(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin p tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Phạm Thùy Linh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP
NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------------------Phạm Thùy Linh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP
NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

Chuyên ngành

: Vi sinh vật học

Mã số

: 62 42 40 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1.

PGS.TS Trương Nam Hải

2.

GS. TS Phạm Văn Ty

Hà Nội – 2011


MỞ ĐẦU
Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực
phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Trong 7 tháng đầu năm
2008, đã xảy ra 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 ngƣời mắc và 43 ngƣời đã tử
vong.
Có nhiều nguyên nhân dẫn tới ngộ độc thực phẩm trong đó nguyên nhân do
nhiễm vi sinh vật và các độc tố của chúng chiếm hơn 80%, chủ yếu là do các chủng
thuộc loài vi khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Clostridium
botulinum, C. perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Vibrio
parahaemolyticus, Bacillus cereus, Toxoplasma gondii và Escherichia coli
O157:H7 [53]. Các vi khuẩn này phát triển ngay cả ở nhiệt độ thấp (4-6o C), trong
thịt ƣớp lạnh, thịt nguội, phô mai chƣa tiệt trùng... gây ra những rối loạn tiêu hóa,
mất cân bằng điện giải, kiệt sức. Trƣờng hợp nặng có thể dẫn đến tử vong nếu
không chữa trị đúng cách và kịp thời. Trong những năm gần đây, tình trạng ngộ độc
thực phẩm có liên quan đến L. monocytogenes đã bùng phát tại nhiều nƣớc trên thế
giới. Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, Listeria đã đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới

(World Health Organization – WHO) xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ
cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm. Listeria phân tán rộng rãi trong môi
trƣờng đất, nƣớc, phân gia súc nên rất dễ lây nhiễm qua thực phẩm. Tác hại của loại
vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc thực phẩm mà chúng còn
gây ra các bệnh lý nguy hiểm đặc biệt cho thai phụ nhƣ gây nhiễm trùng phôi thai,
sẩy thai, viêm não, nhiễm trùng máu... [99].
Một nguyên nhân khác gây ngộ độc thực phẩm là do chính những chất phụ
gia bảo quản hoặc chất tạo màu, tạo mùi trong quá trình xử lý, chế biến. Thực phẩm
hiện nay đƣợc bảo quản chủ yếu dựa vào các phụ gia tổng hợp hóa học hoặc qua các
chu trình xử lý nhiệt độ, áp suất... Điều này khiến ngƣời tiêu dùng lo ngại về những
tác động lâu dài có hại đến sức khỏe cũng nhƣ đặt ra yêu cầu ngày càng tăng về độ
“tự nhiên”, giảm tối đa quy trình xử lý của thực phẩm. Bởi vậy, song song với vấn

1


đề vệ sinh an toàn thực phẩm, nhu cầu về phƣơng pháp bảo quản thực phẩm cũng
nhƣ các chất bảo quản thực phẩm mới, các chất diệt khuẩn an toàn có nguồn gốc
sinh học, khơng độc hại đối với sức khỏe con ngƣời đang là một nhu cầu cấp thiết ở
hầu khắp các nƣớc trên thế giới.
Bacteriocin là nhóm các chất hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà
khoa học trên Thế giới nhằm đƣa vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Đây
là các peptide hoặc protein do vi khuẩn sinh ra, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt
nhiều loại vi sinh vật gây bệnh và gây hƣ hỏng thực phẩm dù ở nồng độ rất thấp
nhƣng lại an toàn đối với ngƣời sử dụng do dễ bị bất hoạt và phân hủy dƣới tác
động của các protease trong hệ tiêu hóa. Trong số đó, enterocin P (EntP) đƣợc sinh
tổng hợp từ chủng Enterococcus faecium P13, có phổ kháng khuẩn tƣơng đối rộng
đối với các vi khuẩn Gram dƣơng gây bệnh thƣờng đƣợc phát hiện trong thực phẩm
nhƣ C. perfringens, C. botulinum, S. aureus... và đặc biệt là L. monocytogenes.
EntP khá bền nhiệt, có thể đảm bảo hoạt tính sau khi xử lý ở 100 o C trong 60 phút

hoặc ở 121o C trong 15 phút. Hoạt tính này ổn định trong một thời gian dài khi đƣợc
bảo quản ở - 20o C hoặc 4o C [21]. EntP cịn có khả năng hoạt động trong khoảng
pH rộng, từ 2 đến 11. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn Enterococcus có khả năng sản
sinh enterocin lại thƣờng sinh ra các độc tố nên việc lên men, thu hồi enterocin ở
dạng sạch, đủ tiêu chuẩn sử dụng trong thực phẩm gặp nhiều khó khăn. Với mục
tiêu tổng hợp EntP theo con đƣờng tái tổ hợp nhằm chủ động điều khiển sinh tổng
hợp enterocin hiệu suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh sạch sản
phẩm, ứng dụng vào bảo quản thực phẩm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo
quản thực phẩm”.
Cơng trình đƣợc thực hiện tại phịng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và đƣợc hỗ trợ kinh phí thực hiện
từ đề tài cấp nhà nƣớc do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ quản
“Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nisin và
enterocin) dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm”.

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN

1.1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BACTERIOCIN
Trong quá trình đấu tranh sinh tồn, vi sinh vật thƣờng tiết ra những chất có
khả năng kìm hãm, ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật khác có sự cạnh tranh với
chúng về nơi sống và nguồn dinh dƣỡng nhƣ các axit hữu cơ, diacetyl, acetoin,
peroxide hidro, reuterin, reutericyclin, các peptide kháng nấm... [36, 54, 55, 72],

trong số đó phổ biến nhất là bacteriocin.
Bacteriocin là peptide hoặc protein do vi khuẩn tổng hợp, có hoạt tính kháng
khuẩn [25, 34, 43]. Bacteriocin đầu tiên đƣợc Gratia phát hiện vào năm 1925 với
tên gọi là principe V do một chủng E. coli sinh ra. Năm 1946, Gratia và Fredericq
đã đổi tên bacteriocin này thành “colicin”. Thuật ngữ bacteriocin đƣợc Jacob và
cộng sự đề xuất từ năm 1953 [17, 86, 87]. Tƣơng tự “ase” sử dụng trong enzyme,
tiếp tố “in” hoặc “cin” dùng để biểu thị các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn. Tiếp
tố này đƣợc viết thêm vào tên chi hoặc tên lồi. Ví dụ, bacteriocin tiết ra từ E. coli
đƣợc gọi là colicin, từ Bacillus subtilis đƣợc gọi là subtilin... Các chữ cái đứng sau
tên bacteriocin chỉ thứ tự bacteriocin đƣợc tìm ra ở cùng một lồi. Ví dụ, lactacin F
là bacteriocin thứ 6 đƣợc tìm ra từ loài thuộc chi Lactobacillus [53].
Bacteriocin đƣợc phát hiện ở hầu hết các loài vi khuẩn, đặc biệt một số lồi
có khả năng tiết hàng chục bacteriocin khác nhau [86]. Vi khuẩn cổ (Archaea) cũng
có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn giống bacteriocin gọi là archaeocin, điển
hình là họ halocin sinh ra bởi vi khuẩn cổ thuộc chi Halobacterium [87, 92]. Cho tới
nay đã có hàng trăm bacteriocin đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Chúng rất đa dạng
về chủng sản sinh, kích thƣớc phân tử, tính chất vật lý hóa học, độ bền, phổ kháng
khuẩn và cơ chế tác động [31]. Tập hợp gen cấu trúc và gen điều hòa sinh tổng hợp
bacteriocin ở vi khuẩn cũng rất đa dạng, có thể nằm trong hệ gen (plantaracin A và
sackacin 674), trong plasmid (pediocin) [91], hoặc thậm chí nằm trong các

3


transposon nhƣ nisin đƣợc sinh ra từ L. lactis [83]. Mặc dù vậy, cho tới nay, trong
số hàng trăm bacteriocin đƣợc phát hiện và nghiên cứu, mới chỉ có nisin là
bacteriocin duy nhất đƣợc Tổ chức Nông lƣơng (Food and Agriculture Organization
– FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) công nhận là chất
bảo quản thực phẩm từ năm 1969 và đƣợc sử dụng rộng rãi tại hơn 50 quốc gia trên
Thế giới [17].

