NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20 L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Trần Thu Trang

NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ
ALKALOID CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY
BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ
THỐNG BIOREACTOR 20 LÍT

Chun ngành: Hố sinh học
Mã số: 9 42 01 16

TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội-2020

1


Cơng trình được hồn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Chu Nhật Huy
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Phạm Bích Ngọc

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp
tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201….

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam

2


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) là cây thuốc phổ biến ở
nước ta, phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung, Kon tum, Đồng Nai, Phú
Quốc và Vườn quốc gia Bái Tử Long. Cây Bá bệnh được dùng bồi bổ sức
khoẻ, tăng lượng testosterone ở nam giới, có hoạt tính kháng viêm mạnh,
chống ung thư tốt và một số tác dụng khác như chữa sốt rét, chống lỗng
xương, trị tiểu đường...Các cơng trình nghiên cứu về cây Bá bệnh cho thấy
cây có chứa nhiều hoạt chất alkaloid có giá trị trong kháng sốt rét, chống
viêm, gây độc tế bào ung thư và tăng cường sinh lực… Hiện nay, cây Bá
bệnh đang bị khai thác quá mức ngoài tự nhiên do nhu cầu sử dụng thảo dược
ngày càng tăng. Hơn nữa, Bá bệnh khó nuôi trồng và nhân rộng, với thời gian
thu hoạch được rễ có chất lượng phải cần ít nhất 5-6 năm dẫn tới nguồn
nguyên liệu cung cấp cho sản xuất dược phẩm cịn gặp nhiều khó khăn. Đến
nay, ni cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu

nhận ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn từ 3040 ngày làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu. Công nghệ nuôi cấy
mô sẹo hay nuôi cấy huyền phù tế bào cần phải bổ sung chất điều hoà sinh
trưởng (CĐHST). Tuy nhiên, sự tồn dư CĐHST ảnh hưởng trực tiếp đến sức
khoẻ người sử dụng. Vấn đề này có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối
rễ tơ do rễ tơ có thể sinh trưởng và phát triển liên tục khơng cần bổ sung
CĐHST. Hơn thế, rễ tơ có nhiều ưu điểm khác như có thể sản xuất một lượng
lớn các hợp chất thứ cấp và có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền
phù và mô sẹo.
Trong ni cấy in vitro, việc gây kích kháng hay bổ sung các elicitor
giúp tăng đáng kể khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong quá trình
nhân nhanh sinh khối rễ. Nuôi cấy rễ tơ Bá bệnh in vitro, dù môi trường giàu
dinh dưỡng giúp rễ phát triển nhanh, nhưng hàm lượng alkaloid phân tích
được rất thấp. Hơn nữa, q trình tích lũy một số chất khơng diễn ra do thiếu
một số yếu tố kích kháng, dẫn đến hàm lượng alkaloid nội sinh thấp hơn so

3


với rễ thu ngoài tự nhiên. Kể từ khi các stress do sự thay đổi về ánh sáng,
nhiệt độ hay tác động từ các tác nhân gây hại cây trồng được phát hiện làm
kích thích tích lũy các hợp chất thứ cấp thơng qua con đường truyền tín hiệu
của các elicitor như jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), yeast extract
(YE)… lần lượt kích hoạt biểu hiện các gen phịng vệ, đồng thời sinh tổng
hợp các hợp chất thứ cấp. Các elicitor đã được ứng dụng rộng rãi vào nuôi
cấy để gia tăng hoạt chất saponin trong ni cấy nhiều lồi cây dược liệu
quý. Việc nghiên cứu bổ sung các elicitor trong việc tăng cường khả năng
tích lũy các hợp chất thứ cấp trong ni cấy in vitro vẫn chưa có.
Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong
nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống ni cấy trên mơi
trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị

trường, giá thành lại cao; do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy
hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dể bị nhiễm. Chính vì
vậy cần phải có một hệ thống ni cấy mới làm sao có thể tự động hóa giúp
giảm thiểu nhân công, thời gian và số lượng cây nhiều. Trong nuôi cấy lỏng
người ta chia ra ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy
bioreactor, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh cơ
quan. Hiện nay đang có xu hướng dùng bioreactor để nhân sinh khối rễ tơ
nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp.
Xuất phát từ các cơ sở khoa học và luận cứ trên, tôi tiến hành thực
hiện đề tài nhằm tìm kiếm những alkaloid có hoạt tính sinh học đồng thời
nghiên cứu những hoạt tính mới từ những alkaloid từ đó nghiên cứu ni cấy
tăng tích luỹ hàm lượng các alkaloid bằng cách bổ sung các elicitor. Sau đó,
rễ tơ được nghiên cứu nhân sinh khối lớn phục vụ định hướng làm dược liệu
bằng cách tối ưu hố hệ thống bioreactor 20 lít "Nghiên cứu tăng cường tích
luỹ một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh
(Eurycoma longifolia Jack) ni cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít”.

