Hiệu quả của tolerines trong việc hạn chế truyền lây virus gây bệnh đốm trắng cho tôm sú nuôi thương phẩm

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

HIỆU QUẢ CỦA TOLERINES TRONG VIỆC HẠN CHẾ
TRUYỀN LÂY VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG CHO
TƠM SÚ NI THƯƠNG PHẨM
Ngơ Thị Ngọc Thủy1*, Trần Ngọc Hiểu1, Đặng Thị Trà My1
TÓM TẮT
Tolerine - protein tái tổ hợp rVP28 - đã được nhiều nhà nghiên cứu xác định có khả năng bảo vệ tôm
trước virus gây bệnh đốm trắng (WSSV). Nghiên cứu này, ngoài xác định hiệu quả bảo vệ, hiệu quả
hạn chế truyền lây của protein tái tổ hợp rVP28 biểu hiện trong tế bào nấm men cũng được đánh giá
dựa trên hệ số sinh cơ bản R. Tôm được dùng tolerine 1 đợt hoặc 2 đợt (10 ngày đợt-1 và mỗi đợt
cách nhau 10 ngày). Sau đó, chúng được gây nhiễm theo cặp gồm 1 tôm khỏe và 1 tôm gây nhiễm
bằng WSSV trong cùng nhóm. Kết quả cho thấy tôm dùng tolerine có tỷ lệ chết (50,7 – 63,3%) và
tỷ lệ nhiễm (62,7 – 67,8%) thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê với tôm đối chứng (72,4 – 75,7% và
74,8- 76,0%) (P < 0,05). Ngoài ra, hệ số R của các lô tôm được dùng tolerine (2,07 – 2,43) thấp hơn
ở các lô tôm không dùng tolerine (2,96 – 3,28); tuy nhiên, các hệ số này đều lớn hơn 1 đã không
biểu thị khả năng hạn chế lây nhiễm virus gây bệnh đốm trắng của tolerine. Như vậy, việc nghiên
cứu các giải pháp kỹ thuật, quản lý kết hợp với việc sử dụng tolerine là cần thiết để góp phần làm
giảm khả năng lây lan của virus, hạn chế sự bùng phát của dịch bệnh.
Từ khóa: Tolerine, truyền lây, bệnh đốm trắng.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây nhiều nghiên
cứu về vắc xin/tolerine phịng bệnh đốm trắng
cho tơm đã được cơng bố rộng rãi. Đó là các
nghiên cứu về tolerine nhược độc (Namikoshi
et al., 2004; Singh et al., 2005; Zhu et al., 2009),
protein tolerine (Caipang et al., 2008; Jha et al.,
2007; Jha et al., 2006a; Witteveldt et al., 2004b,
2006) và DNA tolerine (Kumar et al., 2009;
Ning et al., 2009; Rout et al., 2007). Để đánh

giá hiệu quả của các loại tolerine này trong việc
phòng bệnh đốm trắng, tất cả các nghiên cứu
đều dựa trên việc so sánh, đánh giá tỷ lệ sống và
dựa vào chỉ số bảo hộ RPS (Relative Percentive
Survival) của tơm thí nghiệm sau gây nhiễm
với virus. Tuy nhiên, tỷ lệ truyền lây – một yếu
tố quan trọng để đánh giá hiệu quả của vắc xin
(Anderson, 1992; Dejong và Kimman, 1994) đã
không được đề cập đến. Thực tế, trong một số
trường hợp, mặc dù vắc xin khơng có hiệu quả

bảo vệ cao cho từng cá thể nhưng nó vẫn có ích
cho quần đàn nếu nó có thể làm giảm sự lây
truyền của tác nhân trong quần đàn (Anderson,
1992).
Chính vì vậy, nghiên cứu này ngoài việc
đánh giá tỷ lệ bảo hộ của tolerine như các tài
liệu đã công bố, tiêu chí giảm sự lan truyền
virus trong quần đàn cũng được xác định dựa
trên chỉ số sinh cơ bản R. Đây là chỉ sớ xác định
số trung bình động vật bị nhiễm virus do sự lây
lan từ một cá thể ban đầu mang mầm bệnh trong
quần đàn. Nếu R lớn hơn 1 có nghĩa là 1 cá thể
mang mầm bệnh sẽ có thể lây lan cho hơn 1
cá thể khỏe khác trong quần đàn – và như vậy
dịch bệnh sẽ xuất hiện. Ngược lại, R nhỏ hơn 1
đồng nghĩa với việc có ít hơn 1 cá thể khỏe sẽ
bị nhiễm bệnh từ 1 cá thể mang bệnh trong quần
đàn – điều này cho thấy tác nhân gây bệnh dần
sẽ bị loại và dịch bệnh sẽ không thể sảy ra. Đây

