Nghiên cứu khả năng enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH

Chuyên ngành : Vi sinh vật
Mã số : 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TRẦN THANH THỦY
TS. VÕ THỊ HẠNH

Thành phố Hồ Chí Minh – 2007


LỜI CẢM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Thanh Thủy, TS. Võ
Thị Hạnh- Người đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy Cô trong Bộ môn Vi sinh
đặc biệt là cô Tuyến và Ths. Phương phụ trách phịng thí nghiệm Vi sinh
trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cơ trong khoa
Sinh học, cùng tồn thể q Thầy Cơ đã tận tình giảng dạy trong suốt khóa
học.
Tơi xin gởi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục đào tạo tỉnh An Giang, Trường
THPT Vĩnh Trạch – An Giang, những người thân trong gia đình, bạn bè, đã
giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học.

Tác giả luận văn


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AMP

:

Adenozin mono photphat

CAP

:

Cataleolite gene Activator Protein

CMCase

:

Carbomexymethyl cellulase

CMC

:

Carboxymethyl cellulose

CBH

:

Cellobiohydrolase hay Exoglucanase

CBHI

:

Exoglucanase I

CBH II

:

Exoglucanase II

DNS

:

Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic

Enzym

:

Enzyme

EG

:

Endoglucanase

EGI

:

Endoglucanase I

EGII

:

Endoglucanase II

IU

:

Imeasure Unit (đơn vị hoạt độ)

KHV

:

Kính hiển vi

KL

:

Khuẩn lạc

MT

:

Mơi trường

PTN

:

Phịng thí nghiệm

PGA

:

Potato glucose agar

RNM

:

Rừng ngập mặn

VSV

:

Vi sinh vật


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Sự hiện hữu của rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ là kết quả của hơn 25
năm phục hồi và phát triển bằng các nổ lực to lớn của chính quyền và nhân
dân Thành phố Hồ Chí Minh. Vào ngày 21 tháng 1 năm 2000, Ủy ban MAB/
UNESCO đã công nhận RNM Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên tại
Việt Nam [55].
RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật q hiếm và bền
vững, có khả năng chịu đựng điều kiện sống rất đặc biệt khắc nghiệt. Là nơi
có hệ VSV vô cùng phong phú và đa dạng như nấm sợi, vi khuẩn, xạ
khuẩn…., trong đó nấm sợi chiếm số lượng rất lớn. Nấm sợi đóng vai trị rất
quan trọng trong vịng tuần hồn vật chất và năng lượng của hệ sinh thái
RNM, nhờ có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào như cellulase, protease,
kitinase, amylase, enzym phân giải dầu…..Đặc biệt, enzym cellulase do nấm
sợi sống trong RNM sinh ra là rất lớn. Do thảm thực vật dày đặc ở RNM Cần
Giờ là nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi dào nhất cho các chủng nấm
sợi có khả năng sinh enzym này.
Enzym cellulase là hệ enzym bao gồm các loại enzym: C1, Cx, βglucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành
glucose. Enzym cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp để chế biến thức
ăn chăn nuôi, trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong q
trình li trích các chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu giàu
cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ
lượng enzym công nghiệp được bán ra trên thế giới gồm các enzym cellulase,
hemicellulase và pectinase. Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp

trên thế giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD.


Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn
enzym cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm MT. Việt
Nam là nước nhiệt đới có nền nơng nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang
trên đà phát triển. Vì vậy, lượng phế thải nơng nghiệp rất dồi dào, cùng với sự
cơng nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ơ nhiễm MT đang trở thành nguy cơ
thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh hoạt công, nông, lâm
nghiệp là cellulose.
Trong khi đó, RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng VSV có hoạt
tính enzym cao chưa được khai thác. Các cơng trình khoa học nghiên cứu về
khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ cho
đến nay vẫn còn bỏ ngõ.
Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên gợi ý cho tôi chọn đề tài: “Nghiên
cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ
rừng ngập mặn Cần Giờ”.
2. Lịch sử vấn đề nghiên cứu
 Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase
Khả năng sinh enzym cellulase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi
Trichoderma và Aspergillus.
Ở Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học
Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất
cellulase đầu tiên. Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng
QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm, 1983) [74].
Năm 1998, YU đã nuôi cấy T. reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột
cellulose và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68].
Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym
như polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A. niger 3T5B8 trên
nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán

rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật [61].
Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A. niger
trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE
(chứa 0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng
phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton [67].
Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và
một số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở A. niger VS-1 trên MT lên men
bán rắn [40].
Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T. reesei sinh tổng hợp
enzym cellulase trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC [40].
Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với
nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22].
Năm 2003, Hồng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và
đặc điểm cellulase của A. niger Rnnl 363. Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu
thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng phương
pháp lên men bán rắn [24], [57].
Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym
cellulase từ T. reesei và A. niger trên MT lên men bán rắn [40].
Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng
pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc [27].
 Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM
Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu
về phân lập và phân loại nấm sợi trong hệ sinh thái RNM. Nhưng kết quả
nghiên cứu còn sơ sài, chưa đáp ứng được nhu cầu hiểu biết về sự đa dạng
của nấm sợi cũng như vai trò của chúng trong hệ sinh thái RNM [64].
Trước đây, người ta cho rằng điều kiện MT RNM quá khắc nghiệt,
khơng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi. Tuy nhiên, các

nghiên cứu gần đây cho thấy trong điều kiện sống đặc biệt như vậy, thì con
đường trao đổi chất của nấm sợi cũng khác hơn con đường trao đổi chất của
các VSV trên đất liền. Vì vậy, sẽ có những sản phẩm trao đổi chất có tính chất
đặc biệt hơn, khác lạ hơn trong đó có các enzym, chất kháng sinh mới …[18].
Nhưng đến nay cũng chưa có cơng trình đi sâu nghiên cứu về hoạt tính
sinh học của các chủng nấm sợi từ RNM.
Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thơng báo của Mai Thị
Hằng và cs về nấm sợi RNM. Năm 2002, tác giả này tiếp tục nghiên cứu sự
đa dạng, nghiên cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbua
hydro của nấm sợi từ RNM ở hai tỉnh Nam Định, Thái Bình. Riêng ở RNM
Cần Giờ chỉ có một số ít nghiên cứu về phân lập. Cho đến nay, vẫn chưa có
nghiên cứu nào về khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở
RNM Cần Giờ [19], [20], [21].
3. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym
cellulase từ RNM Cần Giờ.
Đề xuất hướng ứng dụng các chủng nấm sợi phân lập được.
4. Đối tượng nghiên cứu
- Hệ sinh thái RNM Cần Giờ.
- Nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase ở RNM Cần Giờ.
- Enzym cellulase sinh ra từ nấm sợi.
5. Phạm vi nghiên cứu
Do hạn chế về thời gian nên đề tài chỉ nghiên cứu phân lập các chủng
nấm sợi ở 6 xã của huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã An Thới Đơng, xã
Tam Thơn Hiệp, xã Long Hịa, xã Thạnh An, xã Lý Nhơn. Sau đó, chỉ nghiên
cứu một số chủng nấm sợi có khả năng sinh một loại enzym cellulase trong hệ
enzym này.

Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư
phạm Thành phố Hồ Chí Minh và PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới
Thành phố Hồ Chí Minh.
6. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ.
- Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase
cao.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa và phân loại các
chủng nấm sợi được tuyển chọn.
- Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển
và sinh tổng hợp enzym cellulase của các chủng được chọn.
- Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào
việc phân hủy các chất phế thải, góp phần hạn chế ơ nhiễm MT.
7. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ.
- Phương pháp vi sinh.
- Phương pháp hóa sinh.
- Phương pháp thực nghiệm.
- Phương pháp thống kê toán học.
8. Dự kiến cấu trúc
Luận văn gồm phần mở đầu, 3 chương và phần kết luận kiến nghị được
trình bày như sau:
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và bàn luận
Kết luận và kiến nghị.


