học thụ thể ở người Việt Nam sau này,
đồng thời phục vụ cho các nghiênứcu dược lý h ọc, sàng l ọc và phát triển
dược phẩm ở cấp độ phân t ử và t ế bào.

2


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LI ỆU
1.1 CÔNG NGH Ệ SINH HỌC PHÂN T Ử TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ
KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR)
1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm
Thụ thể là m ột lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu
ngoại bào, truy ền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tin nội bào d ẫn đến đápứng tế
bào giúp cơ thể đápứng kịp thời với sự thay đổi của môi tr ường. Để thực hiện
được chức năng đó, th ụ thể có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hoặc một số
phân t ử tín hiệu đặc thù được gọi là ph ối tử (ligand) và ph ức hệ “ligand – th ụ
thể” s ẽ khởi đầu một quá trình truyền tin nội bào và gây nên đápứng tế bào [3].

Có 4 h ọ thụ thể chính (Hình 1), trong đó th ụ thể kết cặp G-protein (viết
tắt là GPCR) là h ọ protein lớn và đa dạng nhất ở người [33]. Thụ thể kết cặp
G-protein là nhóm th ụ thể xuyên màng sinh chất và ho ạt động nhờ sự kết cặp
với một loại protein hoạt động bởi liên kết với GTP (tức là G-protein). GPCR d
ẫn truyền tín hiệu cho nhiều dạng phối tử, bao gồm các hóc môn, peptit thần
kinh, các chemokine…Trong c ơ thể, các GPCRđược biểu hiện trên hầu hết các
kiểu tế bào và ước tính có đến 1000 GPCR khác nhauở người [52].

Hình 1. Bốn họ thụ thể chính (nguồn: Gunnar Schulte, 2008 [18])
Sự thay đổi về mật độ cũng như trạng thái hoạt hóa c ủa các GPCR là
nguyên nhân trực tiếp gây nên nhiều bệnh cấp tính và mãn tính nh ư tiểu đường,
các bệnh tim, trầm cảm, viêm nhiễm và ung th ư [31]. Các GPCR là đích tác
động chính của hơn 50% các loại dược phẩm đang được sử dụng trong điều trị.

3


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

Riêng năm 2001, nhóm thu ốc này đem đến doanh thu trên 30 ỷt USD và ước
tính con số hiện nay còn cao h ơn [25].
Mặc dù GPCR có ý ngh ĩa thực tiễn to lớn song có hai tr ở ngại lớn khi
sử dụng các GPCR ựt nhiên (native) trong các nghiênứucdược lý h ọc phân t ử
và sàng l ọc thuốc. Thứ nhất là các GPCR tự nhiên thường chỉ được biểu hiện ở
mức độ rất thấp (khoảng vài fmol/mg protein màng t ế bào) nên thường không s
ẵn có để dùng cho các thí nghiệm sàng l ọc. Thứ hai là trong các mô hình thử
nghiệm ở cácđộng vật thí nghiệm, các GPCR thường đồng thời tồn tại ở nhiều

dạng phụ (subtype) khác nhau hoặc các dạng biến thể (variants/polymorphic
alleles) khác nhau, dẫn đến có th ể có nh ững nhận định nhầm về khả năng
tương tác ủca các “thu ốc thử” (test compound) v ới các thụ thể đích nếu đối
tượng thí nghiệm lấy mẫu ngẫu nhiên không đại diện cho nhóm ph ổ biến nhất
(các alen kiểu dại). Có thể nhận thấy những khó kh ăn trên có thể được khắc
phục bằng việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền nhằm biểu hiện các GPCR táiổ
thợp của người. Các GPCR tái ổt hợp được biểu hiện ở mức độ cao sẽ cung
cấp nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm xácđịnh hoạt tính liên kết với phối tử
cũng như chức năng liên kết của các G-protein. Chính bởi vậy, xây d ựng các hệ
thống biểu hiện GPCR nhanh và hi ệu quả là m ột hướng nghiên ứcu có ý ngh ĩa
quan trọng và mang lại nhiều lợi ích thiết thực trong sàng l ọc và nghiên cứu phát
triển dược phẩm.
1.1.2 Các hệ thống vector
Ý

t ưởng về vector mang gen ngoại lai bắt nguồn từ các plasmit vi khuẩn. Vector là phân t ử