là một nội dung của đề tài cấp Bộ: Bước đầu

1. Phân Viện Nghiên cứu Thủy sản Nam sông Hậu, Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản 2.
* Email:

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

37


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
nghiên cứu, sản xuất tolerine có khả năng hạn
chế lây lan của virus gây bệnh đốm trắng trên
tôm sú Penaeus monodon nuôi thương phẩm ở
Đồng bằng sông Cửu Long.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
• Tơm sú: 900 con tôm sú kích cỡ 2,6 ±
0,5g/con, tôm có màu sắc tươi sáng, không bị
tổn thương vỏ, phụ bộ, không bị nhiễm nấm, ký
sinh trùng, vi khuẩn V. parahaemolyticus, virus
gây bệnh đốm trắng, đầu vàng, còi, virus gây
bệnh  hoại tử cơ quan tạo máu và biểu mơ .
• Chủng WSSV: Virus gây bệnh đốm trắng
dùng trong nghiên cứu này là virus thu được
tại Quảng Ngãi trong thời gian dịch bệnh, là
loại virus đã dùng trong các nghiên cứu của
Dieu (2010), cung cấp bởi trường Đại học
Wageningen, Hà Lan. Virus được phân lập và

tinh sạch dựa theo phương pháp của Xie et al.,
(2005) và được bảo quản ở -80oC tại Phân Viện
Nghiên Cứu Thủy Sản Minh Hải.
• Thức ăn và Tolerine: Thức ăn dùng trong
nghiên cứu này là thức ăn viên thương mại dùng
cho tôm sú nuôi thương phẩm giai đoạn 2-3gram
(LAONE L300 của công ty UNI-PRESIDENT,
Việt Nam). Tolerine là protein tái tổ hợp rVP28
có trong dịch và tế bào nấm men Pichia pastoris
với mật độ 3,1 x 1010 ml-1. Đối chứng là dịch
nuôi cấy và tế bào nấm men không mang gen
VP28 (khơng có protein tái tở hợp rVP28).
• Nước biển, bể thí nghiệm: Nước biển

dùng trong thí nghiệm có độ mặn 25‰ được
lắng, lọc, xử lý chlorine 30 ppm trước khi sử
dụng. Hai bể composite có thể tích 2 m3/bể được
gắn sục khí đáy và bề mặt và hệ thống nuôi tôm
theo cặp được thiết kế gồm gồm 160 hộp nhựa 2
lít chia làm 2 dãy ngăn cách với nhau để hạn chế
tối đa lây nhiễm chéo giữa tôm ở lô đối chứng
và thí nghiệm. Mỗi hộp nhựa được gắn 1 cục
bọt sục khí và được nuôi hai con tôm: một gây
nhiễm bằng WSSV và một tôm khỏe.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
• Chuẩn bị thức ăn có tolerine và thức ăn
đối chứng
Tolerine được pha loãng theo cơ số 10 bằng
dung dịch đệm phosphate (PBS) vô trùng để
được dung dịch có nồng độ 3,1 x 109 tế bào.ml-1.

Dung dịch này được được trộn đều với 10 gram
thức ăn LAONE L300 và ủ trong đá lạnh 20 phút
trước khi áo bằng dầu mực (ANOVA) với tỷ lệ
1% theo trọng lượng. Thức ăn đối chứng là thức
ăn thương mại cùng loại trộn với tế bào nấm men
không mang gen VP28 và dịch nuôi cấy tương
ứng. Thức ăn này có thể được dùng ngay hoặc
bảo quản trong tủ mát 40C trong 1 ngày.
• Bố trí thí nghiệm
800 con tơm thí nghiệm chia đều làm hai
nhóm ni trong 2 bể 4m3 (Hình 1): một nhóm
cho ăn thức ăn trộn tolerine và một nhóm cho ăn
thức ăn đối chứng trong 10 ngày. Tôm sau đó được
ngưng cho ăn thức ăn thí nghiệm trong 10 ngày trong thời gian này chúng được dùng thức ăn thức
ăn viên thương mại LAONE L300 (Hình 3A).

Hình 1: Bố trí thí nghiệm ở giai đoạn cho ăn tolerine
38

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2
Sau đó, 140 con tơm ở mỗi nhóm sẽ được
chuyển ra khu vực thí nghiệm lây nhiễm để tiến
hành bố trí gây nhiễm theo mơ hình cặp (Velthuis
et al., 2002): 1 tơm được gây nhiễm bằng liều
gây chết tối thiểu 100% được nuôi cùng 1 tôm
khỏe (Hình 3B). Tôm lây nhiễm và tôm khỏe

được phân biệt bằng cách buộc các sợi chỉ có
màu sắc khác nhau ở vị trí gốc mắt tôm (Hình
2). Tỷ lệ tôm chết được theo dõi hàng ngày và
sự hiện diện của virus đốm trắng trong tất cả tơm
thí nghiệm sẽ được kiểm tra bằng phương pháp
PCR (Hình 3C).

Hình 2: Bố trí thí nghiệm ni tơm theo cặp ở giai đoạn gây nhiễm

Số tơm cịn lại sẽ được tiếp tục cho ăn thức ăn trộn tolerine lần thứ hai trong 10 ngày rồi
ngưng trong 10 ngày và tiến hành cảm nhiễm ngược theo cặp tương tự như ở giai đoạn trước.