Cùng có hoạt tính kháng khuẩn tuy nhiên bacteriocin hoàn toàn khác biệt với
chất kháng sinh dùng trong y học. Đa phần các bacteriocin có phổ kháng khuẩn
khơng rộng, chủ yếu ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác có mối quan hệ gần gũi
hoặc tƣơng đồng, có sự cạnh tranh trực tiếp về nơi sống và nguồn dinh dƣỡng [67].
So sánh bacteriocin và các kháng sinh dùng trong y tế [25]
Đặc tính

Bacteriocin

Kháng sinh

Mục đích ứng dụng
Tổng hợp
Hoạt tính
Cơ thế tác động tế bào
đích
Yêu cầu tƣơng tác

Thực phẩm
Từ ribosom
Phổ hẹp
Ảnh hƣởng tới kết cấu màng tế
bào
Đôi khi cần cắt ngắn phân tử

Y tế
Sản phẩm trao đổi chất bậc 2
Phổ đa da ̣ng
Tùy thuộc phƣơng thức hoạt
động

Đích đặc hiệu

Phƣơng thức hoạt động

Hầu hết là tạo lỗ trên màng tế
bào chất (một số ít có thể ảnh
hƣởng đến sinh tổng hợp thành
tế bào)
Chƣa thấy

Màng tế bào hoặc các đích nội
bào

Độc tính/tác dụng phụ

Có

Trong bối cảnh vi sinh vật kháng thuốc hiện nay, song song với việc phát
triển các kháng sinh phổ rộng dùng trong y tế thì việc nghiên cứu những bacteriocin
đặc hiệu với nhóm vi khuẩn nhằm đƣa vào ứng dụng cũng đang là một vấn đề đƣợc
quan tâm đặc biệt trong lĩnh vực cơng nghệ thực phẩm và các sản phẩm chăm sóc
sức khỏe.
1.1.2. PHÂN LOẠI BACTERIOCIN
Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn đa dạng và phong phú, đƣợc tiết ra bởi

4


nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, đƣơ ̣c chia thành hai nhóm lớn là bacteriocin của vi
khuẩn Gram âm và bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng. Vi khuẩn gram dƣơng có

q trình điều hịa sinh tổng hợp bacteriocin đặc hiệu, trong khi các bacteriocin từ vi
khuẩn Gram âm đƣợc tổng hợp chỉ phụ thuộc vào hệ thống điều hịa thơng thƣờng
của tế bào chủ trong những điều kiện bất lợi. Q trình tiết bacteriocin ở vi khuẩn
Gram dƣơng khơng giết chết bản thân vi khuẩn chủ, trong khi đó bacteriocin của vi
khuẩn Gram âm thƣờng đƣợc giải phóng thơng qua quá trình tiêu bào [85].
1.1.2.1. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm
Vi khuẩn Gram âm sản sinh một loạt các bacteriocin rất đa dạng về kích
thƣớc và phƣơng thức hoạt động, đƣợc đặt tên theo chi (nhƣ klebicin của Klebsiella
pneumoniae) hay theo loài của vi khuẩn sản xuất (nhƣ colicin của E. coli, marcescin
của Serratia marcescens, alveicin của Hafnia alvei, cloacin của Enterobacter
cloacae...). Tính riêng ở E. coli, các nhà khoa học đã phát hiện đƣợc hơn 30 loại
bacteriocin. Tuy nhiên, đến nay các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp
bacteriocin và sự đa dạng của chúng vẫn chƣa đƣợc hồn tồn sáng tỏ. Việc nghiên
cứu những thơng tin này là rất cần thiết, không chỉ giúp phân loại các quần thể vi
khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên mà cịn tìm ra các bacteriocin có đặc tính mới cho
nghiên cứu [87].
Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm đƣợc phân thành ba nhóm dựa vào kích
thƣớc: Nhóm 1: bacteriocin dạng colicin (colicin-like bacteriocin - CLB) kích thƣớc
lớn (25-80 kDa), nhóm 2: các microcin kích thƣớc nhỏ hơn (<10 kDa) và nhóm 3:
bacteriocin dạng đi phage (phage tail-like bacteriocin) gồm các tiểu đơn vị peptit
lắp ghép.
Colicin cũng nhƣ các CLB đƣợc sinh ra từ các vi khuẩn thuộc họ
Enterobacteriaceae, có phổ kháng khuẩn hẹp, đặc hiệu với các vi khuẩn Gram âm.
Colicin là các bacteriocin đầu tiên đƣợc phát hiện và mơ tả đặc tính. Chúng có kích
thƣớc lớn (25-80 kDa), hoạt động thông qua tƣơng tác với thụ thể đặc hiệu trên
màng tế bào của vi khuẩn đích, ngăn chặn tổng hợp thành tế bào, tăng tính thấm của
màng tế bào đích và hình thành lỗ trên màng tế bào (các bacteriocin có kích thƣớc

5

449 đến 629 amino axit) hoặc thể hiện hoạt tính nuclease đối với DNA, rRNA hoặc
tRNA đích (các bacteriocin có kích thƣớc 178 đến 777 amino axit) [68, 87]. Yếu tố
di truyền của colicin là các cụm gen phân bố trên plasmid và đƣợc sắp xếp thành
gen colicin mã hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mã hóa cho protein chịu
trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản xuất (bằng cách gắn và làm bất hoạt
protein độc), và gen phân giải mã hóa cho protein tham gia vào việc giải phóng
colicin thơng qua phân giải tế bào chủ [26]. Quá trình sinh tổng hợp của một số
bacteriocin thuộc nhóm này đƣợc điều khiển bởi cơ chế gây chết cho chính tế bào
chủ [87].
Microcin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ bacteriocin lớp II của vi khuẩn Gram
dƣơng: Đó là các peptide có kích thƣớc nhỏ (<10 kDa), đƣợc tổng hợp nhiều nhất
khi tế bào ở pha cân bằng. Hai đại diện thuộc nhóm này là colicin V (đƣợc coi là
một microcin vì có kích thƣớc phân tử là 6 kDa) và microcin C7 (peptide kháng
khuẩn có kích thƣớc nhỏ nhất, 1,177 kDa, đã đƣợc mô tả cho đến nay) [87].
Bacteriocin dạng đi phage là các hạt hình que đề kháng với nuclease và
protease tƣơng tự nhƣ đuôi của thể thực khuẩn (bacteriophage), tiêu diệt tế bào vi
khuẩn nhạy cảm thông qua tác động lên màng tế bào. Các bacteriocin này đƣợc cho
là những phage khiếm khuyết hoặc có nguồn gốc từ phage tiến hóa theo hƣớng tạo
nên bacteriocin. Điển hình nhƣ pyocin R2 (do Pseudomonas spp sinh ra) có thể là
phần cịn lại của phage P2, cịn pyocin F2 thì tƣơng đồng với phage lambda [85,
87].
1.1.2.2. Bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng
Các bacteriocin do vi khuẩn Gram dƣơng tiết ra phong phú và đa dạng hơn
nhiều so với vi khuẩn Gram âm. Theo Klaenhammer, bacteriocin của vi khuẩn
Gram dƣơng có thể đƣợc chia thành bốn nhóm dựa trên các đặc điểm về di truyền
và sinh hóa nhƣ sau [67]:

6

Bảng 1.1. Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng
Lớp
Lớp I

Đặc điểm
Các lantibiotic (chứa
lanthionine và -

Phân lớp
Ia (phân tử mạch thẳng, kích
thƣớc phân tử < 4 kDa)

lanthionine)
Ib (phân tử hình cầu, kích thƣớc
phân tử từ 1,8 – 2,1 kDa)

Lớp II

Các bacteriocin bền
nhiệt, khơng bị biến đổi
sau dịch mã, kích thƣớc
phân tử < 10 kDa

IIa (bacteriocin dạng pediocin,
có khả năng kháng Listeria)
IIb (bacteriocin gồm 2 peptide)
IIc (các bacteriocin còn lại của
lớp II)

Đại diện
Nisin A
Nisin Z
Subtilin
Epidermin
Mersacidin
Actagardin
Mutacin II
Bảng 2
Plantaricin EF
Plantaricin JK
Lactococcin 972

Lớp III

Các bacteriocin có kích
thƣớc phân tử > 30 kDa

Helveticin J
Millericin B

Lớp IV

Các bacteriocin có bản
chất là glycoprotein hoặc
lipoprotein

Lactocin 27
Lacstrepcin

Lớp I: Lantibiotic
Lớp này gồm các peptide có kích thƣớc nhỏ (< 5 kDa), có thành phần amino
acid bị cải biến mạnh sau khi dịch mã. Điểm khác biệt cơ bản của lantibiotic với các
lớp bacteriocin khác là có chứa các amino acid hiếm nhƣ lanthionine (Lan), methyllanthionine (MeLan), dehydroalanine và dehydrobutyrine [73]. Dựa vào đặc
điểm về cấu trúc, điện tích và cơ chế kháng khuẩn, lớp I còn đƣợc chia nhỏ thành
hai phân lớp [45, 75]:
- Phân lớp Ia: Gồm các lantibiotic có cấu trúc thẳng, tích điện (+). Chúng tác động
đến các vi khuẩn đích bằng cách hình thành nên các lỗ trên màng tế bào chất thông
qua sự tƣơng tác không đặc hiệu với màng. Một số đại diện cho phân lớp này là
nisin A và Z, subtilin, epidermin.
- Phân lớp Ib: Trái với phân lớp Ia, phân lớp Ib gồm các lantibiotic nhỏ, hình cầu,
tích điện (-) hoặc khơng tích điện nhƣ mersacidin, actagardin, cinnamycin và
7


mutacin A. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng dựa trên sự ức chế hoạt động của các
enzyme đặc hiệu, từ đó ức chế q trình sinh tổng hợp ở thành tế bào vi khuẩn.
Bateriocin nổi bật nhất trong nhóm I là nisin. Đƣợc sinh ra từ các chủng
Lactococcus lactis subsp. lactis phân lập từ sữa và các thực phẩm từ rau [50, 56] và
chủng L. lactis BB24 phân lập từ xúc xích lên men khơ Tây Ban Nha [21, 22], nisin
là bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng đối với một loạt các vi khuẩn Gram dƣơng
trong đó có S. aureus và L. monocytogenes. Thêm vào đó, nisin ngăn chặn sự phát
triển của bào tử Bacillus spp. và Clostridium spp. Cho tới nay, nisin là bacteriocin
đƣợc nghiên cứu tƣờng tận nhất và là bacteriocin duy nhất đƣợc tồn Thế giới cơng
nhận là chất bảo quản thực phẩm sinh học dùng cho pho – mát, các sản phẩm sữa và
đồ hộp [33].
Lớp II
Lớp II gồm các peptide bền nhiệt có kích thƣớc <10 kDa và khơng chứa
lanthionine (non-lantibiotic). Các peptide này có trình tự amino acid khơng bị cải
biến sau dịch mã. Phần lớn chúng tác động lên tế bào đích bằng cách tạo lỗ trên

màng sinh chất, gây thất thoát các nội chất của tế bào ra ngồi mơi trƣờng. Những
peptide này đƣợc chia thành ba phân lớp:
- Phân lớp IIa: gồm các bacteriocin có cấu trúc dạng pediocin (có một trình
tự bảo thủ –Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys– ở đầu N). Phân lớp IIa bao gồm các
peptide có hoạt tính kháng Listeria mạnh với kích thƣớc nhỏ (<10 kDa), gồm từ 3748 amino acid, bền nhiệt và các amino acid không bị cải biến sau dịch mã.
Bacteriocin thuộc phân lớp này có sự tƣơng đồng cao (40 - 60%) về cấu trúc và
trình tự các amino acid, tiêu diệt tế bào đích bằng cách tác động lên màng sinh chất.
Các peptide này tích điện (+) ở pH trung tính, điểm đẳng điện pI dao động trong
khoảng từ 8 đến 10 [34]. Hiện nay, đây đƣợc coi là nhóm chất kháng khuẩn sinh
học hứa hẹn nhất về khả năng ứng dụng trong công nghệ bảo quản thực phẩm và
trong y học. Chúng có thể ức chế sự sinh trƣởng của nhiều loại vi khuẩn Gram
dƣơng gây hƣ hỏng thực phẩm và các vi khuẩn gây bệnh nhƣ B. cereus, C.
perfringens, S. aureus, và L. monocytogenes [25, 34]. Một số bacteriocin đại diện

8


cho nhóm này nhƣ pediocin AcH/PA1, mesentericin Y 105, sakacin A, sackacin P,
carnobacteriocin B2... đƣợc tổng kết ở bảng 1.2 [37].
Bảng 1.2. Một số bacteriocin thuộc phân lớp IIa
Bacteriocin
Carnobacteriocin B2
Curvacin A
Divercin V41
Divergicin M35
Enterocin P
Enterocin A
Leucocin A
Leucocin C
Mundticin

Mesentericin Y105
Plantaricin 423
Pediocin PA-1
Pediocin AcH
Pediocin SJ-1
Piscicolin 126
Sakacin P
Sakacin A

Vi khuẩn sản xuất
Loài
Carnobacterium piscicola
Lactobacillus curvatus
Carnobacterium divergens
Carnobacterium divergens
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
Leuconostoc gelidum
Leuconostoc mesenteroides
Enterococcus mundtii
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Pediococcus acidilactici
Pediococcus acidilactici
Pediococcus acidilactici
Carnobacterium piscicola
Lactobacillus sakei
Lactobacillus sakei