ADN có kh ả năng tự tái bản, tồn tại độc lập trong tế bào ch ủ

và mang các gen cần chuyển. Sau khi vector ngoại lai được đưa vào t ế bào ch
ủ, chúng sử dụng bộ máy sao chép ủca tế bào ch ủ để nhân b ản đến số lượng
cần thiết và bi ểu hiện các gen chúng mang [1].
Đến nay, đã có h ơn 2600 vector được chia làm 3 nhóm chính là plasmit
(nguồn gốc từ vi khuẩn), phagơ (nguồn gốc từ virut) và nhi ễm sắc thể nhân t ạo
[46]. Chuyển gen vào các tế bào động vật có th ể tiến hành b ằng cách gây nhiễm

các phagơ mang gen tái ổt hợp quan tâm ho ặc chuyển gen trực tiếp thông qua
plasmit. Có r ất nhiều vector biểu hiện trênđộng vật có vú có ngu ồn gốc từ virut
4

Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

được dùng trong sản xuất protein, liệu pháp gen và phát triển vacxin mới (Phụ
lục-1).
Hiệu quả biểu hiện gen đặc biệt là trong các tế bào động vật có vú không
đơn thuần thể hiện ở tốc độ sản xuất protein mà còn ph ụ thuộc vào nhi ều yếu
tố như các nhân tố kiểm soát phiên mã và ịdch mã, quá trình biênậtp và s ự ổn
định của ARN, số lượng bản sao của gen ngoại lai, khả năng gây độc của các
protein tái ổt hợp với tế bào c ũng như cácđặc tính di truyền của tế bào ch ủ.
Giá trị của vector ở chỗ nó được thiết kế sao cho thuận tiện với mục đích
sử dụng. Không có h ệ vector nào toàn n ăng cho chuyển gen và bi ểu hiện mà c ần
có s ự chọn lựa tùy theo mục đích và kích th ước của đoạn gen được tạo dòng
[66]. Các vector liênụct được cải tiến thuận lợi cho việc chuyển gen, sản xuất

và thu hồi protein ngoại lại một cách hiệu quả. Dưới đây tóm l ược một số xu
hướng cải tiến vector phổ biến và ý ngh ĩa của chúng.
1.1.2.1 Tạo các vector ADN ừt hệ gen virut có b ản chất ARN
Nhiều virut có h ệ gen ARN có ti ềm năng phát triển thành các vector biểu
hiện mạnh. Các phiên ảbn vector ADN của virut ARN được thiết lập là m ột
bước cải tiến lớn đem lại các hệ thống biểu hiện mạnh hơn (đặc biệt ở tế bào
động vật có vú), dễ dàng thao tác với các enzym và thuận lợi cho quá trình chèn
cácđoạn ADN ngoại lai đồng thời hạn chế được các bước xử lý trong điều kiện
chuyên biệt dành cho ARN và d ịch mã ARN có m ũ đầu 5’ trong ống nghiệm [6].
Nhiều nghiên ứcu xây d ựng vector ADN dựa trên hệ vector ARN gốc đã được
tiến hành, ch ẳng hạn như các hệ vector ADN có ngu ồn gốc từ ARN hệ gen của
virut Sindbis [54].
1.1.2.2 Thêm hoặc cải tiến các vùngđiều khiển

Những hiểu biết ngày càng sâu s ắc về các trình ựt mã cho các tín hiệu
điều khiển quá trình phiên mã, biênậ pt mARN và d ịch mã có th ể thêm vào
vector giúp chúng ta chủ động điểu khiển hiệu suất biểu hiện theo ý mu ốn.
Trình tự Kozak GCC(A/G) CCATGG ở động vật có x ương sống hoặc trình
tự tương đương CAAAACATG ở côn trùng b ất cứ khi nào xu ất hiện đều làm t
ăng hiệu suất dịch mã ARN [1]. Ngoài ra, đoạn trình tự này còn khuy ến
5