4


Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát hoạt tính sinh học của các alkaloid phân lập từ rễ tơ cây Bá
bệnh để tìm ra những hoạt tính mới.
Xác định điều kiện ni cấy tối ưu để rễ tơ cây Bá bệnh sinh trưởng và
phát triển.
Xác định nồng độ của ba elicitor (Salicylic acid, Jasmonic acid và Yeat
extract) lên quá trình sản xuất và tích luỹ các alkaloid phân lập được từ rễ tơ
cây Bá bệnh in vitro.
Xây dựng được hệ thống bioreactor 20 lít để nhân sinh khối rễ tơ.
Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cao
chiết alkaloid trong sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh
Nội dung 2: Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng
rễ tơ và tích luỹ các alkaloid (1) 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1propenoic

acid)

(7-MCPA),

(2)

9-methoxycanthin-one,

(3)

9-

hydroxycanthin-6-one trong rễ tơ cây Bá bệnh.
Nội dung 3: Xây dựng kỹ thuật nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá
bệnh trên hệ thống bioreactor 20 lít. Đánh giá hàm lượng của các alkaloid
(1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one có
trong sinh khối thu được nuôi cấy ở hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ
tự nhiên.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu chung về cây Bá bệnh
Bá bệnh, còn gọi là mật nhân, bách bệnh, mật nhơn, bá bịnh có tên khoa
học là Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Simaroubaceae.
Về đặc điểm hình thái thực vật, Bá bệnh là loại cây gỗ nhỏ, thân nhỏ,
cao 2-8 m ít phân cành, lúc nhỏ ít khi có nhánh, vỏ và rễ rất đắng. Lá dài, gồm
hơn 10 cặp lá chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống lá rất ngắn, gốc lá thuôn, đầu

nhọn, mặt trên bóng, mặt dưới có lơng màu xám. Tồn cây (trừ quả chín)
có vị đắng .

5


1.2. Ứng dụng của cây Bá bệnh trong Y học cổ truyền
Bá bệnh được dùng nhiều trong y học cổ truyền để chữa bệnh đau
lưng, khó tiêu, thuốc bổ sau khi sinh đẻ, sử dụng để điều trị sốt, vàng da, suy
mòn và cổ chướng. Bá bệnh là một trong những thuốc dân gian phổ biến cho
các tác dụng kích thích tình dục và điều trị sốt rét. Nước lá nấu được sử dụng
trị ngứa ngoài da, trong khi quả được sử dụng chữa kiết lỵ, vỏ được sử dụng
như một loại thuốc tẩy giun. Rễ được sử dụng để chữa rối loạn chức năng tình
dục, lão hóa…
1.3. Ni cấy sinh khối rễ tơ
1.3.1. Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối rễ tơ
Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các rễ nhỏ có lơng được sản sinh ra
mạnh mẽ tại vị trí bị nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong
nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống ni cấy trên mơi
trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị
trường, giá thành lại cao. Năm 1981, Takayama và Misawa đã đề xuất một
hệ thống ni cấy lỏng có hệ thống sục khí chủ động từ bên ngồi vào với
tên gọi Bioreactor. Hệ thống bioreactor là thường được dùng nhiều, chủ yếu
để nuôi cấy huyền phù tế bào và sản xuất hoạt chất thứ cấp trên nhiều đối
tượng nghiên cứu khác nhau và hiện nay đang có xu hướng dùng bioreactor
để nuôi cấy rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp.
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp HCTC trong nuôi
cấy rễ tơ
Sự lựa chọn dịng, hình thái của rễ tơ sau khi đã chuyển gen, sự

tương tác giữa thực vật và vi sinh vật, giai đoạn phát triển của rễ tơ trong
q trình ni cấy, các yếu tố khác…
1.3.3.Ảnh hưởng của elicitor đến tích luỹ các HCTC trong q trình ni
cấy rễ tơ

6


Elicitor là các hợp chất kích thích mọi dạng tự vệ của thực vật. Định
nghĩa rộng về các elicitor bao gồm các chất của yếu tố gây bệnh (ngoại sinh)
hoặc được giải phóng bởi chính thực vật do phản ứng với yếu tố gây bệnh
(nội sinh). Các elicitor có thể gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ dẫn đến
gen được biểu hiện và kích thích tích luỹ các HCTC trong điều kiện không
gây ảnh hưởng đối với thực vật hay trong ni cấy tế bào.
1.3.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về ni cấy sinh khối rễ
tơ thu nhận các HCTC
Ở trên thế giới đã có một số tác giả nghiên cứu về rễ tơ của một số
lồi khác nhau, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về rễ tơ của loài Bá bệnh.
Các nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Bá bệnh mới chỉ dừng lại ở phân
tích thành phần hóa học và các tác dụng dược lý, những nghiên cứu về rễ tơ
của một số lồi cũng cịn rất hạn chế. Việc nghiên cứu thu nhận sinh khối rễ
tơ của các loài cây dược liệu và thu nhận HCTC hiện nay không chỉ dừng ở
quy mơ phịng thí nghiệm mà đã được cơng nghiệp hố bằng ni cấy
bioreactor.
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Chúng tôi sử dụng sinh khối khô rễ tơ cây Bá bệnh (90 g) và rễ tơ
cây Bá bệnh được nuôi cấy trên môi trường thạch do Phịng Cơng nghệ tế
bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Rễ tự nhiên cây Bá bệnh được thu thập tại vườn Quốc gia Bái Tử

Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng
Ninh
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hoá học các chất từ cao
chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp
các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng

7


hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC,
HMBC, 1H-1H-COSY).
Phân lập các chất từ cao chiết alkaloid
Alkaloid (651mg)
SKC SiO2, Grad
CH2Cl2 /MeOH (25:1)

F1

F3

F2
SKC SiO2, Grad
MeOH/H20 (3:1)

F2.2-F2.4

F2.1

Rửa kết tinh bằng
n-hexane

F4

F5-F11

F12

Rửa kết tinh bằng
CH2Cl2

Chất 3
15 mg
9-hydroxycanthin-6-one

Chất 2
96 mg

SKC SiO2, Grad
CH2Cl2 /MeOH (20:1)