Chủng

LV17
LTH1174
V41
M35
P13
CTCA92/T136
UAL 187
TA33a
ATO6
Y105
423
PAC 1.0
AcH
SJ-1
JG126
674
706

- Phân lớp IIb: là các bacteriocin đa thành phần, chủ yếu gồm hai chuỗi peptide.
Hoạt tính kháng khuẩn của chúng phụ thuộc vào hoạt động bổ trợ lẫn nhau của hai
chuỗi. Hầu hết các peptide riêng rẽ vẫn có hoạt tính kháng khuẩn, nhƣng hoạt tính
này mạnh hơn khi có mặt chuỗi peptide thứ hai (enterocin L50A và L50B) [9, 23].
Trƣờng hợp ngoại lệ là hai peptide lactococcin G và lactococcin M không cịn khả
năng kháng khuẩn khi đứng riêng lẻ một mình.
- Phân lớp IIc: là các bacteriocin còn lại của lớp II. Các bacteriocin thuộc nhóm này
gồm hai loại chính là có chứa cysteine (đại diện là thiolbiotic và cystibiotic) và
khơng có chứa cysteine (đại diện là lactococin A và acidocin B).
Lớp III
Lớp III gồm các bacteriocin có khối lƣợng phân tử lớn (>30 kDa), dễ bị phân
9

hủy dƣới tác động của nhiệt độ. Phần lớn các peptide nhóm này đƣợc tiết ra bởi các
chủng thuộc chi Lactobacillus. Điển hình nhƣ helveticin J do L. helveticus tiết ra
hay lactacin B do chủng L. acidophilus sinh ra. Các bacteriocin thuộc lớp này vẫn
chƣa đƣợc nghiên cứu rộng rãi [17, 80].
Lớp IV
Lớp IV bao gồm các bacteriocin có cấu tạo phức tạp, có bản chất là
glycoprotein (lactocin 27) [94] hoặc lipoprotein (lacstrepcin) [69]. Hoạt tính sinh
học của các bacteriocin này cần có sự tham gia của thành phần carbohydrate hoặc
lipid trong cấu trúc.
Gần đây, Kemperman đã bổ sung thêm một lớp bacteriocin mới (lớp V), gồm
các bacteriocin có cấu trúc dạng vòng. Đây là các peptide đƣợc biến đổi sau dịch
mã, hình thành liên kết cộng hóa trị nội phân tử giữa đầu N và đầu C tạo cấu trúc
vòng cho peptide trƣởng thành [66]. Các thành viên thuộc nhóm này là enterocin
AS-48 (tiết ra bởi E. faecalis), circularin A (tiết ra bởi C. beijerinckii ATCC25752),
gassericin A (tiết ra bởi L. gasseri LA39)...
1.1.3. PHỔ KHÁNG KHUẨN CỦA BACTERIOCIN
Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm đƣợc xem là những chất kháng khuẩn phổ
hẹp, chủ yếu tác động tới những vi khuẩn có quan hệ gần gũi trong cùng nơi sống,
gây chết tế bào đích bằng cách tạo lỗ trên màng sinh chất hoặc bằng phân cắt axit
nucleic (DNA, rRNA và tRNA) [86].
Bacteriocin từ vi khuẩn Gram dƣơng có phổ kháng khuẩn vô cùng đa dạng,
từ lactococcin A, B và M là các bacteriocin đƣợc sinh ra từ các chi Lactococcus và
Lactobacillus, chỉ có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn Lactococcus, cho tới nisin A,
có khả năng tiêu diệt một loạt các vi khuẩn bao gồm các chi: Actinomyces, Bacillus,
Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria,
Micrococcus, Mycobacterium, Propionibacterium, Streptococcus, và thậm chí cả
một số vi khuẩn Gram âm nhƣ: Campylobacter, Haemophilus, Helicobacter và
Neisseria [76, 86]. Klaenhammer đã chỉ ra rằng bacteriocin từ vi khuẩn lactic có

khả năng kháng khuẩn đa dạng, khơng chỉ đối với các lồi có quan hệ gần gũi hay

10


cạnh tranh về nơi sống [67]. Quan sát hoạt tính của các bacteriocin phân tử lƣợng
thấp các nhà nghiên cứu đã nhận thấy: (i) một số chủng trong cùng một lồi nhất
định có thể mẫn cảm trong khi các chủng khác lại đề kháng với cùng một loại
bacteriocin; (ii) một chủng mẫn cảm với một bacteriocin có thể có một vài tế bào
trong quần thể đề kháng đƣợc với bacteriocin đó; (iii) một chủng có thể mẫn cảm
với một bacteriocin trong khi lại đề kháng với một bacteriocin dạng tƣơng tự; (iv)
các tế bào của chúng sản sinh bacteriocin này có thể mẫn cảm với một bacteriocin
khác; (v) bào tử của chủng mẫn cảm với một bacteriocin có thể đề kháng với
bacteriocin đó và chỉ trở nên mẫn cảm khi nảy mầm, (iv) dƣới các điều kiện thông
thƣờng, vi khuẩn Gram âm không mẫn cảm với các bacteriocin từ vi khuẩn Gram
dƣơng, vi khuẩn Gram âm chỉ bị ức chế bởi các bacteriocin tinh chế từ vi khuẩn
lactic (lactic acid bacteria – LAB) dƣới những điều kiện làm suy yếu thành tế bào
(nhƣ các axit hữu cơ, EDTA...) hay dƣới áp lực môi trƣờng nhƣ pH, đông lạnh, gia
nhiệt nhẹ hay áp suất hơi nƣớc cao [59, 63, 64].
Nhiều tác giả cho rằng, hàm lƣợng cystein có liên quan tới phổ kháng khuẩn
của các LAB-bacteriocin bởi việc hình thành liên kết thiol giữa các gốc cysteine có
thể đóng vai trị sinh học tƣơng tự nhƣ sự hoạt hóa gốc thiol của độc tố sinh ra từ vi
khuẩn Gram âm. Bởi vậy, tác giả cho rằng các cystibiotics, thiolbiotics và
bacteriocin không chứa cysteine sẽ có hoạt tính kháng khuẩn tƣơng ứng là rộng,
trung bình và hẹp [59]. Mặc dù chƣa đƣợc xác định đầy đủ, nhiều nghiên cứu đã chỉ
ra rằng sự hình thành cầu disulfide trong các bacteriocin dạng pediocin PA1,
enterocin A, enterocin P và divercin V41 có thể là thiết yếu đối với khả năng kháng
khuẩn của các non - lantibiotic này [13, 19].
Dựa theo phổ kháng khuẩn, bacteriocin cũng có thể đƣợc chia thành 3 nhóm:
(i) nhóm bacteriocin phổ hẹp: chỉ kháng lại các chủng cùng loài với chủng sản xuất

(lactococcin A, caseicin 80) hoặc các loài trong cùng một chi (lactocin 27, lactacin
B); (ii) nhóm bacteriocin phổ trung bình: có khả năng ức chế các chi khác của vi
khuẩn lactis và vi khuẩn Gram dƣơng bao gồm cả các chủng gây ngộ độc thực
phẩm L. monocytogenes, S. aureus, C. perfringens, C. botulinum. Đại diện cho