Hình 3: Bố trí thí nghiệm xác định khả năng hạn chế lây lan của tolerine
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

39


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2
• Chăm sóc, quản lý tôm thí nghiệm
Tôm được cho ăn thức ăn thí nghiệm 2 lần.
ngày-1 vào 8 giờ và 17 giờ với lượng 5% trọng
lượng cơ thể. Ở giai đoạn gây nhiễm, lượng
thức ăn được điều chỉnh hàng ngày dựa theo số
lượng tôm chết và mức độ ăn của tôm. Các dấu
hiệu bất thường như mềm vỏ, đốm trắng,… và
tỷ lệ chết của tôm được ghi chép 2 lần.ngày-1 vào
lúc 7-9 giờ và 16-19 giờ. Tôm gây nhiễm bằng
ngâm virus bị chết sẽ được giữ lại trong bể nuôi
24 giờ để đảm bảo có sự lây truyền của virus.

Tơm khơng gây nhiễm nếu chết sẽ được bỏ ra
khỏi bể nuôi ngay lập tức. Tôm chết được bảo
quản ở tủ lạnh -200C. Kết thúc thí nghiệm, tất cả
tơm sẽ được kiểm tra sự hiện diện của virus đốm
trắng bằng phương pháp PCR (Kiatpathomchai
et al., 2001).
Mơi trường nước được duy trì bằng cách
vệ sinh bể, điều chỉnh lượng thức ăn, bổ sung
men vi sinh, hoặc thay nước khi cần thiết. Tôm
được nuôi trong phịng thí nghiệm có khống chế
nhiệt độ để duy trì nhiệt độ nước khoảng 280C;
độ mặn nước 25‰, sục khí được lắp ở từng bể
và được điều chỉnh để lượng oxy hịa tan ln
lớn hơn 4mg.l-1. Ở giai đoạn gây nhiễm 10-15ml
nước biển vơ trùng có cùng độ mặn được cấp
đều cho từng bể để duy trì mức nước và độ mặn.
Các yếu tố môi trường: nhiệt độ, pH, độ mặn,
NH3, NO2, H2S được theo dõi 3 ngày.lần-1 vào
lúc 7 giờ. Ở giai đoạn chuẩn bị tôm, các yếu
tố môi trường được đo tại từng bể; ở giai đoạn
nuôi tôm theo cặp, chúng được đo ở 5 bể ngẫu
nhiên. Nhiệt độ được đo bằng nhiệt kế; pH đo
bằng máy pH cầm tay (HANNA HI 8424); độ
mặn đo bằng khúc xạ kế (Atago Master S-Mill
Alpha). Hàm lượng khí độc được phân tích
theo các phương pháp hiện hành: Nitrit -TCVN
6178:1996, Amonia - TCVN 3706:1990, và Hydrosulphua -TCVN 6637:2000.
• Phương pháp phân tích số liệu
Tỷ lệ chết của tôm sau gây nhiễm 10 ngày
40

được phân tích bằng thống kê mô tả, so sánh
dựa trên kiểm định t-test và ANOVA, phân tích
Duncan bằng phần mềm SPSS 16.0. Đối với
kiểm định ANOVA, các số liệu biểu thị phần
trăm như: tỷ lệ chết, tỷ lệ RPS được chuyển đổi
sang arsin trước khi phân tích.
- Giá trị RPS (Relative Percent Survivor)
được tính dựa theo Amend (1981):
RPS (%) = (1 – tỷ lệ chết của nhóm dùng
tolerine/tỷ lệ chết của nhóm đối chứng) x 100
- Tỷ số sinh cơ bản – The basic reproduction
ratio (R), hệ số truyền lây β của từng nhóm và
phương pháp so sánh FS được dùng để xác
định sự khác biệt giữa nhóm có dùng và khơng
dùng tolerine (Hình 3D). Tolerine có hiệu quả
hạn chế lây truyền nếu giá trị Rv (Giá trị R của
nhóm dùng tolerine) khác biệt có ý nghĩa với
giá trị Ro (R của nhóm khơng dùng tolerine) và
Rv nhỏ hơn 1 trong khi Ro lớn hơn 1.
Trong đó:
R: tỷ số sinh cơ bản; β: hệ số truyền lây
P: xác suất để một cá thể bị lây nhiễm (mức
2) từ một cá thể đã bị nhiễm (mức 1) trong quần
đàn chưa bị lây nhiễm.
III. KẾT QUẢ
3.1. Sự biến động của các yếu tố môi
trường
Các yếu tố môi trường trong cả hai giai
đoạn đều trong khoảng thích hợp cho sự phát

triển của tôm: nhiệt độ 27 – 290C, pH 8,0 – 8,2;
Amonia 0,00 – 0,04 mg.l-1; Nitrit 0,00 – 0,03
mg.l-1 và hydrosulphure 0,00 mg.l-1 (Bảng 1). Ở
giai đoạn gây nhiễm, hiện tượng tôm chết xuất
hiện và tôm gây nhiễm chết không được lấy ra
ngay mà được duy trì trong bể ni nhằm tạo cơ
hội cho việc lây truyền virus sang cá thể tiếp xúc.
Điều này làm cho hàm lượng khí độc (ammonia,
nitrit) cao hơn trong môi trường song vẫn nằm
trong giới hạn thích hợp, do đó khơng gây ảnh

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
hưởng đến sức khỏe của tơm. Ngồi ra, khơng
có sự khác biệt về các yếu tố môi trường theo

dõi giữa các công thức thí nghiệm: có và khơng
dùng tolerine (P<0,05).