Chất 1
29,6 mg
Chất mới
7-methoxy-(9H-β-carbolin-1yl)-(E)-3-propenoic acid

9-methoxycanthin-6-one

2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro

2.1.2.1 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của A Monks (1991).
Phép thử này xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ
quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào
được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB).
2.1.2.2 Thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên tế bào đại
thực bào RAW264.7, chuột và THP-1 kích thích bởi LPS
Dịng tế bào được ni trong đĩa 48 giếng, chứa 5x105 tế bào/ml.
Lấy 1 ml tế bào thêm vào 1 µl mẫu thử sao cho nồng độ cuối cùng của chất
thử là (1, 3, 10, 30 µM). Ủ hỗn hợp ở 37o C, 5% CO2 trong 30 phút trước khi
được kích thích với 1 µg/mL LPS (Sigma, Tokyo, Japan). Dịch nổi được thu
sau 24 giờ. Nồng độ cytokine IL-6 và TNF-α của tế bào đại thực bào chuột,
RAW264.7, THP-1 được xác định bằng ELISA (Quantikine ELISA của
R&D) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Số liệu được biểu diễn dưới dạng
giá trị trung bình của ít nhất 3 lần lặp lại. Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ
vào phần mềm máy tính ImageJ 1.50i

8


2.2.3 Thực nghiệm và phương pháp định lượng các alkaloid thơng qua
phương pháp HPLC-DAD.
Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh: kí hiệu ĐK-Bb
Cột sắc ký Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm)
Detector DAD, bước sóng phát hiện 272 nm.
Nhiệt độ cột 25oC
Tốc độ dòng 0,5 ml/ph
Nồng độ mẫu 10 mg/ml
Thể tích tiêm mẫu 10 µl
Pha động ACN-H2O, chương trình gradient dung mơi:

Thời gian (phút)

0

10

35

45

60

ACN (% thể tích)

10

20

50

90

90

Định lượng các chất sạch (1), (2), (3) bằng cách so sánh diện tích pic của
mẫu thử với giá trị diện tích pic trên đường chuẩn => Định lượng các chất
sạch (1), (2), (3) bằng cách so sánh diện tích pic của mẫu thử với giá trị diện
tích pic trên đường chuẩn.
2.2.4. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến q trình tăng trưởng và tích
luỹ các alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh trên bình tam giác 500 ml

Một số yếu tố như trạng thái môi trường, ánh sáng, chiều dài mẫu
ban đầu, khối lượng rễ cấy chuyển, các elicitor jasmonic acid (JA), salicylic
acid (SA), yeast extract (YE) được đánh giá ảnh hưởng đến sinh trưởng và
tích luỹ hợp chất (1), (2), (3) trong nuôi cấy rễ tơ.
2.2.5. Xây dựng quy trình ni cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh
trên hệ thống Bioreactor 20 lít
Dựa trên hệ thống bioreactor lên men vi sinh vật có sẵn thiết kế một
số mẫu bioreactor sử dụng được cho các thí nghiệm ni cấy sinh khối với
các dung tích 5 – 20 lit. Dựa vào tài liệu tham khảo, tôi lựa chọn mơ hình
bioreactor dạng sủi bọt dạng cầu để nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh.

9


Ống tiếp mơi trường

Ống thốt khí

Ống dẫn khí

Màng lọc khí

ống nối

Đầu sục khí

Hình 2.5. Mơ phỏng các bộ phận của hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt
dạng cầu tự tạo
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định cấu trúc hoá học của các chất phân lập được từ cao chiết

alkaloid
Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học của cao chiết alkaloid của rễ
tơ cây Bá bệnh được nghiên cứu. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các
hợp chất từ cao chiết alkaloid cho thấy cây có chứa các hợp chất β-Carboline
alkaloids (7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid), hợp chất
Canthin-6-one alkaloids (9-methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6one)

Chất (1): 7-methoxy- Chất
(2):
9- Chất (3): 9(9H-β-carbolin-1-il)methoxycanthin-6-one methoxycanthin-6(E)-1-propenoic acid
one
3.2. Hoạt tính sinh học của các chất 7-MCPA , 9-methoxycanthin-6-one, 9hydroxycanthin-6-one
3.2.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư của các chất thử (1), (2), (3)
Các kết quả thử nghiệm cho thấy: hợp chất (2) thể hiện hoạt tính gây
độc tế bào tốt hơn chất (3) trên dòng KB, LU-1, MCF-7, HepG2 (bảng 3.1).
So sánh cấu trúc hợp chất (2) và (3) cho thấy 2 chất này chỉ khác nhau nhóm

10


methoxy và hydroxy gắn ở vị trí cacbon số 7. Có thể nói, nhóm chức methoxy
có thể đóng vai trị quan trọng đối với hoạt tính ức chế dịng tế bào KB,
MCF7, LU-1, HepG2 của chất (2). Chất (1) có hoạt tính gây độc tế bào tốt
trên dịng MCF-7 với IC50 đạt 6,3 (µg/ml).
Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào của các chất thử (1), (2), (3)
STT

Chất
thử

1

(1)

2
(2)

3
(3)

Dòng tế
bào
% ức chế tại nồng độ
100
20
4
0,8
MCF-7 98,8
90,6
27,7 2,9

IC50
(µg/ml)

KB

95,7

73,9

20,8

9,1

10,3

LU-1
MCF-7
HepG2
KB
LU-1
MCF-7
HepG2

97,0
98,2
96,9
95,4
92,8
75,5
84,2

76,5
72,8
66,7
47,2
61,3
36,6
39,9

25,2
29,8
32,3
14,2
32,3
19,4
15,1

9,3
8,5
9,2
0,11
11,4
9,8
9,2

8,6
8,4
9,3
23,5
11,2
39,7
34,2

6,3

KB: Ung thư biểu mô; LU-1 ung thư phổi; MCF-7 ung thư vú; HepG2 ung
thư gan
3.2.2. Thử khả năng ức chế sự sản xuất của IL-6 và TNF-α trên tế bào
đại thực bào chuột và người kích thích bởi LPS của chất (1), (2), (3)