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

khích loại bỏ các vùng có thể ức chế dịch mã n ằm ngược dòng ATG hay vùng
cấu trúc thứ cấp ở đầu 5’ không mã hóa [15].
Lựa chọn các trình ựt tăng cường hay các promoter mạnh có hi ệu suất
phiên mã cao để thêm hoặc thay thế cho promoter gốc của vector sẽ giúp tắng
cường mức độ biểu hiện protein. Bảng 1 trình bày m ột số promoter có th ể thêm
vào vector bi ểu hiện trênđộng vật có vú.
Bảng 1. Một số promoter được bổ sung vào các vector biểu hiện
(nguồn: Gerstein, 2001 [15])
Promoter
EF-1α
CMV
RSV
SV40 muộn
SV40 sớm
* Promoter SV40 sớm được coi là có
khác.

độ mạnh là 1 để so sánh với các promoter

Nhiều tín hiệu kết thúc phiên mã ủca sinh vật nhân s ơ đã được nghiên
cứu và được sử dụng rộng rãi trong các vector biểu hiện . Ở sinh vật nhân chu
ẩn, trình tự ATCAAA(A/T)TAGGAAGA đã được xácđịnh là vùng k ết thúc phiên
mã c ủa chín gen được nghiên ứcu [36].
Đuôi polyadenin – polyA (50-250 phân t ử adenyl nối tiếp nhau) thêm sau
mARN có vai trò quan tr ọng giúp ổn định và d ịch chuyển ARN từ nhân ra t ế
bào chất để dịch mã. M ặc dù trình tự polyA cách xađiểm khởi đầu dịch mã nh
ưng nó có tác dụng tăng cường sự tái hoạt động của ribosom nên trực tiếp làm t
ăng cường hiệu suất dịch mã [1]. Có m ột số tín hiệu polyadenin hóa hi ệu quả
đã được sử dụng trong vector biểu hiện của động vật có vú có ngu ồn gốc từ
gen mã cho hoóc môn t ăng trưởng của bò, β- globin chuột, đơn vị phiên mã sớm
của SV40 và gen mã cho thymidine kinase c ủa Herpes simplex.
Các mã kết thúc (TAG, TAA, TGA) cũng có th ể xem xétđể thêm vào sau
vùng nhân dòng đa điểm nhằm tăng cường sự kết thúc dịch mã trong tr ường
hợp cácđoạn cài mã gen ngo ại lai thiếu các mã này hoặc để tăng hiệu quả hoạt
động của các yếu tố kết thúc dịch mã (RF) [1].
6


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

1.1.2.3 Mở rộng và đa dạng hóa các vùng nhân dòngđa điểm
Các phiênảbn vector đầu tiên dựa trên trình ựt nguyên gốc của plasmit
hoặc phage có vùng nhân dòng đa điểm (multiple cloning site-MCS) rất hạn chế.
Các vị trí nhân dòng đa điểm là n ơi mà các enzym giới hạn nhận biết để cắt rời
làm ch ỗ lắp rápđoạn gen ngoại lai vào. Các trình tự này th ường nằm xa điểm