Bảng 1: Biến động của các yếu tố mơi trường trong thí nghiệm
Thơng số
mơi trường
Nhỏ nhất
1. Giai đoạn trước gây nhiễm

Thí nghiệm
Lớn nhất

Trung bình

Nhiệt độ (0C)

27,0

29,0

28,2 ± 0,53

pH

8,0

8,2

8,0 ± 0,06

Độ mặn (‰)

25

25

25 ± 0,00

NH3 (mg/l)

0,00

0,02

0,004 ± 0,006

0,00

0,00

0,00 ± 0,00

H2S (mg/l)
2. Giai đoạn gây nhiễm

0,00

0,00

0,00 ± 0,00

Nhiệt độ (0C)

27,0

29,0

28,0 ± 0,36

pH

8,0

8,2

8,1 ± 0,08

Độ mặn (‰)

25

25

25 ± 0,0

NH3 (mg/l)

0,00

0,03

0,01 ± 0,008

0,00

0,02

0,003 ± 0,006

H2S (mg/l)

0,00

0,00

0,00 ± 0,00

NO2 (mg/l)

NO2 (mg/l)

3.2. Thời gian chết của tôm
Giai đoạn gây nhiễm, tơm ở cả 2 thí nghiệm
Giai đoạn cho ăn thức ăn thí nghiệm, tơm
khỏe, hoạt động tốt, khơng biểu hiện dấu hiệu bắt đầu chết sau 2 ngày ngâm virus và hiện
bệnh lý và có tỷ lệ sống cao. Ngồi ra, hiện tượng tôm chết kéo dài đến khi kết thúc thí
tượng tơm chết trên một số ít tơm ở cả lơ thí nghiệm (10 ngày). Nhìn chung, khơng có sự
nghiệm và đối chứng (<2,0%), chủ yếu do ăn khác biệt về thời gian chết của tơm có và khơng
nhau sau lột xác - tỷ lệ sống của tôm lần lượt là dùng tolerine (P>0,05).
98,5 và 98,8%.
Bảng 2: Thời gian chết của tơm ở giai đoạn gây nhiễm của thí nghiệm
Thơng số

Cơng thức
thí nghiệm

Số
tơm
chết

Nhỏ
nhất

(ngày)

Lớn
nhất
(ngày)

Trung bình
(ngày)

1 lần dùng tolerine

Đối chứng

95

2

10

5,4 ± 2,4

Thí nghiệm

76

2

10

5,0 ± 2,3

Đối chứng

103

2

10

5,5 ± 2,3

Thí nghiệm

71

2

10

5,5 ± 2,5

Thí nghiệm

63

2

9

4,5 ± 1,9

2 lần dùng tolerine

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

Giá trị Giá trị
t-test
P
0,95

0,346

-0,14

0,889

41


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2
Bên cạnh đó, tơm được ngâm trực tiếp trong
dung dịch có chứa WSSV chết nhanh hơn tôm
gián tiếp nhiễm virus thông qua tiếp xúc khoảng
1-2 ngày (Bảng 3). Cụ thể, tôm gây nhiễm có

thời gian chết trung bình là 4-5 ngày, trong khi
ở tôm tiếp xúc là 5-6 ngày. Tuy nhiên, sự khác
biệt này khơng có ý nghĩa về mặt thống kê ở
một số giai đoạn gây nhiễm (P>0,05).

Bảng 3: Kết quả phân tích về thời gian chết của tơm gây nhiễm và tôm tiếp xúc
Thông số

Loại tôm

1 lần dùng tolerine
2 lần dùng tolerine

Số tơm
chết

Thời gian chết
trung bình (ngày)

Giá trị T-test

Giá trị
P

Tiếp xúc

26

5,5 ± 2,1

1,23

0,224

Gây nhiễm

50

4,8 ± 2,4

Tiếp xúc

24

1,94

0,056

Gây nhiễm

47

6,3 ± 2,3
5,1 ± 2,5

3.3. Tỷ lệ chết và dấu hiệu bệnh lý
Trong thí nghiệm tỷ lệ chết của tơm có
dùng tolerine thấp hơn so với tôm đối chứng –
không dùng tolerine (P<0,05) (Bảng 4). Tỷ lệ
chết trung bình của tơm được dùng tolerine 1

lần và 2 lần sau gây nhiễm dao động từ 50,7%
đến 63,3%; so với tôm đối chứng – không

dùng tolerine có tỷ lệ chết trong khoảng

72,4% đến 75,7%.

Bảng 4: Tỷ lệ chết của tơm thí nghiệm theo cơng thức thí nghiệm
Thơng số
1 lần dùng tolerine
2 lần dùng tolerine

Cơng thức thí nghiệm

Tỷ lệ chết (%)

Giá trị P

Đối chứng

72,4

0,002

Thí nghiệm

54,3

Đối chứng

75,0

Thí nghiệm

50,7

Một số tôm chết ở giai đoạn gây nhiễm
(28,8% tôm đối chứng và 31,3% tơm dùng
tolerine) có thể hiện dấu hiệu bệnh lý điển hình
của tơm bị bệnh đốm trắng: các đốm trắng có
kích cỡ khác nhau trên lớp vỏ kitin, đặc biệt
ở phần vỏ đầu ngực. Bên cạnh đó, hiện tượng
tôm mềm vỏ cũng xuất hiện trên 22,6% tôm

0,001

đối chứng và 25,1% tơm thí nghiệm có dùng
tolerine. Tuy nhiên, các dấu hiệu này khơng
khác nhau giữa các cơng thức thí nghiệm (dùng
và không dùng tolerine, dùng 1 lần và dùng
2 lần), giữa các loại tôm (gây nhiễm trực tiếp
bằng ngâm WSSV, gián tiếp bằng tiếp xúc trong
nuôi chung với tôm nhiễm WSSV).