Các kết quả ở bảng 3.2 cho thấy b-carboline alkaloid 7-MCPA (1),
9-methoxycanthin-6-one (2) phân lập từ nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh ức chế
sản xuất IL-6 và TNF-α ở cả ba dòng đại thực bào RAW264.7, chuột và
người THP-1 kích thích LPS. Chất 7-MCPA được nhóm nghiên cứu Dang
và cs, năm 2016 làm sáng tỏ cơ chế phân tử hoạt động chống viêm thông qua
con đường p38 MAPK phụ thuộc ROS và hiệu ứng chống viêm kết hợp với
hoạt hóa con đường Nrf2/HO-1. Cần tiếp tục nghiên cứu hoạt chất 9methoxycanthin-6-one có tương tác với con đường NF-κB trong các đại thực
bào được kích thích bằng LPS hay không. Chất (3) thể hiện ức chế IL-6 và

11


TNF-α ở hai dòng đại thực bào RAW264.7 và chuột, ức chế kém trên dòng
THP-1.
Bảng 3.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 và TNF-α
của tế bào
Nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 và TNF-α
của tế bào IC50 (µM)
STT

IL-6

Chất
thử

TNF-α

RAW
264.7

ĐTB
ở
chuột

THP1

RAW
264.7

ĐTB
ở
chuột

THP1

1

(1)

4,5

12,8

9,9

6,6

12,4

16,0

2

(2)

4,2

3,7

17,2

10,2

3,5

10,0

3

(3)

1,4

4,1

53,7

10,1

0,95

45

3.3. Xây dựng đường chuẩn định lượng các alkaloid trong các mẫu Bá
bệnh bằng phương pháp HPLC-DAD
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn ba alkaloid (1), (2), (3)
Chất chuẩn (1)
7-MCPA
TT

Chất chuẩn (2) 9methoxycanthin-6one
Nồng
Diện tích
độ
pic
(µg/ml) (mAU.s)

Chất chuẩn (3) 9hydroxycanthin6one
Nồng Diện tích
độ
pic
(µg/ml) (mAU.s)

Nồng độ
(µg/ml)

Diện tích
pic
(mAU.s)

1

0

0

0

0

0

0

2

1

44,62

10

371,63

10

427,03

3

5

310,79

25

1004,75

25

1049,06

4

10

504,07

50

1848,17

75

3692,95

5

25

1434,35

125

4285,08

125

6549,70

6

50

2821,10

250

8528,45

250

12948,40

12


(A)

(B)

©

Hình 3.10. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng
độ chất chuẩn A) Chất chuẩn (1); B) Chất chuẩn (2); C) Chất chuẩn (3)

Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa
nồng độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo
sát đối với các hợp chất nghiên cứu.
Định lượng:
Các mẫu cao chiết rễ tơ và rễ tự nhiên cây Bá bệnh được bơm vào
hệ thống sắc ký với các điều kiện phân tích (ĐK-Bb) được trình bày ở phần
phương pháp. Kết quả hàm lượng các chất được tính tốn bằng cách so sánh
diện tích pic của mẫu thử với giá trị diện tích pic trên đường chuẩn.
3.4. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến q trình tăng trưởng và tích
luỹ các chất (1), (2), (3) của rễ tơ trên bình tam giác 500 ml
3.4.1. Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến sinh trưởng và phát triển của
rễ tơ cây Bá bệnh
Bảng 3.4. Sự phát triển của rễ tơ Bá bệnh trên môi trường lỏng và thạch
Trạng
CT

thái mơi
trường

CT1

Thạch

CT2

Lỏng

KLK
(g)
0,49 ±
0,04
0,63 ±
0,03

Số nhánh

Chiều dài

Hình thái rễ

trung bình

rễ trung

sau 30 ngày

trên 1 rễ

bình (cm)

ni cấy

7,1 ± 1,2

7,7 ± 1,5

5,3 ± 1,3

7,5 ± 2,1

13

Rễ nhỏ, màu
vàng
Rễ to, màu
vàng


Mơi
trường
thạch thạch
Mơi
trường

Mơi trườngMơi
lỏngtrường

lỏng

Hình 3.11. Sự phát triển của rễ tơ trên môi trường lỏng và thạch
Rễ tơ phát triển trên môi trường lỏng cho tốc độ tăng trưởng cao hơn
môi trường thạch với chỉ tiêu khối lượng khô (0,63 ± 0,03 g) so với môi
trường thạch (0,49 ± 0,04 g) có ý nghĩa thống kê cao với p < 0,001. Về mặt
hình thái, rễ phát triển trên mơi trường lỏng (5,3 ± 1,3 nhánh) phân nhánh

kém hơn trên môi trường thạch (7,1 ± 1,2 nhánh) nhưng rễ chính và rễ nhánh
to hơn so với rễ nuôi trên môi trường thạch. Rễ ni cấy trên mơi trường
lỏng thích hợp nhất cho nhân sinh khối rễ tơ, phục vụ cho mục đích nuôi cấy
tạo sinh khối rễ để làm nguồn dược liệu.
3.4.2. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng và phát triển của rễ tơ
cây Bá bệnh
Ánh sáng có thể ức chế quá trình phát triển rễ tơ cây Bá bệnh và
điều kiện ni trong tối là thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển của
rễ tơ cây Bá bệnh.
Bảng 3.5. Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng
Điều
Chiều dài Số
Hình thái rễ
CT kiện ánh KLK (g)
rễ TB
nhánh
sau 30 ngày
sáng
(cm)
TB /rễ
nuôi cấy
CT1