Chương 1:

TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm tự nhiên RNM Cần Giờ
RNM chiếm một phần đáng kể trong các kiểu rừng ngập nước, thường
tồn tại ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trên thế giới hiện nay còn khoảng
15 triệu ha RNM phân bố ở các vùng bờ biển có bùn, các cửa sông lớn, các
vịnh cạn và các đầm mặn giáp với biển.
RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, là “lá phổi xanh”
của thành phố. Có tác dụng giảm tốc độ gió, ngăn bão vào đất liền, hạn chế
xói lở bảo vệ bờ biển, bờ sơng, điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi và
tạo MT phát triển ngành thủy sản. Bên cạnh đó, RNM Cần Giờ còn là nơi
cung cấp thức ăn, là nơi cư trú, sinh sản của các loài thủy sinh vật và động vật
có xương sống ở cạn. Hiện nay, Cần Giờ còn là địa điểm du lịch hấp dẫn với
3.000 - 5.000 du khách đến tham quan mỗi tuần [83].
RNM Cần Giờ hiện nay có diện tích khoảng 29,380 ha chiếm 41,18 %
đất huyện Cần Giờ [87]. Khí hậu nóng ẩm và chịu chi phối của quy luật gió
mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11
đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm.
Nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ nhiệt dao động trong ngày từ 5-70C.
Chế độ bán nhật triều không đều. Độ mặn dao động 18 ‰ – 30 ‰ [1].
Một nghiên cứu mới đây cho biết RNM Cần Giờ đã có 157 loài thực
vật; 63 loài phiêu sinh vật; 130 loài Tảo thuộc 3 ngành: Tảo khuê, Tảo giáp,
Tảo lam; 100 lồi động vật đáy khơng xương sống như tơm, cua, sị ốc. Ngồi
ra, cịn có 120 lồi cá, trong đó có các lồi có giá trị kinh tế cao như cá Ngát,
cá Dứa, cá Chẽm; 31 lồi bị sát như cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 loài hữu
nhũ như khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng và 145 loài chim [83]. Đây là các
nguồn thức ăn tốt nhất cho hệ nấm sợi sống trong RNM. Nấm sợi có khả năng


tiết ra hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có trong lá cây, thân

cây ở RNM thành glucose để sử dụng. Ngồi ra, nấm sợi cịn có thể sinh các
loại enzym khác như protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tơm, cua,
ốc, xác chết các lồi động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng có thể
hấp thu [1].

Hình 1.1. Bản đồ RNM Cần Giờ [83]
Vậy, hệ nấm sợi là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một
nhân tố khơng thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật chất ở RNM Cần Giờ.
Chúng sử dụng chất hữu cơ từ thảm thực vật và hệ động vật phong phú làm
thức ăn, đồng thời có tác dụng làm giảm ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ.
1.2. Nấm sợi tổng hợp enzym cellulase
Rất ít VSV có khả năng sinh tất cả các loại enzym cần thiết để phân
giải cellulose ở dạng tinh thể. Chúng phải tiết ra hệ enzym phức tạp, có khả
năng phân hủy cellulose theo phương thức khác nhau như thủy phân, oxy hoá
[51], [52].
Cellulose bị phân rã dưới tác dụng của vi khuẩn háo khí và kỵ khí.
Song khả năng phân hủy cellulose khơng bằng nấm, do vi khuẩn thường tạo
ra enzym cellulase với hàm lượng nhỏ thấp hơn 0,1g/l [51]. Cellulase được
sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn trong dạ cỏ Ruminococcus albus (Berger


1963), vi khuẩn hiếu khí Cellulomonas sp (Elberson, 2000), vi khuẩn kỵ khí
Clostridium sp (Parsiegla, 1998) [39], các lồi xạ khuẩn Streptomyces,
Thermomonospora …[51].
Nấm sợi là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy
cellulose. Các enzym cellulase sản sinh từ nấm sợi được tạo ra với nồng độ
rất cao, khơng có các dạng vật lý phức tạp như cellulase bắt nguồn từ vi
khuẩn và có tác dụng phân hủy rất mạnh cellulose. Các chi nấm có khả năng
sinh cellulase phổ biến là: Aspergillus, Alternaria tenuis, Celluvirio gilvus,
Clasdosporium, Penicillium, Fusarium, Myrotheticum, Trichoderma … [39].

