THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH pptx _ KIỂM NGHIỆM (slide nhìn biến dạng, tải về đẹp lung linh)

Khoa Dược – Bộ môn Kiểm nghiệm thuốc

Thẩm Định Quy Trình Phân Tích
Validation of Analytical Procedures

Bài giảng pptx các mơn chuyên ngành dược hay
nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”;
/>use_id=7046916


Thẩm Định Quy Trình Phân Tích
Mục tiêu
 Trình bày được định nghĩa và phân loại quy trình phân tích; sự cần thiết phải thẩm
định quy trình phân tích; phạm vi thẩm định và tái thẩm định một quy trình phân tích.
 Thực hiện được các chỉ tiêu cần được thẩm định đối với một quy trình phân tích.
 Đánh giá được một quy trình phân tích sau khi được thẩm định.

Nội dung
 Quy trình phân tích
 Thẩm định quy trình phân tích
 Phạm vi thẩm định, tái thẩm định
 Các chỉ tiêu cần được thẩm định đối với một quy trình phân tích
 Thẩm định quy trình định lượng dược chất trong dịch sinh học
 Một số ví dụ cụ thể
2


Thẩm Định Quy Trình Phân Tích
Tài liệu tham khảo
1.
2.

3.

4.
5.
6.
7.
8.
9.

Asean guideline for validation of analytical procedures (2008), pp. 1-17
Quyết định của Bộ trưởng Bộ Y tế số 229/QĐ-QLD ngày 12 tháng 08 năm 2010 về
việc ban hành Sổ tay hướng dẫn tạm thời đăng ký thuốc, tr. 40-45.
Quyết định của Bộ trưởng Bộ Y tế số 1570/2000/QĐ-BYT ngày 22 tháng 5 năm 2000
về việc triển khai áp dụng nguyên tắc Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc, tr. 369
– 370
BP 2010, Apendix III, Chromatographic separation techniques, pp. 6 -11
FDA (2001), Guidance for industry, Bioanalytical method validation, pp. 4 – 11
ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text
and methodology, pp. 1 – 13
Dược điển Việt Nam IV (2009), tr. 2004, 462, 463, PL-119 – PL-123, PL-311 – PL-312
USP 32 (2009), Data elements required for validation, p. 736
Ludwig Huber (2007), Validation and qualification in analytical laboratories, second
edition, pp. 144, 146
3


Quy Trình Phân Tích
 Quy trình thử nghiệm (test procedure)
 Mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện
 Chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn đối chiếu, các thuốc thử, sử dụng trang thiết bị

 Xử lý, tính toán và biện giải kết quả, v.v...
 Phân loại
 Quy trình định tính: đảm bảo chất phân tích có trong mẫu thử
 Quy trình thử tinh khiết (xác định tạp chất): xác định mức độ tinh khiết của mẫu cần
thử
 Định lượng tạp chất (quantitative test for impurities’ content)
 Thử giới hạn tạp chất (limit tests for the control of impurities)
 Yêu cầu thẩm định của quy trình định lượng tạp chất nhiều hơn thử giới hạn tạp
chất
 Quy trình định lượng hoạt chất hoặc thành phần đã chọn khác: đo lường chất cần
thử trong mẫu thử (nguyên liệu, chế phẩm, độ hòa tan, dược liệu, dịch sinh học, …)
4


Thẩm Định Quy Trình Phân Tích
 Q trình thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của
phương pháp
 Chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến
 Khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp
nhận được
 Mục đích: giúp thực hiện các chỉ tiêu và kiểm tra chất lượng của
tiêu chuẩn
 Cơng việc bắt buộc, có tính chất định kỳ nhằm đảm bảo phương
pháp phân tích phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong
suốt q trình phân tích
 Có thể đưa vào chun ḷn Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở
5


Phạm Vi Thẩm Định

 Quy trình phân tích mới chưa có trong Dược điển (qui trình do nhà sản xuất
xây dựng, từ các bài báo,…) hoặc những quy trình có trong Dược điển
nhưng có sự thay đổi


Quy trình phân tích trong Dược điển: chứng minh sự phù hợp của phương
pháp ghi trong Dược điển cho sản phẩm. Thẩm định lại các qui trình phân
tích sau:
 Định tính: tính đặc hiệu
 Định lượng (hoạt chất hoặc thành phần đã chọn khác, tạp chất, lượng
giải phóng hoạt chất ở chỉ tiêu độ hòa tan): tính đặc hiệu, độ đúng và độ
lặp lại
 Thử giới hạn tạp chất: tính đặc hiệu
6


Tái Thẩm Định
Tái thẩm định một phần hoặc hoàn toàn
Thay đổi quy trình tổng hợp dược chất
Thay đổi thành phần cơng thức thuốc
Thay đổi quy trình phân tích hoặc thơng số trong quy trình
Thay đổi trang thiết bị phân tích có các đặc tính khác
Thay đổi phịng thí nghiệm có điều kiện mơi trường khác
Thay đổi hóa chất, thuốc thử hoặc nguồn cung cấp chất chuẩn
Thử nghiệm tính phù hợp của hệ thống nằm ngoài tiêu chuẩn chấp nhận khi
thẩm định lần đầu
 Xét duyệt tại các Cơ quan kiểm nghiệm quốc gia xin đăng ký lại để lưu hành
mặt hàng (thẩm định định kỳ)