Hình 4: Đốm trắng trên lớp vỏ đầu ngực của tơm thí nghiệm
42

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
3.4. Tỷ lệ nhiễm và hệ số truyền lây R
• Tỷ lệ nhiễm
Kết quả phân tích PCR tất cả tơm tham gia
thí nghiệm cho thấy tôm đối chứng – không

dùng tolerine có tỷ lệ nhiễm WSSV (74,8%) cao

hơn so giá trị này của tôm được dùng tolerine
(66,2%) (P<0,05). Điều này thể hiện hiệu quả
của tolerine trong việc hạn chế tỷ lệ nhiễm
WSSV trong quần đàn (Bảng 5).

Bảng 5: Tỷ lệ nhiễm WSSV của tơm ở thí nghiệm
Thí nghiệm
Thí nghiệm

Cơng thức

Số

Kết quả PCR (%)

mẫu

Đối chứng

271

Âm tính
25,2

Thí nghiệm

280

33,8

• Hệ số sinh cơ bản R
Kết quả phân tích đã cho thấy giá trị R thu
được ở các lơ tơm có dùng tolerine đều nhỏ hơn

lơ đối chứng, tuy nhiên sự sai khác không
đủ lớn về mặt thống kê (P>0,05). Cụ thể,
hệ số R của tôm dùng tolerine 1 lần là 2,43

Giá trị

Dương tính

Chi-square

P

74,8

4,94

0,026

66,2

trong khi giá trị này là 2,96 ở tôm đối chứng.
Tôm dùng tolerine 2 lần có giá trị R (2,07 ở lơ
thí nghiệm và 3,28 ở lô đối chứng) nhỏ hơn so
với tôm được dùng tolerine 1 lần, song tất cả các

hệ số R này đều lớn hơn 1 (Bảng 6).

Bảng 6: Hệ số truyền lây β và hệ số R của thí nghiệm
Cơng thức 

Hệ số truyền lây
β

Hệ số R

Khoảng tin cậy 95%
Cận trên

Một lần dùng tolerine 

R

Cận dưới

Khoảng tin cậy 95%
Cận trên

 

 

 

Cận dưới
 

Đối chứng

1,82

1,83

1,80

2,96

2,98

2,94

Thí nghiệm

1,59

1,61

1,57

2,43

2,44

2,41

Đối chứng

1,94

1,96

1,93

3,28

3,29

3,27

Thí nghiệm

1,42

1,44

1,40

2,07

2,08

2,05

Hai lần dùng tolerine

Bên cạnh hệ số R, hệ số truyền lây β tính

theo phương pháp FS cho tất cả các giai đoạn
(cho ăn tolerine 1 và 2 lần) cho thấy hệ số này
đều lớn hơn 1 và nhỏ hơn ở các lô thí nghiệm
(Bảng 6). Cụ thể, hệ số truyền lây của tơm trong
cơng thức có dùng tolerine là 1,42 - 1,78 trong
khi hệ số này ở nhóm đối chứng là 1,82 –2,02.
Tuy nhiên, khơng tìm thấy sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê về hệ số truyền lây của tơm thí

nghiệm theo số lần dùng tolerine và theo kích
cỡ tơm (theo thí nghiệm).
IV. THẢO ḶN
Trong nghiên cứu này, các yếu tố môi trường:
nhiệt độ, pH, ammonia, nitrit, hydrosulphit đều
nằm trong ngưỡng thích hợp cho tôm phát triển.
Bên cạnh đó không có sự khác biệt về biến động
của chúng giữa các lô tôm có và không dùng
tolerine (Bảng 1). Điều này cho thấy các yếu tố

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

43


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2
mơi trường có diễn biến như nhau; do đó, ảnh
hưởng giống nhau đến kết quả thí nghiệm ở các
cơng thức.
Nghiên cứu đã xác định tỷ lệ chết của tôm
được dùng tolerine (50,7 – 63,3%) thấp khác