1.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm sợi
Nấm sợi là VSV có nhân chuẩn. Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ
kitin-glucan, kitozan. Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha)
không vách ngang hoặc có vách ngang (septum). Các sợi nấm vừa phát triển
theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm
(mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể (hình 1.2). Hệ sợi nấm phát triển
thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 1.3).
KL nấm sợi thường có dạng hình trịn, hoặc gần trịn. Bề mặt KL có thể mượt,
nhẳn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khía
xun tâm, hoặc lồi lõm khơng đều. Mép KL trơn, răng cưa….

Hình 1.2. Bào tử mọc ra khuẩn ty [78]

Hình 1.3. KL nấm [78]

Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh
trên bề mặt sợi nấm.


Các đặc điểm hình thái khác như có bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm,
giọt tiết, sắc tố hịa tan…, làm KL nấm sợi có tính đặc trưng lồi [78].
Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp phụ qua màng, khơng có cơ
quan tiêu hóa, khơng có khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh,
một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật [18].
Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo
kiểu vơ tính hoặc hữu tính.
Bào tử vơ tính. Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín. Bào
tử trần là dạng bào tử phổ biến nhất.

Hình 1.4. Các dạng bào tử trần của nấm sợi [78]

Sinh sản hữu tính. Nấm sợi có các hình thức sinh sản hữu tính như:
đẳng giao, dị giao, và tiếp hợp.

Hình 1.5. Sự tiếp hợp của nấm sợi [78]
Ngoài ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản hữu tính bằng bào tử túi
(ascospores) và bào tử đảm (basidiospores).
1.2.2. Đặc điểm phân loại của nấm sợi
Trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới
định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài. Trung Quốc đã điều tra được
40.000 loài. Phân loại vi nấm vẫn đang ở thời kỳ phân loại học hình thái
(Phenetic classifications) dựa vào đặc điểm hình thái, ni cấy, một số đặc


điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản. Trong những năm gần đây,
tiến bộ của sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một
diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm.
Hiện nay, tồn tại các hệ thống phân loại nấm không thống nhất với
nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973),
V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos & Mins (1996),
Robert A. samson (1989), Saccardo P.A (1880-1886), Barron G.L (1968),
Ellis M.B (1971), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984) …[78].
Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa
phân loại: Saccardo P.A (cải tiến), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Đặng Hồng
Miên, Nguyễn Đức Lượng (2003), Nguyễn Lân Dũng (2006) để phân loại [8],
[9], [10], [12] [14], [27], [74].
1.2.3. Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi
Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả
năng sinh các chất có hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh
tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất có
khả năng phân giải nguồn cacbonhydro được ứng dụng trong xử lý ô nhiễm

MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất ….[5], [6], [40], [43].
 Hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào
Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học
trong và ngoài cơ thể [29]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng
3.500 loại enzym, trong đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV. Nấm sợi
có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym ngoại bào mạnh, phân giải và
chuyển hoá các hợp chất hữu cơ, vơ cơ khó tan trong tự nhiên. Một số enzym
đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: cellulase,
protease, amylase, pectinase và kitinase [6].
 Enzym cellulase. Xúc tác phân giải các hợp chất ligno - cellulose


thành glucose. Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực
vật gồm cellulose (30-40%), hemi-cellulose và lignin (15-30%). Các chủng
nấm sợi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus….có khả năng sinh enzym
cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất
thải hữu cơ chứa cellulose…[19], [20], [21].
 Enzym protease. Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên
kết nhau bằng liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuỗi polypeptid
ngắn. Nấm sợi có khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi
Aspergillus, Penicillium,… Được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp bột
giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da,
công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải…[5], [6], [29].
 Enzym amylase. Xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ
chủ yếu của thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase
(α-amylase, β-amylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4glucoside và α-1,6-glucoside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối
cùng là glucose. Nấm sợi có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là
những tác nhân không thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium,
Trichoderma, Rhizopus, Mucor….. Được ứng dụng trong sản xuất sirô, sản
xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia

súc, trong công nghiệp dệt…[29], [30].
 Enzym kitinase. Kitin là các biopolyme chứa các gốc N-acetylglucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM,
lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua, ốc…rất nhiều. Nấm sợi Trichoderma,
Glycladium, Chaetomium,… sinh enzym kitanase phân giải kitin, đồng thời
tăng cường hiệu quả tiêu diệt các lồi nấm gây bệnh có thành tế bào là kitin,
chống các lồi cơn trùng có vỏ kitin.
Như vậy, nấm sợi cịn có vai trị làm tác nhân kiểm soát sinh học chống


các VSV gây bệnh và cơn trùng có hại trong nông-lâm- ngư nghiệp [18], [19].
Các chủng nấm sợi Acremonium, Aspergillus, Penicillium cịn có khả
năng sinh enzym phân giải dầu mỏ và khí đốt là hợp chất có cấu tạo phức tạp
và khó phân giải, góp phần xử lý ơ nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu.
Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ lượng dầu tràn vào từ biển gây ô nhiễm và độc
hại đối với sinh vật sinh sống ở RNM Cần Giờ, các lồi nấm sợi có khả năng
phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn thức ăn và bảo vệ MT ở đó.

Hình 1.6. Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch [78]
 Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi
Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện
tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm
hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác.
Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ nấm sợi chiếm tỉ lệ khá lớn. Chất
kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C,
Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh
viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu thuật
chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương. Những vấn đề về chất kháng sinh
được sinh ra từ VSV đang là vấn đề quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ
trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [10].
 Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng

Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều. Các axit hữu
cơ như axit axetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng
nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong


y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất axit xitric bằng nấm
sợi A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì [17]. Ngồi ra, các nhà khoa học
Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng
nấm sợi F. monoforme và F. oxysporum [29].
Tuy nhiên, có rất nhiều lồi nấm sợi mọc trên các nguyên vật liệu, đồ
dùng, thực phẩm, phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng. Một số nấm
sợi tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc
tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số gây bệnh cho người và động vật như
hen suyễn, bạch huyết, nấm tay chân…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng
lùn, thối cổ bông ở lúa…[29].
1.3. Enzym cellulase từ nấm sợi
Ngày nay, nguồn enzym từ VSV như amylase, cellulase, protease,
kitinase…được chú ý nhiều nhất do có những ưu điểm: Có hoạt tính cao; khối
lượng enzym thu được nhiều do tốc độ sinh sản của VSV nhanh; nguyên liệu
rẻ tiền; có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp …[29].
1.3.1. Khái quát về enzym
 Cấu trúc
Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào
các phản ứng sinh học [30].
Enzym có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo
từ L-axit amin liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia
phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzym.
Enzym gồm 2 nhóm: Nhóm enzym một cấu tử gồm những enzym có
thành phần hóa học duy nhất là protein và nhóm enzym hai cấu tử gồm những
enzym có hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzym có vai trị xúc

tác, phần thứ hai là coenzym gồm những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trị thúc
đẩy q trình xúc tác. Ngồi ra, có một số kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn,


…đóng vai trị liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết giữa apoenzym và
coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử [30].
 Cơ chế hoạt động
Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt
động. Trung tâm hoạt động của enzym (E) có cấu trúc khơng gian tương ứng
với cơ chất (S) mà chúng tham gia. Phản ứng khơng có sẳn mà được hình
thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khóa vào ổ
khóa tạo thành enzym - cơ chất (E-S).
Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết
yếu tạo thành phức enzym - cơ chất (E-S).
Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu
hình khơng gian và mức độ bền vững các liên kết. Các liên kết bị phá vỡ và
tạo ra sản phẩm. Phức enzym cơ chất (E-S) sẽ được tách ra.
Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản
phẩm và tách khỏi enzym.
Phản ứng tổng quát:
E

+

S



E-S



E

+

P

E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products)
1.3.2. Cellulose và enzym cellulase
1.3.2.1. Cellulose
Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima,
2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm.
Hàng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành
nhờ quá trình quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được
tích lũy trong đất. Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết
đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi,


giấy vụn, mùn cưa…[5], [6]. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực
vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông
và 40-50% trong gỗ [52].
Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là
cellobiose có cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết
β-D-1,4-glucoside. Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành
những bó nhỏ gọi là các micrơfibrin có cấu trúc khơng đồng nhất. Có những
phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần vô định hình.