11


nhóm này có lacticin F, lacticin 481, plantaricin C, plantaricins S và T; và nhóm
bacteriocin phổ rộng, có khả năng ức chế một dải rộng các vi khuẩn Gram dƣơng,
bên cạnh các chi đã đƣợc kể ở trên cịn có thêm Propionibacterium spp. và Bacillus
spp. Nisin, pediocin AcH/PA-1, leucocin S và enterocin L50 là các bacteriocin tiêu
biểu thuộc nhóm này [22, 24, 50, 56].
1.1.4. ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN
Đối với vi sinh vật, bacteriocin là vũ khí để cạnh tranh dinh dƣỡng và khơng
gian sống giữa các lồi, giúp cân bằng sinh thái vi sinh vật [91]. Đối với con ngƣời,
các peptide kháng khuẩn này cũng có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong bảo quản
thực phẩm, trong nông nghiệp, trong lĩnh vực y tế cũng nhƣ chăm sóc sức khỏe cho
con ngƣời [88].
1.1.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm
Thực phẩm hiện nay đƣợc bảo quản chủ yếu dựa vào các chất phụ gia tổng
hợp hóa học hoặc các chu trình xử lý nhiệt độ, áp suất... Điều này khiến ngƣời tiêu
dùng lo ngại về những ảnh hƣởng có hại đến sức khỏe cũng nhƣ đặt ra yêu cầu ngày
càng tăng về độ “tự nhiên” của thực phẩm. Vì vậy, một giải pháp có nhiều tiềm
năng hiện nay là sử dụng các chất kháng khuẩn sinh học để ức chế hay tiêu diệt các
vi sinh vật không mong muốn. Bacteriocin, đặc biệt là các bacteriocin từ vi khuẩn
lactic có nhiều đặc tính thích hợp để đƣợc ứng dụng làm chất bảo quản: đây là các
hợp chất an tồn, khơng hoạt động và không gây độc trên tế bào ngƣời, dễ dàng bị
bất hoạt bởi các protease trong hệ tiêu hóa, rất ít ảnh hƣởng tới hệ khuẩn chí đƣờng
ruột, bền nhiệt và ổn định trong các pH, có phổ kháng khuẩn khá rộng đối với nhóm

các vi khuẩn gây ngộ độc và hƣ hỏng thực phẩm. Phƣơng thức kháng khuẩn của
bacteriocin là hoạt động trên màng sinh chất của vi khuẩn. Bacteriocin khơng có
hiện tƣợng kháng chéo với các chất kháng sinh, các yếu tố di truyền đƣợc quy định
trên plasmid, thuận lợi cho việc thao tác di truyền [43]. Các bacteriocin đã biết tới
ngày nay hầu hết đều đƣợc phát hiện trong những thực phẩm nhƣ thịt và các sản
phẩm sữa, nơi thƣờng có mặt vi khuẩn lactic. Trên thực tế, vi khuẩn lactic đã đƣợc
con ngƣời sử dụng từ xa xƣa để chế biến và bảo quản thịt, sữa, các loại rau củ.

12


Nghiên cứu 40 chủng L. lactis dạng dại, các tác giả đã phát hiện 35 chủng trong số
đó có sản sinh bacteriocin [25].
Sử dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm có thể mang lại nhiều lợi ích:
tăng thời hạn sử dụng của thực phẩm, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức
ăn, giảm thiệt hại kinh tế do hƣ hỏng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa
học cũng nhƣ giảm bớt nhiệt độ và áp suất trong quá trình xử lý, vì vậy bảo đảm
đƣợc giá trị dinh dƣỡng nhất là hàm lƣợng vitamin, hƣơng vị và màu sắc tự nhiên
của thực phẩm [43].
Thịt lên men đã đƣợc dùng phổ biến từ xa xƣa ở khắp thế giới, trong đó có
các loại xúc xích lên men bán khô (semidry sausage) với những nhãn hiệu nổi tiếng
nhƣ Chorio, Summer... và lên men khô nhƣ Peperoni, Salami. Để sản xuất, ngƣời ta
thƣờng dùng các vi khuẩn lactic nhƣ L. plantarum, L. pentosus, L. sake, L. curvatus,
L. pentosaceus, L. acidilactic... với chức năng axit hóa, chống oxi hóa, đặc biệt là
sinh tổng hợp bacteriocin để tránh nhiễm trùng, đảm bảo đƣợc chất lƣợng và vệ sinh
an toàn thực phẩm, nhiều lồi cịn tạo hƣơng thơm đặc trƣng.
Bacteriocin đƣợc sử dụng rất phổ biến trong cơng nghệ đóng hộp hoa quả.
Khi khử trùng các hộp hoa quả, nếu tăng nhiệt độ lên cao sẽ làm nhũn cũng nhƣ mất
đi màu sắc và hƣơng vị tự nhiên của hoa quả, nhƣng nếu thêm một lƣợng nhất định
bacteriocin thì có thể làm giảm nhiệt độ khử trùng mà vẫn giữ đƣợc chất lƣợng sản

phẩm.
Có ba phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng trong việc bảo quản thực phẩm
bằng bacteriocin [17]:
-

Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thƣờng là vi khuẩn lactic) để tạo bacteriocin tại
chỗ (in situ). Trong trƣờng hợp này, khả năng sinh trƣởng và tạo bacteriocin của
LAB trong sản phẩm là yếu tố quyết định.

-

Bổ sung bacteriocin tinh chế hoặc bán tinh chế vào thực phẩm nhƣ một chất bảo
quản.

-

Sử dụng thành phẩm của q trình lên men trƣớc đó với chủng sinh bacteriocin
nhƣ là một thành phần trong qui trình chế biến thực phẩm.

13


Sử dụng chủng sinh bacteriocin làm giống khởi động
Thông thƣờng giống khởi động (Starter cultures) là hỗn hợp các loài vi sinh
vật có vai trị tạo màu, tạo mùi thơm, hƣơng vị đặc trƣng, làm giảm độ pH, ngăn cản
sự phát triển của vi khuẩn có hại trong thực phẩm. Khi đƣợc sử dụng nhƣ một
chủng trong giống khởi động, chủng sinh bacteriocin phải tạo đƣợc lƣợng
bacteriocin đủ lớn để chống lại các vi khuẩn khác mà không làm ảnh hƣởng đến
chức năng của giống khởi động ban đầu. Do đó, giống khởi động phải kháng với
bacteriocin. Các giống khởi động nuôi cấy cùng bacteriocin thƣờng đƣợc sàng lọc

bằng cách nuôi cấy phụ lặp lại, với nồng độ bacteriocin tăng dần để chọn lọc các
giống thích nghi hay bằng biến đổi gen. Ví dụ, chủng Enterococcus sinh enterocin
AS-48 đƣợc sử dụng làm giống nuôi cấy kết hợp với một giống khởi động thƣơng
mại trong sản xuất phomat không làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của giống khởi
động hay đặc tính hóa sinh của phomat tạo ra đồng thời lƣợng bacteriocin đƣợc tạo
ra trong phomat đủ đảm bảo ức chế B. cereus [32, 53].
Sử dụng chủng sinh bacteriocin làm probiotic
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về probiotic tăng lên nhanh
chóng. Nhiều sản phẩm probiotic đã xuất hiện trên thị trƣờng dƣới dạng viên bọc,
bột, sữa chua làm giàu và nhiều loại thực phẩm khác. Thuật ngữ probiotic bắt nguồn
từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống, theo tiếng Việt là trợ sinh. Theo đó,
probiotic là “những vi sinh vật sống mà khi đƣa vào cơ thể một lƣợng đủ lớn sẽ tác
động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [40]. Vi sinh vật sử dụng cho các sản phẩm
probiotic là nấm men, vi khuẩn (đặc biệt là nhóm LAB). Ví dụ, L. acidophilus là
LAB lên men đồng hình đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật.
Chúng đƣợc bổ sung vào các sản phẩm sữa lên men thƣơng mại nhƣ sữa chua
acidophilus. Những vi khuẩn này có tác động tích cực đến sức khỏe con ngƣời nhờ
khả năng sinh bacteriocin – giúp ức chế hay tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh.
Probiotic từ LAB ngăn ngừa hiệu quả sự rối loạn hệ khuẩn chí đƣờng ruột và
thƣờng đƣợc sử dụng để điều trị tiêu chảy do các nguyên nhân khác nhau.
Bacteriocin giúp vi sinh vật có lợi cạnh tranh với vi sinh vật bản địa cũng nhƣ hệ vi