Sáng

0,38 ± 0,07

4,3 ± 0,9

CT2

Tối

0,66 ± 0,04

8,1 ± 0,8

14

4,3 ±
1,5
6,0 ±
1,0

Rễ nhỏ, vàng
đậm
Rễ to, vàng
tươi


Điều kiện sáng

Điều kiện tối

Hình 3.12. Sự phát triển của rễ tơ ở điều kiện tối và sáng
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và
phát triển của rễ tơ cây Bá bệnh
Bảng 3.6. Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển
của rễ tơ
Chiều

CT

dài rễ
(cm)

KLK (g)

Chiều

Số

Tỷ lệ sống

dài rễ

nhánh

sót sau 10

TB (cm)

TB/1 rễ

ngày (%)

CT1

0,2-0,4

0,35 ± 0,05

8,1 ± 0,5

6,1 ±1,4

32

CT2

0,6-0,8

0,57 ± 0,03

8,2 ± 0,6

6,5 ± 1,0

61

CT3

1,0-1,2

0,74 ± 0,05

8,2 ± 0,5

6,3 ± 1,3

97

0,2 – 0,4 cm
0,6 – 0,8 cm
1,0- 1,2 cm
Hình 3.14. Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát
triển của rễ tơ

15


Trong thí nghiệm này mẫu rễ cắt với kích thước từ 1-1,2 cm cho tỷ
sống cao nhất (97 %) và KLK thu được cũng cao nhất đạt (0,74 ± 0,05 g),
CT3 có ý nghĩa thống kê so với cơng thức 1 và 2 với p < 0,001. Như vậy, rễ
được cắt với kích thước 1-1,2 cm là thích hợp nhất cho thu sinh khối.
3.4.4. Ảnh hưởng khối lượng rễ cấy chuyển đến sinh trưởng và phát triển
của rễ tơ cây Bá bệnh
Cơng thức có 0,3 g lượng rễ tơ ban đầu được lựa chọn là cơng thức
thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển của rễ tơ nuôi cấy trong 100 ml
môi trường phục vụ nuôi cấy trên hệ thống bioreactor
Bảng 3.7. Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường với khối lượng
rễ ban đầu khác nhau
KLT rễ
CT

ban đầu KLT (g)
(g)

Tỷ lệ tăng

Chiều dài rễ

Số nhánh

trưởng

trung bình

trung

(lần)

(cm)

bình/1 rễ

CT1

0,1

3,0 ± 0,13

30

8,0 ± 0,45

6,4 ± 0,8

CT2

0,2

5,8 ± 0,1

29

8,1 ± 0,63

6,0 ± 0,4

CT3

0,3

7,9 ± 0,18

26,3

8,1 ± 0,31

6,1 ± 0,56

CT4

0,4

7,8 ± 0,14

19,5

7,8 ±0,4

6,1 ± 0,4

Hình 3.15. Sự phát triển của rễ tơ trên 100 ml môi trường với lượng
ban đầu khác nhau
3.4.5. Ảnh hưởng của mơi trường khống đến tăng trưởng và tích luỹ hợp
chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6one của rễ tơ cây Bá bệnh.

16


Bảng 3.8. Ảnh hưởng của mơi trường khống đến sinh trưởng và phát
triển rễ tơ
20

30

CT

0 ngày

5 ngày 10 ngày 15 ngày ngày 25 ngày ngày

KLK-SH

0,03 ±

0,06 ±

0,07 ±

(g)

0,006

0,02

0,02

KLK-WP

0,03 ±

0,06 ±

0,08 ±

(g)

0,006

0,01

0,02

KLK-MS

0,03 ±

0,06 ±

0,05 ±

(g)

0,006

0,01

0,01

0,25 ± 0,50 ± 0,78 ± 0,79 ±
0,02

0,03

0,04

0,03

0,26 ± 0,23 ± 0,58 ± 0,59 ±
0,01

0,01

0,02

0,05

0,22 ± 0,38 ± 0,68 ± 0,67 ±

0,01

0,02

0,03

0,04

KLK thu được sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường SH (0,79 ±
0,03) đạt giá trị cao nhất có ý nghĩa thống kê so với nuôi cấy trên môi trường
WP (0,59 ± 0,05 g) và MS (0,67 ± 0,04 g) với P < 0,05. Hình thái rễ trên cả
ba môi trường đều thuôn dài, phân nhánh nhiều và màu vàng trắng. Tuy
nhiên, ở môi trường SH rễ chính kéo dài và to hơn ở mơi trường MS và WP.
Như vậy môi trường SH là môi trường thích hợp nhất cho sinh trưởng và
phát triển của rễ tơ Bá bệnh (bảng 3.8).
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của mơi trường khống đến tích luỹ chất 7-MCPA
CT

0 ngày

5 ngày

10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày

0,0057 ±
7-SH 0,0006
7WP

-

-

0,0057 ± 0,0013 ± 0,007 ±
0,0006

0,0011

0,0015

-

-

0,01 ±

-

-

-

0,02 ± 0,009 ± 0,0069

0,0021 0,0051 0,0007 ±0,0009

0,0057 ±
7-MS 0,0006

-

-

-

-

Sau khi đánh giá sự tăng trưởng và tăng sinh khối của rễ tơ ở các giai
đoạn tăng trưởng khác nhau, các phân tích HPLC được tiến hành để xác định
hàm lượng ba chất (1), (2), (3) ở mỗi giai đoạn tăng trưởng của rễ tơ. Kết quả
cho thấy có sự hiện diện của chất (2), (3) ở tất cả các nghiệm thức với sự

17


thay đổi hàm lượng chất khác nhau trong từng giai đoạn, chất (1) có ít hoặc
khơng có ở các nghiệm thức khác nhau.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của mơi trường khống đến tích luỹ 9methoxycanthin-6-one
CT