khởi đầu tái bản để tránh bị cắt nhầm. Để thuận lợi cho quá trình nhân dòng
gen ngoại lai, các vector gốc thường được bổ sung thêm cácđoạn nối (linker)
mang vị trí nhân dòng đa điểm mới. Các vị trí nhân dòng đa điểm mới phải đảm
bảo không có trong trình t ự gốc của vector, ưu tiên cho các enzym ớgi hạn tạo
được đầu tương thích với nhiều enzym giới hạn khác [2].
1.1.2.4 Thêm các vùng gen giúp sàngọcl thể tái ổt hợp
Các gen kháng kháng sinh giúpọnchlọc các dòng tế bào ch ứa vector tái
tổ hợp thường được thêm vào hầu hết các vector. Các gen kháng kháng sinh hay
được sử dụng là gen mã h ọ kháng sinh penicillin (bao gồm ampicillin) tácđộng
ức chế hình thành thành t ế bào vi khu ẩn hoặc kanamycin, tetracyclin và
chloramphenicol ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn thông qua ức chế sinh tổng
hợp protein vi khuẩn.
Các gen báo cáo (reporter genes) giúp xácđịnh plasmit có ch ứa đoạn chèn
gen ngoại lai mong muốn cũng có th ể được cài vào vector. Gen lacZ là m ột gen
báo cáođi ển hình, mã hóa cho β-galactosidase có kh ả năng cắt galactose. Vị trí
nhân dòng đa điểm nằm trong gen LacZ và n ếu đoạn chèn được cài thành công
vào vector s ẽ làm b ất hoạt β-galactosidase. Chính vì vậy, tế bào ch ứa vetor có
đoạn chèn quan tâm có th ể được xácđịnh bằng phương pháp chọn khuẩn lạc
xanh/trắng trên môi trường chứa X-gal [2].
1.1.2.5 Thêm cácđoạn epitop và các vị trí cắt của protease
Trong vài n ăm gần đây, m ột số epitop peptit và protein r ất nhỏ còn được
gọi là các đuôi ái lực (affinity-tag) được gắn vào protein tái tổ hợp để tăng cường
sản xuất các protein này [22]. Cácđuôi ái lực này có đặc điểm chung là: không gây
đápứng miễn dịch; tinh sạch một bước bằng cột lọc có ch ất gắn thích hợp; có ảnh
hưởng tối thiểu lên ấcu trúc và hoạt động sinh học của protein tái ổt
7


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

hợp mà nó g ắn vào; có th ể loại bỏ dễ dàng và đặc hiệu để sản xuất các protein
dạng nguyên gốc; phân tích protein tái tổ hợp đơn giản và chính xác trong quá
trình tinh sạch; áp dụng được cho một số loại protein khác nhau. Mỗi loại đuôi ái
lực được tinh sạch với một loại đệm đặc hiệu và trong m ột số trường hợp các
đoạn peptit này có th ể không c ần loại bỏ khỏi protein đích. Cácđoạn peptit nhỏ
được sử dụng nhiều nhất hiện nay là poly-Arg-tag, FLAG-tag, poly-His-tag, cmyc-tag, S-tag và Strep II-tag. Trình t ự của một số đuôi ái lực phổ biến được
trình bày trong B ảng 2.
Bảng 2. Trình tự, kích thước một số đuôi ái lực
Đuôi ái lực
Poly-Arg
Poly-His
FLAG
Strep II
c-myc
S
HAT
3x FLAG
Glutathione
S-transferase
Các trình ựt mã hóa cho v ị trí cắt của protease cũng thường được thêm
vào sau trình t ự của cácđuôi ái lực để loại bỏ cácđuôi ái lực này và thu h ồi dạng
protein tái ổt hợp nguyên bản. Các vị trí cắt của một số protease được trình bày
trong Bảng 3. Các vị trí cắt của protease được lựa chọn sao cho không có v ị trí
tương tự trong protein tái ổt hợp được quan tâm.
Bảng 3. Các vị trí cắt của một số protease phổ biến
Protease
Factor Xa
Enterokinase

Thrombin
PreScission


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

1.1.3 Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein
Biểu hiện protein tái ổt hợp đã tr ở thành công c ụ chủ chốt trong nghiên
cứu cơ bản và ứng dụng trong vòng 20 n ăm trở lại đây. M ặc dù có nhi ều hệ
thống biểu hiện đã được phát triển khá ốtt cho các protein hòa tan trong tế bào
nhân s ơ và nhân th ật, thì đến nay biểu hiện hiệu suất cao và ch ủ động các
protein xuyên màng tế bào v ẫn là m ột thách thức lớn. Khả năng biểu hiện
GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới cấu trúc và hình dạng của các loại
protein này. Các GPCR với 7 vùng xuyên màng được tạo ra ở mức độ thấp do
yêu ầcu cuộn gập, vận chuyển và kh ả năng gây độc tính đối với tế bào.