14


khuẩn đƣờng ruột gây bệnh nhƣ Helicobacter pylori, E. coli và Salmonella [44, 53].
1.1.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong y tế và chăm sóc sức khỏe
Sự gia tăng nhanh chóng và lan tràn của các vi sinh vật kháng đa thuốc trong
những năm gần đây đang đặt ra những yêu cầu về một giải pháp thay thế trong cuộc
chiến điều trị các bệnh nhiễm trùng. Một trong những hạn chế của việc sử dụng các

chất kháng sinh phổ rộng là tiêu diệt hầu hết các lồi vi khuẩn khơng kháng thuốc.
Vì vậy, bên cạnh hiện tƣợng kháng đa thuốc đang ngày càng lan rộng trong các
quần thể vi khuẩn gây bệnh còn là sự mất cân bằng của quần thể các vi sinh vật hội
sinh. Bacteriocin hứa hẹn là các chất diệt khuẩn thế hệ mới với nhiều ƣu điểm vƣợt
trội có thể giải quyết thế lƣỡng nan này. Với phổ kháng khuẩn hẹp, tính đặc hiệu tế
bào đích cao, bacteriocin đƣợc xem là các “dƣợc phẩm thiết kế” (designer drugs), là
giải pháp cho vấn đề kiểm soát các bệnh nhiễm trùng đang đặt ra nhiều thách thức
hiện nay [81, 86].
1.1.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nông nghiệp
Hàng năm trên thế giới các bệnh ở cây trồng đã gây thiệt hại từ 12-15% tổng
giá trị mùa màng. Phần lớn các bệnh này là do vi khuẩn có hại gây ra. Hệ vi khuẩn
sống trên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Nơi sống và phƣơng thức sống
của chúng cũng rất khác nhau. Chúng có thể ký sinh trên lá hoặc rễ, hay nhiễm vào
trong các mô của thực vật nhƣ các vi khuẩn kí sinh, cộng sinh hoặc vi khuẩn gây
bệnh. Trong quá trình sống, nhiều vi khuẩn đã tiết ra bacteriocin nhằm cạnh tranh
không gian sống và nguồn dinh dƣỡng, tuy nhiên mới chỉ có một số ít bacteriocin từ
những vi khuẩn này đƣợc nghiên cứu, mô tả đặc tính di truyền và hóa sinh. Dựa trên
cơ sở này, các nhà khoa học đã đề xuất một phƣơng pháp kiểm soát bệnh cây trồng
do vi khuẩn gây ra bằng cách sử dụng các chủng sinh bacteriocin hoặc sử dụng trực
tiếp các bacteriocin đã điều chế. Hiện nay, một số bacteriocin nhóm này đã đƣợc
sản xuất và bán trên thị trƣờng, điển hình là agrocin K48, một bacteriocin do
Agrobacterium radiobacter K48 sinh ra, có khả năng kháng Agrobacterium
tumifaciens gây bệnh mụn cây (crown gall disease) cho nhiều loại cây trồng [65].
Ngoài vi khuẩn gây bệnh, nấm cũng là một mối đe dọa lớn đối với cây trồng.

15


Magnusson (2003) đã nghiên cứu các vi khuẩn lactic (LAB) phân lập từ nhiều môi
trƣờng khác nhau và thấy rằng 10% các chủng vi khuẩn này sinh ra bacteriocin có

khả năng ức chế Aspergillus fumigatus và 4% tiết bacteriocin có hoạt tính kháng
loại mốc này rất mạnh [71]. Một ví dụ khác là syringomycin E và G do
Pseudomonas syringae 508 tiết ra có thể tiêu diệt bào tử của V. inaequalis [27].

1.2. ENTEROCIN P
1.2.1. CÁC Enterococcus: VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP ENTEROCIN
Enterococcus đƣợc mô tả lần đầu tiên năm 1899, là một chi lớn thuộc nhóm
LAB. Enterococcus gồm các cầu khuẩn Gram dƣơng, kỵ khí tùy tiện, thƣờng tồn tại
dƣới dạng cặp và chuỗi, lên men đồng hình tạo L(+)LA (axit lactic đồng phân hình
học dạng L). Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định đƣợc hơn 26 loài thuộc chi
Enterococcus, phân thành 8 nhóm lồi (species section) dựa trên quan hệ phát sinh
lồi, trong đó, E. faecalis và E. faecium là hai lồi chiếm ƣu thế [38]. Enterococcus
có nguồn gốc từ đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật máu nóng, phân bố rất rộng
rãi trong khơng khí, nƣớc, chất thải, đất... [71]. Đa số các chủng vi khuẩn thuộc
nhóm Enterococcus có khả năng sinh ra bacteriocin. Bacteriocin này đƣợc gọi là
các enterocin và hầu hết đều thuộc lớp II. Phần lớn các enterocin đƣợc tinh chế và
xác định đặc tính di truyền nhiều năm nay đều từ E. faecalis và E. faecium.
Enterococcus có ý nghĩa lớn trong vi sinh vật học môi trƣờng, thực phẩm và
y học. Chúng giữ vai trị quan trọng trong q trình chín, tạo kết cấu mùi vị thực
phẩm lên men nhƣ pho mat, xúc xích..., tăng cƣờng giá trị dinh dƣỡng thực phẩm
[71]. Một số chủng của Enterococcus, điển hình là E. faecium SF68 đã đƣợc nghiên
cứu và sử dụng nhƣ một probiotic ở ngƣời, đặc biệt là trong điều trị tiêu chảy [93].
Enterococcus có vai trị bảo quản quan trọng trong các thực phẩm chế biến từ thịt
nhờ khả năng tạo ra một loạt các enterocin khác nhau, một số chủng thậm chí có
khả năng sinh ra nhiều loại enterocin. Trong số đó, đáng chú ý là các enterocin có
hoạt tính kháng Listeria spp. – nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm
và các bệnh lý nguy hiểm ở ngƣời trong thời gian gần đây. Hoạt tính kháng Listeria