0 ngày 5 ngày

10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày

0,04 ± 0,011 ± 0,022 ± 0,023 ± 0,133 ± 0,106 ±
9Me-SH 0,014

0,012

0,015

0,015

0,032

0,037

9Me-

0,04 ± 0,057 ± 0,088 ± 0,089 ± 0,143 ± 0,429 ±

WP

0,014

0,023

0,012

0,022

0,033

0,059

0,04 ± 0,055 ± 0,042 ± 0,106 ± 0,126 ± 0,145 ±
9Me-MS 0,014

0,017

0,017

0,054

0,055

0,012

0,102 ±
0,024
0,241 ±
0,068
0,057 ±
0,034

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của môi trường khống đến tích luỹ 9hdroxycanthin-6-one
CT

0 ngày

5 ngày

10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày

9Hy- 0,075 ±

0,018 ±

0,027 ±

0,026 ±

0,05 ±

0,05 ±

0,066 ±

0,002

0,003

0,003

0,003

0,005

0,005

0,044 ±

0,031 ±

0,15 ±

0,005

0,005

0,018

0,025 ±

0,039 ±

0,005

0,004

SH

0,005

9Hy- 0,075 ±
WP

0,005

9Hy- 0,075 ±
MS

0,005

0,137 ± 0,147 ±
0,07

0,011

0,3 ±
0,036

0,087 ± 0,089 ± 0,091 ± 0,037 ±
0,006

0,08

0,007

0,04

Hình 3.16. Ảnh hưởng của mơi trường khoáng đến sinh trưởng và phát
triển của rễ tơ sau 30 ngày nuôi cấy.

18


Rễ tơ nuôi cấy trong 30 ngày trên môi trường WP tạo ra hàm lượng
chất (1) cao nhất ở ngày thứ 20 (0,02 ± 0,0051 % KLK) (bảng 3.9), chất (2)
cao nhất trong 25 ngày (0,429 ± 0,059 % KLK) (bảng 3.10), chất (3) cao
nhất trong 30 ngày (0,3 ± 0,036 % KLK) (bảng 3.11).
3.4.6. Ảnh hưởng của jasmonic acid (JA) lên sự sinh trưởng và tích luỹ
chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6one của rễ tơ cây Bá bệnh.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid
có trong rễ tơ cây Bá bệnh
% Khối lượng khô
JA

KLK

(mg/l

(g)

Chất (1)

Chất (2)

Chất (3)

)
0

0,67 ± 0,04

0,018 ± 0,007

0,337 ± 0,100

0,26 ± 0,040

1

0,61 ± 0,06

-

0,388 ± 0,051

0,111 ± 0,064

4

0,6 ± 0,07

-

0,513 ± 0,114

0,147 ± 0,021

8

0,54 ± 0, 05

-

0,874 ± 0,125

0,465 ± 0,043

16

0,41 ± 0,06

-

0,119 ± 0,056

0,052 ± 0,009

0

1

4

8

16 (mg/l)

Hình 3.18. Ảnh hưởng của JA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid
của rễ tơ cây Bá bệnh
Elicitor dẫn truyền tín hiệu (JA) có nguồn gốc từ các hormone nội
sinh có hiệu quả lớn lên khả tích lũy alkaloid, nhưng ức chế tăng trưởng rễ.
Chính vì vậy, mơi trường ni cấy bổ sung 0,8 mg/l JA thích hợp nhất cho
tích luỹ chất (2) 9-methoxycanthin-6-one (0,874 ± 0,125 % DW) và (3) 9-

19


hydroxycanthin-6-one (0,465 ± 0,043 % DW), khơng thích hợp cho tích luỹ
chất (1). Trong nghiên cứu tiếp theo cần tìm hiểu thêm các elicitor khác có
khả năng tích luỹ chất (1) nhiều hơn trong q trình ni cấy.
3.4.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sự sinh trưởng và tích luỹ
chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6one của rễ tơ cây Bá bệnh.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid
của rễ tơ.
% Khối lượng khô
SA

KLK

Chất 1

(mg

(g)

(7-MCPA)

/l)

30 ngày

20 ngày

0

0,67 ± 0,04

0,018 ± 0,007

5

0,66 ± 0,1

-

0,912 ± 0,034

0,464 ± 0,034

10

0,65 ± 0,09

-

0,245 ± 0,076

0,208 ± 0,087

20

0,54 ± 0,08

-

0,083 ± 0,006

0,084 ± 0,009

40

0,43 ± 0,10

-

0,083 ± 0,005

0,182 ± 0,058

Chất 2 (9-

Chất 3 (9-

methoxycanthin hydroxycanthin-6-one) 25 ngày
0,337 ± 0,100

6-one ) 30 ngày
0,26 ± 0,04

Elicitor dẫn truyền tín hiệu (SA) có nguồn gốc từ các hormone nội
sinh có hiệu quả lớn lên khả tích lũy alkaloid, nhưng ức chế tăng trưởng rễ,
chính vì vậy, mơi trường ni cấy bổ sung 5 mg/l SA thích hợp nhất cho tích
luỹ chất (2) 9-methoxycanthin-6-one và (3) 9-hydroxycanthin-6-one nhưng
ức chế sự tích luỹ chất (1) 7-MCPA .