Hình 1.7. Cấu trúc đơn vị cellulose [84]

Hình 1.8. Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose [84]

Hình 1.9. Cấu tạo của phân tử cellulose trong khơng gian [84]


1.3.2.2. Enzym cellulase
 Cấu trúc
Trong thiên nhiên không gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nó thường tồn
tại ở dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase,
pentozanase thành hệ enzym gọi là Citolase [39]. Cellulase là một phức hệ
enzym bao gồm các enzym C1, Cx và β-glucosidase tham gia những phản
ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành glucose [29].

Hình 1.10. Cấu trúc enzym cellulase trong khơng gian [86]
 Enzym C1: Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự
nhiên thành cellulose phản ứng (cellulose vơ định hình).
 Enzym Cx: Cịn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thủy phân cellulose
phản ứng thành cellobiose. Enzym này được chia thành hai loại:

-

- Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Có tác
dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử
cellulose. Được chia làm hai loại EGI, EGII. Cả hai loại enzym này có thể
hoạt động ở nhiệt độ khá cao.

Hình 1.11. Cấu trúc tinh thể của endoglucanase [81]

- Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải
chuỗi trên thành disaccarit gọi là cellobiose từ đầu không khử. Bao gồm hai
loại CBHI và CBHII:
* CBHI có trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit
amin. Enzym này tác động lên cellulose vơ định hình, ưu tiên liên kết với
vùng tinh thể của cellulose, không tác động lên cellulose biến tính như CMC.
* CBHII có trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin.
CBHII liên kết với cả vùng tinh thể và vùng vơ định hình, khơng tác động lên
cellulose biến tính [52].

Hình 1.12 . Cấu trúc CBH [80]

Hình 1.13. Vị trí cắt exoglucanase [80]

 β-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): Thủy phân cellobiose
thành glucose. Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất
rộng từ 4,4 đến 8,4. Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt
độ cao.
 Cơ chế hoạt động

C1
Cellulose

Cx
Cellulose
phản ứng

Cellobiose

β-Glucosidase

Glucose

Hình 1.14. Cơ chế tác động của enzym cellulase [39]
Theo Mandels và Reese (1964), đầu tiên, enzym C1 phá vỡ liên kết
hydrogen trong phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng.


Sau đó Cx tiếp tục thủy phân cellulose phản ứng thành các phân tử
cellobiose. Cuối cùng, β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.
 Điều hòa sinh tổng hợp enzym cellulase
Khả năng sinh tổng hợp cellulase trong các loài nấm sợi được điều hòa
ở mức độ phiên mã, mức độ mRNA mã hóa cho CBHI ln cao nhất (Pettila,
1993). Tỷ lệ enzym CBHI cao nhất chiếm khoảng 50% trong hổn hợp
cellulase được tiết ra bởi T. reesei (theo Gritzali và Brown, 1979), mức độ mã
hóa các thành phần khác của enzym cellulase ln ở trạng thái ổn định [40]
Q trình sản sinh enzym cellulase được kiểm soát theo cơ chế cảm
ứng và ức chế bởi glucose. Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng
trên MT có chứa cellulose, dẫn xuất của cellulose, lactose. Cịn trên MT có
chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase khơng tạo thành enzym
cellulase (Biaria và Mishra, 1989).
Hơn nữa, hoạt tính cellulase cịn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất
ức chế trong MT nuôi cấy. Nhiều hợp chất phenol đã được chứng minh là có
tác dụng kìm hãm sự phát sinh cellulase ở S. commune [52].
Khi ni cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hóa cellulase. Chẳng
hạn, hai loại proteaza axit được tạo ra trong điều kiện phân hủy cellulose có
khả năng làm tăng 10 lần hoạt tính endoglucanase của P. chrysosporium [52].
Q trình tổng hợp enzym cellulase cảm ứng còn chịu tác động của
AMP vịng (AMPv). Chất này có tác dụng kích thích q trình sao chép mã
của các operon phân giải nhờ một loại protein đặc biệt làm trung gian gọi là
protein nhận AMPv (CAP). Khi AMPv kết hợp với CAP tạo thành phức hợp

có tác dụng hoạt hóa gen operator làm cho RNA-polymerase dễ dàng kết hợp
với chúng để bắt đầu sao chép mã [30].
Nấm sợi chịu tác động trực tiếp của các yếu tố bên ngoài rất mạnh và
phản ứng lại với tác động đó rất nhanh. Vì thế, có thể sử dụng pH, nhiệt độ và