Hình 2. Quy trình và th ời gian yêu ầcu để sản xuất GPCR tái ổt hợp trong các
hệ thống biểu hiện khác nhau (nguồn: Nambi, 2003 [43])
Trong phần này, các tính chất cũng như những thành t ựu của các hệ thống
biểu hiện bao gồm hệ thống dịch mã phi t ế bào, các vector nhân sơ và nhân chuẩn
sử dụng cho việc biểu hiện mạnh các GPCR táiổ thợp sẽ được trình bày tóm l ược
(xem thêm Hình 2).Đa phần trong số chúng đã được sử dụng cho việc
9


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

biểu hiện GPCR tuy nhiên các nghiênứuccũng chỉ ra rằng: không có m ột hệ
thống nào là toàn n ăng cho việc biểu hiện mức độ cao tất cả các loại GPCR.
1.1.3.1 Hệ thống dịch mã phi t ế bào
Hệ thống dịch mã phi t ế bào được xây d ựng từ dịch thủy phân E.coli
hoặc dịch thủy phân t ế bào m ầm lúa mì. Hệ thống chứa các nhân tố tham gia
phản ứng phiên mã và dịch mã đồng thời được cung cấp thêm liênụct các
nucleotit, các axit amin và các ợhp chất thiết yếu khác [37].
Hệ thống biểu hiện phi tế bào áp dụng để dịch mã nhanh các sản phẩm
PCR mã cho các protein hòa tan đơn giản với lượng lớn cỡ hàng ch ục
milligram một cách nhanh chóng (khoảng 4 ngày). Tuy nhiên, hệ thống dịch mã
phi t ế bào vẫn tồn tại nhiều hạn chế như chi phí cao, quy trình kỹ thuật phức
tạp. Sự biểu hiện của các protein xuyên màngớln, đặc biệt là các GPCR chưa
từng thành công b ằng sử dụng hệ thống này [26].
1.1.3.2 Biểu hiện ở tế bào nhân s ơ
Ưu điểm của biểu hiện trên cácế tbào nhân s ơ là chi phí r ẻ, đơn giản,
nhanh (khoảng 11 ngày) và d ễ mở rộng quy mô s ản xuất các protein táiổ thợp. Tuy
nhiên, hệ biểu hiện này có nh ược điểm cơ bản là không có c ơ chế biến đổi sau
dịch mã nên các protein phức tạp và l ớn, như GPCR, thường được biểu hiện
ở dạng không có ho ạt tính đầy đủ do không được cuộn gập chính xác hoặc

được biến đổi sau dịch mã nh ư dạng tự nhiên [43].
Tuy vậy, đến nay một số GPCR đơn giản đã được biểu hiện bởi hệ thống
này nh ằm nghiên ứcu cấu trúc. E.coli, Halobacterium salinarum, Lactococcus lactis
là nh ững chủng vi khuẩn được dùng làm t ế bào ch ủ biểu hiện phổ biến hơn cả. 11
GPCR gắn đuôi His ở đầu C đã được biểu hiện trênE.coli với hiệu suất biểu hiện
khác nhau ừt 0.1 đến 10% tổng số protein tế bào [24]. Th ụ thể muscaricnic M1 và
serotonin 5-HT2C đã được tiến hành bi ểu hiện trên

H.salinarum [53]. L. lactis là m ột vi khuẩn Gram dương thường được sử dụng

để biểu hiện các protein màng nhằm xácđịnh dạng prokaryote nguyên gốc [28].
10


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

1.1.3.3 Biểu hiện ở nấm men
Ưu điểm của biểu hiện protein tái ổt hợp ở tế bào n ấm men là d ễ nuôi
cấy, thu được sinh khối lớn và có h ệ thống biến đổi sau dịch mã g ần tương đồng
với tế bào động vật. Thụ thể dopamine D1A ở người đã được biểu hiện thành
công ở Saccharomyces cerevisiae và được thu hồi nhờ đuôi His 6 [4]. Nấm