biệt có ý nghĩa thống kê với tỷ lệ chết của các
lô tôm không dùng tolerine (72,4 – 75,7%)
(Bảng 4). Điều này cho thấy tolerine – protein
tái tổ hợp VP28 biểu hiện trong tế bào nấm
men P.pastoris– có khả năng bảo vệ cho tôm
sú P.monodon nuôi thương phẩm trước WSSV.
Kết quả tương tự đã được ghi nhận trong nghiên
cứu của Witteveldt et al., (2004a) sau 21 ngày
cho ăn tolerine – protein VP28 biểu hiện trong
tế bào vi khuẩn E.coli, tơm sú có tỷ lệ chết sau
gây nhiễm WSSV (50,0%) thấp hơn so với tôm
đối chứng – không dùng tolerine (70,0%) và
tỷ lệ này là 23,0% ở lơ thí nghiệm và 93,0%
ở lô đối chứng khi tôm được gây nhiễm ở giai
đoạn 7 ngày sau dùng tolerine. Cùng sử dụng
loại tolerine này trong một thí nghiệm khác
trên tơm he Nhật Bản P. japonicus, các nhà
nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ chết của tơm có
dùng tolerine (22,0%) thấp hơn nhiều so với
tôm đối chứng (73,0%) khi được gây nhiễm ở
giai đoạn 10 ngày sau khi dùng tolerine (Satoh
et al., 2008).
Bên cạnh đó, mặc dù đã có nghiên cứu xác
định khả năng bảo vệ cao hơn của tolerine với
WSSV khi tôm được dùng 2 lần bằng phương
pháp tiêm (Namikoshi et al., 2004). Tuy nhiên,
kết quả phân tích khơng có sự khác biệt về
tỷ lệ chết giữa tôm được dùng một và hai lần
tolerine trong cùng một thí nghiệm (Bảng 4).
Hiện chưa có nghiên cứu nào về hiệu quả bảo vệ

của tolerine theo số lần cho ăn; song Jha et al.,
(2006b) đã xác định sau 3 ngày dùng tolerine lần
cuối, tỷ lệ bảo hộ của tolerine - rVP28 biểu hiện
trong tế bào E.coli–cho crayfish khi được tiêm
hai lần (50,5%) tương đương với khi crayfish
được cho ăn tolerine trong 25 ngày (52,0%).
44

Trong các nghiên cứu trước đây về hiệu quả
của tolerine, hầu hết các tác giả chỉ đánh giá
mức độ nhiễm của tơm được dùng tolerine sống
sót sau thí nghiệm. Ở các nghiên cứu này, tất
cả tơm sống sót đều âm tính với WSSV bằng
PCR một bước (one step PCR) (Wei và Xu,
2009; Witteveldt et al., 2004a; Xu et al., 2006).
Ở nghiên cứu này, chúng tôi đã dùng phương
pháp semi-nested PCR - Đây là phương pháp có
đợ nhạy cao, có thể xác định được 5 fg WSSV
DNA (tương đương với 20 phân tử virus) để
xác định sự hiện diện của WSSV trong mơ cơ ở
đốt thứ 6 của tơm tham gia thí nghiệm. Kết quả
phân tích cho thấy tolerine có khả năng hạn chế
khả năng nhiễm WSSV trong quần đàn thể hiện
ở tỷ lệ nhiễm WSSV thấp khác biệt có ý nghĩa
thống kê của tôm được dùng tolerine so với tôm
đối chứng (P<0,05) (Bảng 5). Tôm được dùng
tolerine khi gây nhiễm với WSSV liều gây chết
tối thiểu 100% có tỷ lệ nhiễm WSSV là 66,2%.
Kết quả này gần giống như kết quả nghiên cứu
của Satoh et al., (2008) khi tác giả dùng liều gây

chết 50% để đánh giá hiệu quả của tolerine thì
tơm thí nghiệm có tỷ lệ nhiễm từ 10% - 52,5%
tùy theo phương pháp gây nhiễm (cho ăn, nhúng
và tiêm).
Trong nghiên cứu này, hệ số sinh cơ bản
R của các lô thí nghiệm (2,07-2,43) nhỏ hơn
so với lô đối chứng (2,96 – 3,28); song các giá
trị này đều lớn hơn 1 và không khác biệt có ý
nghĩa (Bảng 6). Điều này có nghĩa rằng việc lây
nhiễm WSSV trong quần đàn tơm có và khơng
dùng tolerine đều đủ có thể gây thành dịch bệnh.
Tương tự hệ số sinh cơ bản, hệ số truyền lây
β cũng nhỏ hơn ở các lô thí nghiệm tuy nhiên
không tìm thấy sự khác biệt giữa lô thí nghiệm
(1,42 – 1,59); và lô đối chứng (1,82-1,94). Nếu
hệ số truyền lây β này được tính theo giờ, nó sẽ
tương đương với 0,0059 -0,0074.giờ-1 ở tơm có
dùng tolerine và 0,0076 - 0,0084.giờ-1 ở lô không
được dùng tolerine. Giá trị β thu được trên tơm

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
đối chứng tương đương với hệ số truyền lây
Tuyen et al., (2014b) tìm được cho tôm sú và
tôm chân trắng P. vannamei trong thí nghiệm
ni cặp chung (hệ số truyền lây virus trực tiếp
từ tôm sang tôm và hệ số truyền lây gián tiếp từ
nước sang tơm đều bằng 0,0081.giờ-1). Nếu tính

theo cơng thức của Soto và Lotz (2001), thì hệ
số truyền lây β của thí nghiệm (0,012 – 0,017

– Bảng 7) nằm trong khoảng tin cậy 95% của
hệ số truyền lây mà hai tác giả đã tìm được trên
tơm thẻ P. vannamei bằng phương pháp nuôi
chung (0,00 – 0,12). Tương tự như kết quả phân
tích hệ số truyền lây bằng phương pháp FS, các
hệ số truyền lây tính theo Soto và Lotz (2001)
cũng nhỏ hơn ở các lơ thí nghiệm nhưng khơng
khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Bảng 7: Hệ số truyền lây của thí nghiệm được tính theo Solo và Lotz (2001)
Thông số