đặc biệt là cơ chất mà chúng tham gia phân hủy để điều khiển tổng hợp
enzym. Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp
enzym cảm ứng sẽ tăng dần. Nếu cứ tiếp tục tăng liều lượng cơ chất thì sẽ đến
một mức nào đó q trình này sẽ chựng lại và giảm do tăng áp suất thẩm thấu
bởi cơ chất [30].
1.3.3. Các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành
enzym cellulase của nấm sợi trên MT lên men bán rắn
1.3.3.1. Thành phần MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase
 Nguồn dinh dưỡng cacbon
Trong MT nuôi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase nhất thiết phải có
cellulose là chất cảm ứng và nguồn cacbon. Nấm sợi có khả năng đồng hóa
rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất,
trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba
chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và
Entner Doudoroff. Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase
thường là giấy lọc, bông, bột cellulose, cám, lõi ngô, mùn cưa, bã mía, trấu,
rơm, than bùn, CMC, ….Các chủng Trichoderma ni trên MT có nguồn
cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất [38].
Ngày nay, bã mía được dùng như một cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh
enzym cellulase. Trên thế giới, lượng bã mía thải ra rất lớn khoảng 150 triệu
tấn/năm. Ở Việt Nam, bã mía phần lớn dùng để đốt lị hơi, làm phân bón hữu
cơ, bột giấy, trồng nấm ăn….Tuy nhiên, không sử dụng hết và đã gây ơ nhiễm
MT xung quanh. Bã mía có hàm lượng cellulose rất cao 46% (theo
A.G.Keller, 1964), ngồi ra cịn chứa hemicellulose, lipid và sáp, chất

khoáng, lignin, silic nên là một cơ chất cảm ứng tuyệt vời cho nấm sợi sinh
enzym. Ngồi ra, cám mì thường được sử dụng với tỉ lệ (6 : 4) do nó có chứa
đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp


enzym của nấm sợi, có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết
dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng dinh dưỡng cần thiết.
 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Các nguồn nitơ thích hợp nhất đối với các sinh vật sinh cellulase là
muối nitrat. Natri nirat làm cho MT kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự
tạo thành cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh
tổng hợp cellulase tùy vào đặc tính sinh lý của từng chủng. Cao nấm men có
tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase, cao ngơ có khả năng sinh tổng hợp
exoglucanase và endoglucanase mạnh hơn nấm men. Nước chiết nấm men
chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase, cịn cao ngơ kích thích CHBI
và CBHII. Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt của các
axit amin, các ngun tố khống và những nhân tố kích thích sinh trưởng
[38], [39], [40].
 Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… có vai trị quan trọng như
tham gia vào q trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm
sợi, tham gia vào thành phần cấu tạo prôtêin, enzym, điều hịa pH MT ni
cấy nên ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp cellulase. Nồng độ tối thích của Zn
là 0,11- 2,2 mg/l, Fe 2 - 10 mg/l, Mn 3,4 - 27,2 mg/l. Biotin và Tiamin khơng
có ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzym này [38].
1.3.3.2. Yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym cellulase
Ảnh hưởng của độ ẩm
Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất
rắn. Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30- 80%
(Moo-Young, 1983). Trong q trình ni cấy nấm sợi thu enzym cellulase

độ ẩm có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzym và hoạt tính của enzym.
Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy nấm sợi là 50-60%, nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo


điều kiện cho vi khuẩn phát triển, nếu độ ẩm <60% gây hiện tượng tạo nhiều
bào tử ở nấm sợi, hoạt tính của enzym sẽ giảm. Kim (1985) cho biết tốc độ
sinh trưởng tối ưu của T. reesei ở độ ẩm 60%, nhưng khả năng sinh tổng hợp
cellulase ở độ ẩm thấp hơn xấp xỉ 50% [38], [40].
Ảnh hưởng của pH
Sự sinh trưởng của nấm sợi sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ
chất. Cơ chất bị oxy hóa khơng hồn tồn sẽ sinh ra acid, hoặc hấp thụ ion
amonium sẽ làm giảm pH. Ngược lại, sự giải phóng ammonia qua sự loại
nhóm amin của urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH. pH tối ưu cho các
loài nấm sợi khác nhau được sử dụng trong lên men bán rắn có giá trị từ thấp
nhất là 3 đến cao nhất là 8 (Prior, 1992) tùy vào từng chủng nấm sợi khác
nhau. Nấm sợi Aspergillus, Penicillium và Rhizopus có thể giảm pH của MT
xuống dưới 3, Đối với các chủng nấm Trichoderma, Sporotrichum, Pleurotus,
pH ổn định hơn ở khoảng 4 và 5 [40].
Trong suốt q trình ni cấy nấm sợi ta có thể điều chỉnh pH của MT
bằng axit HCl, H2SO4, NaOH, KOH. Durand (1988) đã điều chỉnh pH trong
nuôi cấy T. viride ở qui mô pilot trên MT hạt cà phê-đường bằng cách phun
dung dịch urea, do hoạt động của urease của nấm sợi làm tăng pH qua việc
tạo ammonia [29].
Ngoài ra, việc điều chỉnh pH thích hợp trong q trình ni cấy nấm
sợi hạn chế sự tạp nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [73].
 Ảnh hưởng nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh
enzym cellulase. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ
280C-320C, tối đa dưới 500C [40], [73]. Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp
có thể kìm hãm sự sinh trưởng thậm chí có thể giết chết sợi nấm, quá trình

tổng hợp enzym sẽ bị ức chế. Theo Raimbaut & Alazard (1989) cho biết nhiệt


độ tối ưu cho sự sinh trưởng của A. niger trên MT bột khoai mì là 35- 400C,
ngược lại ở 450C, sự nảy mầm của sợi nấm bị ức chế, khả năng sinh enzym
giảm [40].
 Ảnh hưởng của MT khí
MT khơng khí quan trọng nhất là khoảng khơng gian giữa các tiểu phần
cơ chất, vì đây là nơi mà sinh khối nấm sợi sinh trưởng. Oxygen phải khuếch
tán từ khoảng không giữa các hạt cơ chất vào sinh khối, và CO2 phải khuếch
tán từ sinh khối vào khoảng không giữa các hạt cơ chất. Trong nuôi cấy người
ta thường thiết kế dụng cụ nuôi cấy sao cho sự lưu thông khơng khí dễ dàng
và cao nhất. Ni trên khay thì phía dưới đáy các khay có đục lỗ để khơng khí
dễ lưu thơng, ni trong hộp thì thiết kế xung quanh hộp có đục lỗ vừa nhỏ
sao cho MT khơng bị thốt ra ngồi, đồng thời có tác dụng thơng khí, nấm sợi
sẽ phát triển đều ở tất cả các mặt có tiếp xúc với khơng khí….
Trong ni cấy nấm sợi sinh enzym cellulase, để tạo khả năng thống
khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20- 25% sẽ làm
tăng độ xốp của MT, tạo nên những khoảng trống để khơng khí có thể lưu
thơng trong lòng MT, đồng thời trấu còn là cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp
của enzym cellulase [38].
 Ảnh hưởng của cơ chất và các chất kìm hãm
Ở giai đoạn đầu, khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng,
nhưng khi tốc độ phản ứng đạt cực đại, dù ta có tăng nồng độ cơ chất, tốc độ
phản ứng cũng sẽ hồn tồn khơng có khả năng tăng theo [39]. Nguồn cacbon
và nitrogen ảnh hưởng mạnh đến tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzym. Do
đó, nếu cơ chất không chứa đủ các thành phần dinh dưỡng thì phải bổ sung
thêm kịp thời.
Các chất kìm hãm là những chất hóa học có thể làm giảm hoặc mất
hoạt tính enzym, thường là những ion, các phân tử vơ cơ, hữu cơ… Các chất