Schizosaccharomyces pombe sở hữu hệ thống truyền tín hiệu giống động vật có
vú và có th ể glycosyl hóa, th ụ thể dopamine D2 ở người đã được biểu hiện trên
màng n ấm S. pombe với lượng cao gấp ba lần so với biểu hiện trênS.cerevisiae
[44]. Nấm Pichia pastoris được đánh giá là chủng nấm biểu hiện gen tốt nhất bởi

khả năng biến đổi sau dịch mã bao g ồm glycosyl hóa, t ạo các liênếkt disulfit

và phân c ắt protein [7]. Khoảng 100 GPCR trong chương trình nghiên cứu hệ
gen cấu trúc của MePNet đã được biểu hiện thành công v ới hiệu suất 95% ở các
tế bào P.pastoris.
Mặc dù vậy, thành t ế bào n ấm dày th ường được coi là m ột trong những
trở ngại cho hiệu suất tinh sạch và thu h ồi protein tái ổt hợp. Bên ạcnh đó, quy
trình sản xuất GPCR ở nấm men cũng thường tốn nhiều thời gian (khoảng 18

ngày).
1.1.3.4 Biểu hiện ở các ết bào côn trùng

Ưu điểm lớn nhất của biểu hiện ở các ết bào côn trùng là t ế bào côn trùng

sở hữu một lượng lớn các quy trình cải biến giống với động vật có vú. Thêm
nữa, các ết bào côn trùng được nuôi c ấy trong môi tr ường bán ổtng hợp nên dễ
dàng m ở rộng quy mô s ản xuất protein mặc dù chi phí cao hơn so với nuôi c ấy
nấm men và vi khu ẩn.
Hệ thống vector baculovirut lây nhi ễm trên ết bào côn trùng được đánh
giá là một trong những hệ thống biểu hiện GPCR hiệu quả nhất [35]. Virut thuộc
nhóm này được sử dụng phổ biến hơn cả là virut Autograha californica nuclear
polyhedrosis (AcMNPV). AcMNPV có th ể lây nhi ễm các dòng tế bào côn trùng
như Sf9 và Sf21 và nhân lên trong chúng. Nhờ promoter của baculovirut hoạt
động mạnh, các gen ngoại lai được biểu hiện mạnh và có th ể được tích lũy với
11


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

lượng lớn trong giai đoạn muộn của pha đóng gói h ạt virut mới (thường kéo dài
khoảng 2 giờ). Thời gian của một quy trình sản xuất protein GPCR tái ổt hợp kể
tử khi bắt đầu phân l ập gen đích vào kho ảng 21 ngày [23]. H ệ thống vector
baculovirut đến nay đã được sử dụng thành công trong s ản xuất nhiều thụ thể
GPCR, như các thụ thể adrenegic, opioid, histamine, serotonine … nh ưng chủ
yếu phục vụ cho các nghiênứcu về cấu trúc và chức năng của các thụ thể. Các
protein xuyên màng được biểu hiện bởi hệ thống biểu hiện baculovirut thường
có hi ệu suất thu protein vào kho ảng 18 đến 71 pmol/mg protein, nghĩa là t ăng
hàng nghìn l ần so với mức biểu hiện trong tự nhiên [38].
Tuy nhiên, ựs khác biệt chính giữa tế bào động vật có vú và côn trùng
luôn t ồn tại, ví dụ như quá trình N-glycosyl hóa ở tế bào côn trùng đơn giản