Số lần dùng

β

Khoảng tin cậy 95%

Tolerine
Đối chứng

Dùng tolerine

Cận trên

Cận dưới

1 lần

0,015

0,030

-0,001

2 lần

0,015

0,029

0,000

1 lần

0,013

0,028

-0,003

2 lần

0,012

0,028

-0,004

Như vậy, kết quả về hệ số sinh cơ bản
và hệ số truyền lây ở trên cho thấy tolerine
chưa thể hiện được hiệu quả trong việc giảm
khả năng truyền lây của WSSV trong quần
đàn. Điều này cũng giống như kết quả nghiên
cứu của Thuy et al., (2014) về hiệu quả của
tolerine – protein tái tổ hợp VP28 biểu hiện
trong E.coli – trên tôm thẻ P.vannamei. Tác
giả đã xác định rằng mặc dù có khả năng làm
giảm tỷ lệ chết của tôm sau gây nhiễm, nhưng
tolerine này không hạn chế được khả năng
truyền lây của WSSV.
V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1. Kết luận
Tolerine – protein tái tổ hợp VP28 biểu
hiện trong tế bào nấm men có thể bảo vệ tôm sú
P.monodon nuôi thương phẩm với WSSV biểu
hiện bởi tỷ lệ chết (50,7 – 63,3%) và tỷ lệ nhiễm
WSSV (62,7 – 67,8%) thấp của tơm có dùng

tolerine so với tôm đối chứng (tỷ lệ chết 72,4
– 75,7% và tỷ lệ nhiễm WSSV 74,8 – 76,0%)
(P<0,05).
Tolerine chưa thể hiện khả năng hạn chế lây
nhiễm WSSV trong quần đàn do hệ số sinh cơ
bản R của cả hai nhóm đối chứng và thí nghiệm
đều lớn hơn 1 và khơng có sự khác biệt có ý
nghĩa về hệ số R giữa các lơ có và khơng dùng

tolerine.
5.2. Đề xuất

Trong nghiên cứu này, mặc dù tolerine có thể
bảo vệ được tơm trước WSSV, song chúng
không hạn chế được khả năng lây lan của
virus trong quần đàn. Do đó, cần có những
nghiên cứu tiếp theo về các giải pháp kỹ thuật,
quản lý kết hợp với việc sử dụng tolerine để
làm giảm khả năng lây lan của virus, hạn chế
sự bùng phát của dịch bệnh đốm trắng.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

45


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Anderson, R.M., 1992. The concept of herb-immunity
and the design of communit-based imunization
programs. Vaccine 10, 928-935.
Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo,
H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y.,
2008. Enhanced survival of shrimp, Penaeus
(Marsupenaeus) japonicus from white spot
syndrome disease after oral administration of
recombinant VP28 expressed in Brevibacillus
brevis. Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320.

Dejong, M.C.M., Kimman, T.G., 1994. Experimental
quantification of vaccine-induced reduction in
virus transmission. Vaccine 12, 761-766.
Dieu, B.T.M., 2010. On the epidemiology and evolution
of white spot syndrome virus of shrimp, Graduate
school of production ecology and resources
conservation. Wageningen University, p. 135.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, W.F., Shen,
J., 2007. Protection of Procambarus clarkii against
white spot syndrome virus using recombinant
oral vaccine expressed in Pichia pastoris. Fish &
Shellfish Immunology 22, 295-307.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006a. Protection of
Procambarus clarkii against white spot syndrome
virus using recombinant subunit injection vaccine
expressed in Pichia pastoris. Fisheries Science 72,
1011-1019.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Shen, J., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li,
W.F., 2006b. The efficacy of recombinant vaccines
against white spot syndrome virus in Procambarus
clarkii. Immunology Letters 105, 68-76.
Kiatpathomchai, W., Boonsaeng , V., Tassanakajon,
A., C., W., Jitrapakdee, S., Panyim, S., 2001. A
non-stop, single-tube, semi-nested PCR technique
for grading the severityof white spot syndrome
virus infections in Penaeus monodon. Disease of
Aquatoc Organisms 47, 235-239.
Kumar, R.S., Venkatesan, C., Sarathi, M., Sarathbabu,
V., Thomas, J., Basha, K.A., Hameed, A.S.S.,
2009. Oral delivery of DNA construct using

chitosan nanoparticles to protect the shrimp from
white spot syndrome virus (WSSV). Fish &
Shellfish Immunology 26, 429-437.
Namikoshi, A., Wu, J.L., Yamashita, T., Nishizawa,
T., Nishioka, T., Arimoto, M., Muroga, K., 2004.
Vaccination trials with Penaeus japonicus to
induce resistance to white spot syndrome virus.
Aquaculture 229, 25-35.
Ning, J.F., Zhu, W., Xu, J.P., Zheng, C.Y., Meng, X.L.,
2009. Oral delivery of DNA vaccine encoding

46

VP28 against white spot syndrome virus in
crayfish by attenuated Salmonella typhimurium.
Vaccine 27, 1127-1135.
Rout, N., Kumar, S., Jaganmohan, S., Murugan, V.,
2007. DNA vaccines encoding viral envelope
proteins confer protective immunity against
WSSV in black tiger shrimp. Vaccine 25, 27782786.
Satoh, J., Nishizawa, T., Yoshimizu, M., 2008.
Protection against white spot syndrome virus
(WSSV) infection in kuruma shrimp orally
vaccinated with WSSV rVP26 and rVP28.
Diseases of Aquatic Organisms 82, 89-96.
Singh, I.S.B., Manjusha, M., Pai, S.S., Philip, R., 2005.
Fenneropenaeus indicus is protected from white
spot disease by oral administration of inactivated
white spot syndrome virus. Diseases of Aquatic
Organisms 66, 265-270.