16

có thể đƣợc giải thích bởi thực tế Enterococci và Listeria có quan hệ gần gũi về mặt
phát sinh. Một ƣu điểm nữa là enterocin có khả năng chịu nhiệt và khoảng pH dao
động rộng. Do vậy, tiềm năng ứng dụng của các enterocin từ Enterococcus là rất lớn
[53].
Tuy nhiên, một số chủng của Enterococcus sinh độc tố và không có khả năng
tổng hợp mạnh enterocin. Thâ ̣m chí , một số lồi phân lập từ thức ăn có thể chứa các
yếu tố gây độc, trong đó E. faecalis chứa nhiều rủi ro tiềm ẩn. Một vấn đề đáng chú
ý nữa là tính kháng kháng sinh của một số chủng, đặc biệt là các chủng kháng
vancomycin gây khó khăn trong điều trị bệnh nhiễm trùng [53, 87]. Do vậy việc sử
dụng Enterococcus nhƣ là các probiotic cần đƣợc nghiên cứu và kiểm tra kỹ lƣỡng.
Đồng thời, việc tạo enterocin tái tổ hợp ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và y tế
đƣợc xem là giải pháp tối ƣu.
1.2.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ENTEROCIN P
Enterocin P (EntP) là một bacteriocin dạng pediocin, thuộc lớp IIa, do chủng
E. faecium P13 (phân lập lần đầu tiên từ xúc xích lên men khơ Tây Ban Nha) sinh
ra. EntP có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế mạnh các vi khuẩn gây gây
thối hỏng và ngộ độc thực phẩm nhƣ S. aureus, C. perfringens, C. botulinum... và
đặc biệt là L. monocytogenes.
Dựa vào cấu trúc gen, EntP thuộc nhóm IIa [20]. Mặt khác, peptide này cũng
đƣợc một số tác giả xếp vào phân lớp IIc do nó đƣợc tiết ra ngoại bào theo cơ chế
của bacterocin phân lớp IIc. Do vậy mà ở một số bài báo, tùy theo quan điểm phân
loại của từng tác giả mà EntP thuộc phân lớp IIa hay IIc.
Phân tử EntP ban đầu đƣợc tổng hợp tại ribosome gồm 71 amino acid, trong
đó 27 amino acid đầu tiên là peptit tín hiệu dẫn có vai trị đƣa peptide ra ngồi mơi
trƣờng. Sau khi đƣợc tiết ra ngồi, đoạn peptide này bị cắt bỏ để tạo EntP dạng hoạt
động gồm 44 amino acid, có khối lƣợng phân tử 4493 Da.

17

Bảng 1.3. Hoạt tính kháng khuẩn của enterocin P tinh sạch từ dịch ni chủng
E. faecium P13 [21]
Lồi / Chủng

MIC
(ng/ml)

Lồi / Chủng

MIC
(ng/ml)

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356

-

E. faecalis TNO EF

238

L. bulgaricus ATCC 11842

-

S. carnosus TNO MC1

139

L. casei ATCC 334

-

Listeria innocua TNO BL86/26

395
286

L. curvatus NCFB 2739

17

B. cereus ATCC 9139

L. fermentum ATCC 9338

1

Clostridium sporogenes TNO C22/10

L. helveticus ATCC 15009

-

C. tyrobutyricum TNO 3,5CT

L. plantarum CNDO 1193

-

NCDO 1754

412

L. reuteri DSM 20016

-

Propionibacterium sp. TNO P4

37

NO P6

144

L. sake NCB 2714

4
559

26

ASC 148

-

C. perfringens CECT 376

4

L. salivarius NCFB2747

-

C. botulinum CECT 551

259

L. monocytogenes NCTC 7973

35

Pediococcus acidilactici ASCL50
ASC 347

69
-

FVM LI5sv1/2

33

P. pentosaceus TNO FBB61

136

NCTC5105

18

TNO FBB63

18

FVM LI1sv4

39

-

FVM Scott A

125

TNO PC1
Leuconostoc cremoris TNO DB1275

-

L. cremoris INRA CNRZ117

-

FRI 196E

407

L. lactis INRA CNRZ148

-

FRI 349

221

L. lactis INRA CNRZ150

-

FRI 361

294

22

FRI 472

269

L. lactis ASC

BB24

Enterococcus faecium ASC T136

Staphylococcus aureus FRI137

190

2

EntP khá bền nhiệt, hoạt tính kháng khuẩn của EntP có thể duy trì ở 100o C
trong 60 phút hoặc ở 121o C trong 15 phút. Hoạt tính này ổn định trong một thời
gian dài khi đƣợc bảo quản ở - 20o C hoặc 4o C. EntP cịn có khả năng hoạt động
18


trong khoảng pH rộng, từ 2 đến 11. Trong dịch tiêu hóa của ngƣời và động vật,
cũng nhƣ những bacteriocin khác, EntP rất dễ bị phân hủy bởi các protease. EntP là
bacteriocin dạng pediocin phụ thuộc tiết (sec-dependent pediocin-like bacteriocin)
đầu tiên đƣợc xác định tới cấp độ hóa sinh phân tử [21].

1.2.3. CẤU TRƯC KHƠNG GIAN CỦA ENTEROCIN P
Cấu trúc không gian của enterocin P cũng nhƣ các bacteriocin lớp IIa đƣợc
xác định bằng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR [40, 50]. Qua đó,
ngƣời ta nhận thấy rằng trong môi trƣờng nƣớc bacteriocin không mang cấu trúc
đặc thù trong khi ở môi trƣờng gần giống màng tế bào (membrane-mimicking
environment) với sự có mặt của micelle và liposome thì chúng lại có cấu trúc rõ
ràng [34]. Cấu trúc này chia thành hai vùng: Vùng đầu N và vùng đầu C (Hình 1.1).

Vùng N với cấu
trúc gấp nếp 

Vùng ngoài ƣa nƣớc

Bề mặt màng
Khớp nối
Vùng C với cấu
trúc kẹp tóc

Vùng kị nƣớc
của màng

Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian của bacteriocin phân lớp IIa

Vùng đầu N tích điện (+) chứa nhóm YGNGV bảo thủ cao. Vùng này chứa
hai gốc cystein tham gia vào việc hình thành nên cầu nối disulfide. Ngƣợc lại, vùng
C của bacteriocin có tính bảo thủ kém hơn. Trong mơi trƣờng có mặt micelle và
liposome, vùng N tạo nên cấu trúc phiến gấp nếp . Trong khi đó ở đầu C lại hình
19


thành một hoặc hai cấu trúc xoắn , theo sau là đi C với chiều dài có thể thay đổi
[34]. Ở hầu hết các bacteriocin lớp IIa, đuôi C này sẽ gập vào vùng C trƣớc nó, hình
thành nên cấu trúc kẹp tóc. Vùng C và vùng N đƣợc nối với nhau bởi một khớp nối
[60]. Khớp nối này làm cho cấu trúc của bacteriocin không những trở nên linh động
hơn mà còn giúp cho vùng C đi vào phần kị nƣớc của tế bào dễ dàng hơn [34, 60].
Mối tƣơng quan giữa cấu trúc và cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin cho
đến nay vẫn chƣa đƣợc hiểu biết tƣờng tận. Ở đầu N, các amino acid tích điện (+)
tham gia vào việc hình thành nên mối tƣơng tác tĩnh điện với phần tích điện (-) ở
trên màng. Vùng C có vai trị quan trọng quyết định tính đặc hiệu với tế bào đích
[34]. Để biết đƣợc điều này, ngƣời ta đã tiến hành thí nghiệm với các bacteriocin lai
đƣợc tạo ra bằng cách thay thế đầu C và đầu N của các bacteriocin khác nhau. Kết
quả là bacteriocin lai thể hiện tính đặc hiệu với tế bào đích tƣơng tự nhƣ các
bacteriocin có vùng C tƣơng ứng [42].
1.2.4. CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG
Bằng cách gắn chất huỳnh quang trên tryptophan của các bacteriocin phân
lớp IIa nhƣ pediocin PA-1 và mesentericin Y105 khi có mặt liposome, các tác giả
đã chỉ ra rằng: ít nhất vùng có chứa tryptophan ở đầu C của bacteriocin lọt qua