0

5

10

20

40 (mg/l)

Hình 3.21. Ảnh hưởng của SA lên sự sinh trưởng và tích luỹ các alkaloid
của rễ tơ cây Bá bệnh

20


3.4.8. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men (YE) lên sự tăng trưởng và tích
luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin6-one của rễ tơ cây Bá bệnh.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của YE lên sự sinh trưởng và tích luỹ alkaloid của
rễ tơ
% Khối lượng khô

YE

KLK

Chất 1

Chất 2 (9-

Chất 3 (9-

(mg

(g)

(7-MCPA)

methoxycanthin

hydroxycanthin-

20 ngày

-6-one) 25 ngày

6-one ) 30 ngày

/l)
0

0,67 ± 0,04

0,018 ± 0,007

0,337 ± 0,100

0,26 ± 0,04

10

0,77 ± 0,13

0,0112 ± 0,0065

0,381± 0,153

0,274 ± 0,095

20

0,82 ± 0,10

0,0239 ± 0,0056

0,694 ± 0,202

0,428 ± 0,019

40

0,72 ± 0, 2

0,0254 ± 0,0047

1,139 ± 0,341

0,657 ± 0,098

80

0,69 ± 0,12

0,0251 ± 0,0043

0,689 ± 0,220

0,578 ± 0,045

Elicitor YE có nguồn gốc từ nấm men có hiệu quả lớn lên khả tích
lũy alkaloid và tăng trưởng rễ, chính vì vậy, mơi trường ni cấy bổ sung 40
mg/l YE thích hợp nhất cho tích alkaloid (1), (2), (3). Mơi trường bổ sung 20

mg/l YE thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của rễ tơ cây Bá bệnh.

0

10

20

40

(80 mg/l)

Hình 3.22. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự sinh trưởng và tích luỹ
chất (1), (2), (3) của rễ tơ cây Bá bện
3.5. Xây dựng quy trình ni cấy thu nhận sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh
trên hệ thống bioreactor 20 lít
Tơi đã đưa ra được quy trình cấy chuyền từ bình tam giác 500 ml
sang hệ thống bioreactor 20 lít (hình 3.28)

21


Bình thuỷ tinh 20 lít

Bình bioreactor 20 lít
Bước 1: Chuẩn bị bình ni cấy khử trùng

Bình 20 lít chứa 10 lít mơi trường
Bước 2: Chuẩn bị mơi trường ni cấy

Bước 3: Chuyển mơi trường từ bình
20 lít sang bình bioreactor 20 lít

Bình tam giác 500 ml
chứa 200 ml mơi trường
và 30 g mẫu rễ tơ
Bước 4: Chuẩn bị mẫu nuôi cấy

Đóng nắp, quấn màng bọc.

Tiếp mẫu

Hình bioreactor 20 lít thực tế
sau khi chuyển mẫu

Bước 5: Chuyển mẫu nuôi cấy vào bình 20 lít

Hình 3.28.Quy trình ni cấy rễ tơ trên hệ thống Bioreactor 20 lít
Kết quả sau 30 ngày ni cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor tự tạo 20 lít
Bảng 3.16 . Kết quả sau 30 ngày ni cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor tự
tạo 20 lít
Khối lượng Khối
Bioreactor
20 lít

lượng Khối

tươi ban đầu tươi sau 30 khơ

lượng Tỷ lệ tăng

sau

(g)

ngày (g)

ngày (g)

30

850 ± 25

82 ± 2,2

30 trưởng (lần)
28,3 ± 0,8

Trong thí nghiệm này, rễ tơ cây Bá bệnh 30 g KLT được cấy vào
trong hệ thống bioreactor tự tạo 20 lít chứa 10 lít mơi trường. Quan sát rễ sau
5 ngày nuôi cấy rễ tơ đã bắt đầu mọc ra đầu sinh trưởng và phát triển rất
nhanh từ 5-20 ngày, rễ có thể kéo dài từ 1 cm - 6 cm từ ngày thứ 5 đến ngày
thứ 20. Giai đoạn sau từ 20-30 ngày tốc độ sinh trưởng của rễ chậm dần đến
ngày thứ 30 và rễ bắt đầu hố nâu (hình 3.28). Lúc này rễ được thu hoạch,
rửa sạch dưới vòi nước, phơi cho ráo nước và cân được 850 g KLT, sau khi

22


sấy khô ở 370C, cân rễ được 82 g KLK (đạt 9,65 % so với KLT). Như vậy,
tỷ lệ tăng trưởng của rễ sau 30 ngày nuôi cấy đạt 28,3 lần.

Sinh khối tươi sau 30 ngày 850 (g)
SinhSinh
khốikhối
tươitươi
650650
(g) (g)

Sinh khối khơ sau 30 ngày
52 (g)
SinhSinh
khốikhối
khơkhơ
52 (g)

Hình:
kết
quả thu được
sau 30 ngàySinh khối
ni
cấy trên Sinhhệ
thống
bioreactor
10ngày
ngày Một số20
30
ngày
ngày
10
ngày

ngày
ngày
10
2020
ngày
30
ngày
tươi
52 (g)bioreactor 20 l
Hình:
Một số kết quả
thu được30
sau
30 ngày nuôi
Sinh khối tươicấy
650650
(g) (g)trên hệSinhthống
khốikhối
khôkhô
52 (g)
10ngày
ngày
10

ngày
2020ngày

ngày
3030
ngày

KLT
(g)
Sinh khối tươi
sau 30850
ngày 850
(g)

KLK
82ngày(g)
Sinh khối
khô sau 30
82 (g)

số kết quả thu được sau 30 ngày nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít
Hình:Hình:
MộtMột
số kết
quả thu được sau 30 ngày ni cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít

Hình 3.29. Ni cấy rễ tơ trên hệ thống bioreactor 20 lít
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận

1. Lần đầu tiên cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh đã phân lập và xác
định cấu trúc hố học được 3 chất trong đó có một chất mới bao gồm:
Chất (1) (chất mới): 7-methoxy-(9H-b-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid
Chất (2): 9-methoxycanthin-6-one
Chất (3): 9-hydroxycanthin-6-one.
2. Kết quả khảo sát hoạt tính của 3 chất phân lập được (1), (2), (3) cho

thấy:
o

Chất (1) đã ức chế việc sản xuất IL-6 và TNF-a trên các dòng tế bào
chuột RAW264.7, đại thực bào của chuột và dịng tế bào người THP-1
có giá trị IC50 từ 4,5 –16,0 µg/ml. Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc trên
dòng tế bào ung thư MCF-7 ở mức tốt với IC50 là 6,34 µg/ml

o

Chất (2) đã ức chế việc sản xuất IL-6 và TNF-a trên các dòng tế bào
chuột RAW264.7, đại thực bào của chuột và dòng tế bào người THP-1
có giá trị IC50 từ 3,5 –11,6 µg/ml. Chất (2) thể hiện hoạt tính gây độc
cả 4 dịng tế bào ung thư KB, MCF-7, Hep-G2, LU ở mức tốt với IC50
từ 8,4 – 10,3 µg/ml.

o

Chất (3) đã ức chế việc sản xuất IL-6 và TNF-a trên các dòng tế bào
chuột RAW264.7 và đại thực bào của chuột có giá trị IC50 từ 0,95 -

23


10,1 µg/ml. Chất (3) thể hiện hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư
LU-1 đạt IC50 là 11,2 µg/ml.
3. Xác định được điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho rễ tơ
tăng trưởng để thu sinh khối: kích thước rễ (1,0-1,2 cm); khối lượng rễ
(0,3 g); môi trường nuôi cấy (100 ml SH + 30 g/l sucrose, pH = 5,8 ±
0,1; điều kiện nuôi (tối, lắc 80 vòng/phút); thời gian thu sinh khối sau

30 ngày. Xác định được mơi trường có bổ sung elicitor thích hợp cho
tích luỹ chất (1), (2), (3) là: mơi trường (WPM + 30 g/l sucrose + 40
mg/l) YE, pH = 5,8 ± 0,1); Hàm lượng chất (1), (2), (3) đạt cao nhất lần
lượt là 0,0254 ± 0,0047; 1,139 ± 0,341; 0,657 ± 0,098.
4. Xây dựng được hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu 20 lít sử dụng cho
nhân sinh khối rễ tơ. Tỷ lệ tăng trưởng trên hệ thống bioreactor 20 lít là
28,3 lần. Hàm lượng chất (1) được xác định chỉ có trong rễ tơ, khơng có
trong rễ tự nhiên thu thập tại vườn Quốc gia Bái Tử Long bằng phương
pháp HPLC-DAD. Chất (2) và (3) có trong rễ tơ gấp 7 lần và 8,5 lần
tương ứng so với hàm lượng có trong rễ tự nhiên.
Kiến nghị
1. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính gây độc tế bào và ức chế các
cytokine gây viêm của các chất 9-methoxycanthin-6-one và 9hydroxycanthin-6-one, đặc biệt là 7-MCPA để ngăn ngừa hoặc điều trị
các bệnh viêm.
2. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ cây Bá bệnh vào sản xuất trên quy mô công
nghiệp để tạo nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp dược phẩm
và thực phẩm.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đã phân lập và xác định cấu trúc hoá học được một chất mới (7MCPA ) từ cao chiết alkaloid của rễ tơ cây Bá bệnh.
Đánh giá được hoạt tính mới của alkaloid (1) 7-MCPA, (2) 9methoxycanthin-one như hoạt tính kháng viêm trên dòng tế bào chuột

24


RAW264.7, đại thực bào của chuột và dòng tế bào người THP-1 có giá trị
IC50 từ 0,95–16,0 µM; hoạt tính gây độc của chất (1) trên dòng tế bào MCF7; Chất (2) trên các dòng tế bào ung thư KB, MCF-7, Hep-G2, LU-1 và chất
(3) trên dòng LU-1.
Lần đầu tiên tìm được điều kiện ni cấy thích hợp cho rễ tơ cây Bá
bệnh tăng trưởng để thu sinh khối và tăng tích luỹ ba hoạt chất 7-MCPA ,
9-methoxycanthin-6-one và 9-hydroxycanthin-6-one.

Xây dựng được hệ thống bioreactor sục khí dạng cầu 20 lít sử dụng
cho nhân sinh khối rễ tơ cây Bá bệnh với các điều kiện tối ưu.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ
1. P.B. Ngoc, T.T. Binh, N.H. Dang, T.T. Trang, C.H. hà, C.V. Minh, L.
Jeong-Hyung, N.T. Dat, A new anti-inflammatory β-carboline alkaloid
from the hairy-root cultures of Eurycoma longifolia, Natural Product
Research, 2015, 13, 1-6, SCIE.
2. Trần Thu Trang, Phạm Bích Ngọc, Chu Nhật Huy,Hồng Thị Thu Hằng,
Nguyễn Trung Nam, Chu Hồng Hà, Khảo sát một số hoạt tính sinh học
trong cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên cây bá bệnh (Eurycoma
Longifolia Jack), Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và
Công nghệ, 2017, 33, 2, 67-73.
3. T.T. Trang, T.N. Nam, B.P. Ngoc, N.C. Huy, D.N. Trong, K.
Tadamitsu, V.C. Minh and H.C. Ha, Hairy Root Cultures of Eurycoma
longifolia and Production of Antiinflammatory 9-Methoxycanthin-6one, Natural Product Communications, 2018, 13 (5), 537-542, SCIE.
4. Trần Thu Trang, Phạm Bích Ngọc, Chu Nhật Huy, Chu Hoàng Hà,
Nguyễn Trung Nam, Huy, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Trung Nam, Đánh
giá một số hoạt tính sinh học mới của hợp chất 9-hydroxycanthin-6-one
phân lập từ rễ tơ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack), Tuyển tập
báo cáo tồn văn của Hội nghị Cơng nghệ Sinh học Toàn quốc năm
2019, 84-85.

25