Lưu ý: Trong quá trình tái thẩm định, tiêu chuẩn chấp nhận của các thông số khi
thử nghiệm tính phù hợp của hệ thống nên được xem xét lại nếu cần thiết
7


Các Chỉ Tiêu Cần Được Thẩm Định Đối Với Quy Trình Phân Tích
 Tính phù hợp của hệ thống (system suitability)
 Tính đặc hiệu (specificity) hay tính chọn lọc (selectivity)
 Độ đúng (accuracy)
 Độ chính xác (precision)
 Độ lặp lại (repeatability)
 Độ chính xác trung gian (intermediate precision)
 Độ tái lặp (reproducibility) hay độ ổn định (ruggedness)
 Giới hạn phát hiện (limit of detection, LOD)
 Giới hạn định lượng (limit of quantitation, LOQ)
 Tính tuyến tính (linearity) và miền giá trị (khoảng xác định, range)
 Độ bền (robustness)

8


Các Chỉ Tiêu Cần Được Thẩm Định Đối Với Quy Trình Phân Tích
Theo ICH (International Conference on Harmonization, 2005)
XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT

Loại quy trình phân tích
Chỉ tiêu

Định tính

Định lượng

Thử giới
hạn

Định lượng
- Hàm lượng
- Độ hịa tan

Độ đúng



+



+

Độ chính xác
đợ lặp lại
độ chính xác trung gian
độ sao lại






+
+3
+





+
+3
+

Tính đặc hiệu2

+

+

+

+

Giới hạn phát hiện



-1

+



Giới hạn định lượng



+





Tính tuyến tính



+



+

+:Miền
chỉ tiêugiá
thường
trị được thẩm định; : chỉ tiêu không cần phải
+

+
 thẩm định

1: Chỉ tiêu chỉ cần được thẩm định trong một số trường hợp; 2: trong trường hợp khơng thực hiện thì phải thay thế bằng các quy
trình phân tích hỗ trợ khác; 3: trong trường hợp đã xác định độ tái lặp thì khơng cần phải xác định độ chính xác trung gian

9


Các Chỉ Tiêu Cần Được Thẩm Định Đối Với Quy Trình Phân Tích
Theo USP 32
Quy trình phân tích
Yếu tố thẩm định

Loại II
Loại I

Định
lượng

Thử giới
hạn

Loại III

Loại IV

Độ đúng

+

+

*

*

-

Độ chính xác

+

+

-

+

-

Tính đặc hiệu

+

+

+

*

+

Giới hạn phát hiện

-

-

+

*

-

Giới hạn định lượng

-

+

-

*

-

Tính tuyến tính

+

+

-

*

-

Miền giá trị

+

+

*

*

-

*: Yêu cầu tùy từng thử nghiệm
Loại I: Định lượng nguyên liệu hay thành phần chính trong thuốc; Loại II: Xác định tạp chất trong nguyên liệu
hay sản phẩm phân hủy trong thuốc; Loại III: Định lượng hoạt chất phóng thích; Loại IV: Định tính
10


Các Chỉ Tiêu Cần Được Thẩm Định Đối Với Quy Trình Phân Tích
Theo ASEAN (2008)
XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT

Loại quy trình phân tích
Chỉ tiêu

Định tính

Định lượng

Thử giới
hạn

Định lượng
- Hàm lượng
- Độ hịa tan

Độ đúng



+



+

Độ chính xác
đợ lặp lại
đợ chính xác trung gian




+
+3




+
+3

Tính đặc hiệu2

+

+

+

+

Giới hạn phát hiện



-1

+



Giới hạn định lượng



+





Tính tuyến tính



+



+

Khoảng xác định



+



+

+: chỉ tiêu thường được thẩm định; : chỉ tiêu khơng cần phải thẩm định
1: Có thể cần trong một số trường hợp; 2: Quy trình kém đặc hiệu có thể bổ trợ bằng các quy trình hỗ trợ khác; 3: trong trường
hợp đã xác định độ tái lặp thì khơng cần phải xác định độ chính xác trung gian

11


Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc
 Khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần
phân tích mà khơng bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất
khác có trong mẫu thử
 Tùy đối tượng trong quy trình phân tích mà thực hiện thử
nghiệm
 Nếu một quy trình phân tích khơng thể thực hiện được thì phải
phối hợp nhiều quy trình phân tích hỗ trợ khác để chứng minh

12


Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy Trình Định Lượng
 Đảm bảo kết quả xác định hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu là chính xác, tránh
ảnh hưởng của các thánh phần khác có trong mẫu
 Đối với phép định lượng không hoặc kém đặc hiệu với hoạt chất cần phân tích (ví dụ
như định lượng nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ thể tích) cần có phương
pháp phân tích hỗ trợ khác (để chứng minh tính đặc hiệu) ví dụ như phải có chỉ tiêu thử
tạp chất thích hợp.
Đối với qui trình sắc ký
 Cần đưa ra các sắc ký đồ đại diện để chứng minh tính đặc hiệu trong đó từng thành
phần riêng biệt phải được ghi lại (chú thích) rõ ràng.
 Độ tinh khiết của pic cần được xác định bằng đầu dò PDA hay khối phổ.