hơn và ch ứa nhiều manose hơn tế bào động vật có vú [21].
1.1.3.5 Biểu hiện trên ết bào động vật có vú
Vật chủ tối ưu biểu hiện các gen mã cho GPCR của động vật có vú hiển
nhiên chính là cácết bào động vật có vú với đầy đủ các ơc chế biến đổi, vận
chuyển cũng như sự có m ặt của G-protein. Các vector virut nhiễm trên ết bào
động vật có vú có th ể cải thiện mức độ biểu hiện một cách hiệu quả nhờ có
kh ả năng di chuyển từ tế bào ch ủ này sang t ế bào ch ủ khác và có các
promoter ấrt mạnh, những promoter này được đánh giá làđỉ“nh cao” c ủa biểu
hiện gen.
Gần như phần lớn các protein màng được sản xuất một lượng lớn trong
môi tr ường nuôi c ấy huyền phù dựa trên hệ thống biểu hiện của Semiliki Forest
virut (SFV). Đây là m ột loại alpha virut có h ệ gen ARN mạch đơn. Hiệu quả biểu
hiện các protein xuyên màng ủca người bởi hệ thống SFV trong một số trường hợp
tỏ ra hiệu quả hơn so với hệ thống biểu hiện baculovirut, có l ẽ nhờ khả năng biến
đổi protein sau dịch mã ở các dòng tế bào động vật có vú, như CHO, HEK hay
U20S. Các vector SFVđến nay đã được ứng dụng biểu hiện cho hơn 100 GPCR và
m ức độ biểu hiện trong phần lớn trường hợp là r ất cao khi đo bằng phối tử đánh
dấu và Western blot [32]. Tuy v ậy, so với hệ thống biểu hiện của baculovirut, hệ
thống biểu hiện của SFV có giá thành cao hơn và v ẫn luôn cần sự quan tâm đáng
kể về khía cạnh an toàn sinh h ọc khi thao tác.
12


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT)
1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV)
SFV là virut có h ệ gen ARN (+) thuộc họ Togaviridae, chi Alpha virut. Nó

được phân l ập lần đầu tiên ừt muỗi ở Uganda năm 1944 [49]. Đây là m ột virut
có c ấu trúc tương đối đơn giản. Hệ gen SFV dài 11442 nucleotit (không tính mũ
5’ và đuôi poly A) v ới 2 khung đọc mở mã cho 2 chu ỗi polyprotein (xem Hình
3). SFV có 4 protein phi c ấu trúc (non-structural proteins, viết tắt là nsPs) từ
nsP1 đến nsP4 cấu thành nên enzym ARN replicase, còn lại là các protein cấu
trúc vỏ capsit (protein C) và v ỏ ngoài (protein E1, E2, E3). M ột protein nhỏ 6 kD
được mã hóa trong vùng gen c ấu trúc không được dùng để cấu thành virut m
ới. Các protein ấcu trúc được mã hóa b ởi đoạn ARN được ký hi ệu là 26S,
trong khi các protein phi cấu trúc được dịch mã t ừ ARN 42S của hệ gen. Cả
protein cấu trúc và phi cấu trúc được tạo thành t ừ sự phân tách 2 chuỗi
polyprotein nhờ cơ chể cắt sau dịch mã [50].

Hình 3. Hệ gen SFV tự nhiên (nguồn: Lundstrom K., 2003 [32])
Trong chi Alpha virut, SFV được coi là h ệ thống biểu hiện gen tốt bởi
vòng đời virut ngắn, phổ vật chủ rộng, có kh ả năng tự nhân h ệ gen của bản
thân và ch ỉ cần bộ máy dịch mã c ủa vật chủ để tái ạto [14].
Trong chu trình nhân lên (tái ảbn) thông th ường, SFV lây nhi ễm vào t ế bào
ch ủ và kh ởi đầu quá trình nhân lên ằbng cách dịch mã ở 2/3 đầu 5’ c ủa đoạn
ARN(+). Đoạn polyprotein được dịch mã s ẽ phân c ắt thành 4 protein phi c ấu trúc
hình thành nên enzym ARN replicase. Phức hệ ARN replicase có đích là trình tự đầu
3’ c ủa ARN (+), chúng tổng hợp lên ợsi ARN (-) có chi ều dài đầy đủ từ sợi ARN
(+). Protein cấu trúc cần cho lắp ráp virut trưởng thành được mã