màng. Tuy nhiên phạm vi lọt đƣợc qua màng phụ thuộc vào điện tích của liposome
sử dụng trong thí nghiệm và vị trí của gốc tryptophan trong chuỗi peptide [19]. Với
nghiên cứu trên, một giả thiết đƣợc đƣa ra rằng bacteriocin lớp này đã gây ra tính
thấm trên màng tế bào bằng cách hình thành nên các lỗ chọn lọc ion làm tiêu hao
động lực proton và năng lƣợng ATP nội bào.
Trong nghiên cứu với leucocin A, Yan và cộng sự [97] cho rằng bacteriocin
thấm qua màng bằng cách tƣơng tác với thụ thể gắn trên màng. Các thụ thể này có
thể là các enzyme permease vận chuyển mannose (mannose permease) [19, 34, 80,
52]. Dƣới đây là sơ đồ giả định về cơ chế tác động hai bƣớc của bacteriocin lớp IIa
lên tế bào đích:

20


Bacteriocin lớp IIa

1. Bacteriocin tƣơng tác với
protein thụ thể trên màng

2. Thấm qua màng

Hình 1.2. Cơ chế tác động hai bƣớc của bacteriocin phân lớp IIa
AB, C, D: Các protein IIAB, IIC, IID trong hệ thống vận chuyển đƣờng mannose ở vi
khuẩn (mannose phosphotransferase system - man-PTS).

Bƣớc 1: Bacteriocin gắn vào các thụ thể trên màng. Các thụ thể này có thể là các
protein trong hệ thống vận chuyển đƣờng mannose ở vi khuẩn (man - PTS).
Bƣớc 2: Sau khi nhận ra đƣợc tế bào đích, bacteriocin gắn lên màng nhờ tƣơng
tác tĩnh điện giữa vùng tích điện (+) của nó và phần tích điện (-) trên màng tế bào.
Vùng kị nƣớc (đầu C) trên bacteriocin đi vào vùng kị nƣớc trong màng tế bào, từ đó

lỗ trên màng tế bào đích đƣợc hình thành và gây chết tế bào do sự rị rỉ thất thốt
các chất tan có trong tế bào [80].
Sử dụng các mẫu dò huỳnh quang để xác định điện thế màng, năng lƣợng
ATP nội bào và gradien pH trên màng tế bào vi khuẩn đích E. faecium T136 khi có
mặt EntP, Herranz và cộng sự đã chỉ ra rằng: với bản chất là một peptide phân cực,
tích điện dƣơng, EntP có thể đã tƣơng tác với màng sinh chất tích điện âm của vi
khuẩn nhạy cảm, phá vỡ điện thế màng, làm giảm grandien pH, qua đó làm tiêu hao
động lực proton, ATP nội bào, hình thành lỗ trên màng làm thất thoát nội chất và
gây chết tế bào [52]. Nghiên cứu của Herranz còn chỉ ra rằng: hoạt tính của EntP có
thể khơng hồn tồn phụ thuộc mối tƣơng tác giữa EntP và thụ thể protein trên
màng sinh chất của vi khuẩn đích mà chính các thành phần có bản chất protein trên
màng sinh chất hay trên bề mặt tế bào hoặc thậm chí tồn bộ cấu tạo màng có thể là

21


nhân tố làm tăng hoạt tính của EntP, khiến bacteriocin này có phổ kháng khuẩn
rộng nhƣ vậy.
Vùng tích điện (+)

Vùng kị nƣớc

Bacteriocin

Màng tế bào

Lỗ màng
Tế bào chất
Hình 1.3. Cơ chế tác động của bacteriocin phân lớp IIa trên màng tế bào [80]

1.2.5. CƠ CHẾ TỰ BẢO VỆ CỦA TẾ BÀO CHỦ
Q trình sinh tổng hợp bacteriocin ln đi kèm với quá trình sinh tổng hợp
protein miễn dịch giúp tế bào chủ có thể kháng lại với peptide kháng khuẩn mà
chúng vừa tiết ra. Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu đƣợc thực hiện nhƣng cho
đến nay, cơ chế bảo vệ tế bào chủ của các protein miễn dịch này vẫn chƣa đƣợc
hiểu biết tƣờng tận và vẫn chỉ là những giả thiết. Hình 1.4 mơ tả một giả thuyết về
cơ chế bảo vệ tế bào chủ của các protein miễn dịch.
Các tác giả đã chỉ ra rằng tuy cấu trúc khơng gian có phần giống nhau nhƣng
protein miễn dịch lại thể hiện tính đặc hiệu khá mạnh với bacteriocin mà chúng
kháng lại [15]. Một số nghiên cứu cho rằng vùng cấu trúc kẹp tóc ở đầu C gắn trên
màng đƣợc nhận ra bởi phần C trên protein miễn dịch [60]. Cũng theo nghiên cứu
này, bacteriocin và protein miễn dịch của nó nằm ở hai phía đối nhau của màng
nhƣng lại không thấy sự liên kết trực tiếp nào giữa hai phân tử này [19]. Do đó,
ngƣời ta cho rằng màng tế bào hoặc hợp chất đặc hiệu nào đó sẽ đóng vai trị trung

22


gian cho hai chất này. Khi đó protein miễn dịch có thể tƣơng tác với lỗ màng vừa
đƣợc tạo ra và vì vậy có thể ngăn khơng cho các chất nội bào đi ra ngồi mơi
trƣờng. Ngồi ra, từ nghiên cứu này ngƣời ta cũng đƣa ra một khả năng khác rằng
protein miễn dịch có thể tƣơng tác với thụ thể trên màng và ức chế hoạt động của nó
bằng cách thay đổi cấu tạo hoặc giấu đi vị trí gắn bacteriocin của các thụ thể này
[96]. Các protein vận chuyển mannose trên màng đƣợc giả định là các thụ thể đặc
hiệu dành cho bacteriocin lớp IIa [37]. Tuy nhiên với cả hai giả thiết trên, rất khó để
giải thích đƣợc tính đặc hiệu miễn dịch xảy ra nhƣ thế nào.

Thành tế bào
Màng sinh chất

Hình 1.4. Cơ chế bảo vệ của tế bào chủ [35]
-

Hình A: Bacteriocin bám vào màng tế bào đích nhờ thụ thể là tiểu đơn vị IIC và IID
của hệ thống vận chuyển đƣờng mannose trên màng tế bào. Sau khi thấm qua màng,
bacteriocin hình thành lỗ xuyên qua màng, gây thất thoát các chất nội bào và làm chết
tế bào.

-

Hình B: Trong tế bào tạo bacteriocin, peptide miễn dịch (I) kết hợp chặt chẽ với các thụ
thể của bacteriocin (IIC, IID), ngăn chặn sự hình thành lỗ xuyên màng, qua đó bảo vệ
đƣợc tế bào chủ.
AB, C, D: các tiểu đơn vị IIAB, IIC, IID trong hệ thống vận chuyển đƣờng mannose trên
màng tế bào vi khuẩn; I: protein miễn dịch.

23