Soto, M.A., Lotz, J.M., 2001. Epidemiological
parameters of white spot syndrome virus infections
in Litopenaeus vannamei and L.setiferus. Journal
of Invertebrate Pathology 78, 9-15
Tuyen, N.X., Verreth, J., Vlak, J.M., de Jong, M.C.M.,
2014b. Horizontal transmission dynamics of
white spot syndrome virus by cohabitation trials
in juvenile Penaeus monodon and P. vannnamei.
Preventive Veterinary Medicine 117, 286-294.
Thuy, N.T.N., M.P., Z., Vlak, J.M., De Jong, M.C.M.,
2014. Transmission of white spot syndrome
virus (WSSV) in vaccinated shrimp Penaeus
vanamei, 9th Symposium on Diseases on Asian
Aquaculture, Ho Chi Minh city, Vietnam.
Xie, X.X., Li, H.Y., Xu, L.M., Yang, F., 2005. A simple
and efficient method for purification of intact white
spot syndrome virus (WSSV) viral particles. Virus
Research 108, 63-67.
Xu, Z., Du, H., Xu, Y., Sun, J., Shen, J., 2006. Crayfish
Procambarus clarkia protected against white spot
syndrome virus by oral administration of viral
proteins expressed in silkworms. Aquaculture
253, 179-183.
Velthuis, A.G.J., De Jong, M.C.M., De Bree, J.,
Nodelijk, G., Van Boven, M., 2002. Quantification
of transmission in one-to-one experiments.
Epidemiology and Infection 128, 193-204.
Wei, K.Q., Xu, Z.R., 2009. Effects of oral recombinant
VP28 expressed in silkworm (Bombyx mori)
pupa on immune response and disease resistance

of Procambarus clarkii. World Journal of
Microbiology & Biotechnology 25, 1321-1328.
Witteveldt, J., Cifuentes, C.C., Vlak, J.M., van Hulten,

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

M.C.W., 2004a. Protection of Penaeus monodon
against white spot syndrome virus by oral
vaccination. Journal of Virology 78, 2057-2061.
Witteveldt, J., Vlak, J.M., van Hulten, M.C.W., 2004b.
Protection of Penaeus monodon against white spot
syndrome virus using a WSSV subunit vaccine.
Fish & Shellfish Immunology 16, 571-579.
Witteveldt, J., Vlak, J.M., van Hulten, M.C.W., 2006.
Increased tolerance of Litopenaeus vannamei

to white spot syndrome virus (WSSV) infection
after oral application of the viral envelope protein
VP28. Diseases of Aquatic Organisms 70, 167170.
Zhu, F., Du, H.H., Miao, Z.G., Quan, H.Z., Xu, Z.R.,
2009. Protection of Procambarus clarkii against
white spot syndrome virus using inactivated
WSSV. Fish & Shellfish Immunology 26, 685690.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

47

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

RECOMBINANT PROTEIN VP28 EXPRESSED IN Pichia pastoris AND
ITS EFFECT ON TRANSMISSION OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS
Ngo Thi Ngoc Thuy1*, Tran Ngoc Hieu1, Dang Thi Tra My1
ABSTRACT
The effect of recombinant protein VP28 expressed in Pichia pastoris– tolerines - on prevention of
white spot syndrome virus has been reported recently. In this study, effect of tolerines on WSSV
was based on comparison not only on the mortalities but also on the basic reproduction ratio (R)
between experimental groups. Black tiger shrimp Penaeus monodon in size of 2.6±0.5 gram/
individual were fed with tolerines for 1 and 2 times with a 10 day interval for experimental group
and without tolerine for control group. On the 11th day after feeding on tolerine, half of shrimp
number in each group were challenged with WSSV by immersion method, and then they were held
in pairs in separate containers; in which, one WSSV challenged shrimp was reared with one healthy
shrimp in the same group. The results showed that experimental shrimp group revealed significant
lower rate of mortality (50.7 – 63.3%) and WSSV infection (62.7 – 67.8%) as compared to those of
control group (72.4 – 75.7% and 74.8- 76.0%) (P<0.05). Additionally, the basic reproduction ration
of experimental groups (2.07 – 2.43) were also lower than that of control groups (2.96 – 3.28).
However, all those reproduction ratios were still higher than 1, consequently, recombinant protein
VP28 expressed in P. pastoris did not reduce the transmission of WSSV. This suggests further study
on management strategies along with tolerine utilization to prevent spread of WSSV in P.monodon
shrimp should be taken.
Keywords: Tolerine, transmission, white spot syndrome virus.

Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 18/11/2015
Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015
Ngày duyệt đăng: 25/12/2015

1. Research Sub-Institute for Nam Song Hau Fisheries, Research Institute for Aquaculture No.2.
* Email:

48

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016