13


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

hóa b ởi 1/3 đoạn gen còn l ại của hệ gen virut, vùng này được sao chép bằng
enzym SFV replicase và d ịch mã cho ra protein v ỏ. Protein vỏ capsit nhận tín
hiệu đóng gói n ằm ở vùng mã hóa cho nsP2 và cùng v ới sợi ARN có chi ều dài
đầy đủ tạo nên nucleocapsit [13]. Cấu trúc này dung hợp và m ọc chồi từ màng
t ế bào để tạo thành d ạng virut trưởng thành có kh ả năng lây nhi ễm.
SFV không gây b ệnh truyền nhiễm ở người, mặc dù có m ột báo cáoềv
một đợt bùng phát ốst nhẹ trong binh lính Phápở Cộng hòa Trung Phi được giả
thiết là do SFV [39]. Nhìn chung, SFV được coi là ít nguy hi ểm cho nhân viên
phòng thí nghi ệm hơn các togavirut khác. Vì những lí do này, SFV được phân
loại là virut an toàn sinh h ọc độ 3 ở Mỹ, nhưng có m ột số khuyến cáo ằrng mọi
hoạt động vẫn nênđược tiến hành ở độ 2 (U. S. HHS Publication no. (CDC) 938395, 1993). Ở Liên Minh Châu Âu, SFV được xếp là virut an toàn sinh h ọc độ
2 (E. C. Council Directive 93/88/EEC, 1993). Các vector biểu hiện SFV không
mang các gen ấcu trúc được xếp vào an toàn sinh h ọc độ 2 ở cả Mỹ và Châu Âu
[11].
1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản
Hệ vector SFV cơ bản chúng tôi được tặng bởi GS. Kenneth H.
Lundstrom, Roche AG (Basel, Thụy Sĩ) gồm vector nhân dòng các gen quan tâm
pSFV dài 11489 bp và vector bi ểu hiện các protein ấcu trúc pHelper dài 8650 bp.
Hai vector này có b ản chất là ADN, c ấu trúc cụ thể của chúng được nêuở dưới
đây.
1.2.2.1 Cấu trúc của pSFV cơ bản
pSFV chứa trình tự mã hóa cho ph ức hệ replicase gồm 4 protein phi cấu
trúc (kí hiệu từ nsP1đến nsP4) dài 7381 Nu (nsP1: 86-1096 (737 axit amin), nsP2:
1697-4090 (798 axit amin), nsP3: 4091-5536 (482 axit amin), nsP4: 5537-7378
(614 axit amin). Theo sau là vùng nhân dòng đa điểm và đoạn gen mã hóa cho
protein cấu trúc đã b ị xóa đi phần lớn (∆sP). Vùng nhân dòng đa điểm của pSFV
rất hạn chế nhưng có th ể cải tiến thêm cácị vtrí nhận biết cho các enzym mới
bằng cách thêm những đoạn oligonucleotit thích hợp. Ngoài ra, pSFV được cải
tiến với promoter mạnh CMV, 3 mã k ết thúc nằm liên tiếp nhau sau vị trí nhân
dòng đa điểm, đuôi polyadenyl và tín hi ệu kết thúc phiên mã ủca virut SV40.

14


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

Hình 4. Cấu trúc vector pSFV cơ
bản 1.2.2.2 Cấu trúc của pHelper
Vùng gen mã hóa cho protein phi c ấu trúc của vector pHelper bị xóa b ỏ
phần lớn, chỉ giữ lại nguyên vẹn vùng gen mã hóa cho các protein cấu trúc (sPs)
tham gia vào vi ệc đóng gói virut. pHelper có các promoter CMV/T7, prom oter
subgenomic, đuôi polyadenyl đảm bảo cho quá trình phiên mã các genấuc trúc
invivo có th ể diễn ra.

Hình 5. Cấu trúc vector pHelper

15


Luận văn tốt nghiệp-2012

Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truy ền học

Sự đồng biến nạp các ARN ừt vector pSFV và vector helper theo t ỉ lệ
mol 1:1 vào cùng m ột dòng t ế bào t ạo ra sự đóng gói invivo c ủa ARN tái ổt
hợp hình thành nên các ạht virut SFV (Hình 6).

Hình 6. Mô hình ho ạt động của hệ vector SFV

Nhìn chung, hệ SFV cơ bản được thiết kế có nh ững ưu điểm sau:
-

2 plasmit riêng biệt của virut đều biến nạp nhanh và đơn giản, thu hoạch
virut trưởng thành sau 1-2 ngày, không yêu c ầu tái ổt hợp.

-

Dải vật chủ lây nhi ễm rộng, cho phép chọn được các dạng biến đổi
sau dịch mã phù h ợp.

16