 Tính đặc hiệu có thể được chứng minh bằng độ phân giải của hai thành phần được
rửa giải gần nhau nhất.
 Phải đệ trình các sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử.
 Các thông số đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký như: số đĩa lý thuyết, độ
phân giải, hệ số đối xứng của pic v.v.
26


Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy Trình Định Lượng
Ví dụ 3: Xác định tính đặc hiệu của quy trình định lượng desloratadin trong chế
phẩm và trong khảo sát độ ổn định của desloratadin trong q trình xây dựng
cơng thức bào chế siro và thành phẩm bằng HPLC với đầu dò PDA
 Chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng (pha động), mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử
thêm chuẩn, mẫu phân giải (mẫu được để trong các điều kiện khắc nghiệt)
 Tiến hành sắc ký các mẫu trên
 Điều kiện sắc ký: cột pha đảo C8 (250 x 4,6 mm; 5 m). Bước sóng phát hiện
278 nm. Tốc độ dịng 1,2 ml/phút. Thể tích tiêm 20 l. Pha động: hỗn hợp gồm
25 thể tích acetonitril và 75 thể tích dung dịch đệm phosphat 10 mM (pH 2,5)
có chứa 10 mM triethylamin

29


Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy Trình Định Lượng
u cầu
 Thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu thử và mẫu phân giải tương đương thời
gian lưu của pic desloratadin trong mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng khơng có pic trùng
với pic desloratadin
 Khi thêm một lượng chất chuẩn desloratadin vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic
của desloratadin tăng lên so với trước khi thêm chất chuẩn

 Pic desloratadin tách hoàn toàn các pic khác trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu
phân giải (nếu có)
 Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu thử và mẫu phân giải giống
phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu chuẩn
 Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic desloratadin khơng có các
thành phần khác trong tất cả các mẫu
30


Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy Trình Định Lượng
Mẫu trắng

Chuẩn desloratadin
nồng độ 100 µg/ml

Viên desloratadin
nồng độ 100 µg/ml

Viên desloratadin
thêm chuẩn

Siro desloratadin
nồng độ 100 µg/ml

Siro desloratadin
thêm chuẩn

31

Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy Trình Định Lượng

Chuẩn desloratadin

Chuẩn desloratadin

Viên desloratadin

Viên desloratadin

Siro desloratadin

Siro desloratadin
32


Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy Trình Định Lượng
Chuẩn desloratadin
nồng độ 100 µg/ml

Chuẩn chiếu ánh
sáng trực tiếp/ 48 giờ

Chuẩn đặt ở nhiệt độ
trên 60 0C/ 48 giờ

Chuẩn bị thủy phân
trong HCl 0,5 N/ 48 giờ

Chuẩn bị thủy phân trong

NaOH 0,5 N/ 48 giờ

Chuẩn bị oxy hóa bởi
H2O2 3%/ 24 giờ
33


Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy Trình Định Lượng
Viên desloratadin
Ánh sáng trực tiếp/48 giờ

Trên 60 0C/ 48 giờ

Siro desloratadin
Ánh sáng trực
tiếp/48 giờ

Trên 60 0C/ 48 giờ

34


Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy Trình Định Lượng

Chuẩn dưới ánh sáng
trực tiếp/ 48 giờ

Viên desloratadin
trên 60 0C/ 48 giờ

Chuẩn bị thủy phân trong
NaOH 0,5 N/ 48 giờ

Siro desloratadin ánh
sáng trực tiếp/ 48 giờ

Chuẩn bị oxy hóa bởi H2O2
3%/ 24 giờ

Siro desloratadin trên
60 0C/ 48 giờ

35


Tính Đặc Hiệu/Tính Chọn Lọc – Quy Trình Định Lượng

Chuẩn dưới ánh sáng
trực tiếp/ 48 giờ

Viên desloratadin
trên 60 0C/ 48 giờ

Chuẩn bị thủy phân trong
NaOH 0,5 N/ 48 giờ

Siro desloratadin ánh
sáng trực tiếp/ 48 giờ

Chuẩn bị oxy hóa bởi H2O2

3%/ 24 giờ

Siro desloratadin trên
60 0C/ 48 giờ
36


Tính tuyến tính – Miền giá trị (Khoảng xác định) - LOD – LOQ

Đáp ứng
Miền giá trị
Độ dốc = Độ nhạy
S/N = 10/1
S/N = 3/1

Tung độ
góc
Hàm lượng

Minh họa tính tuyến tính, miền giá trị, LOD và LOQ

37


Tính Tuyến Tính
 Khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ
thuộc giữa độ đáp ứng (response) của đại lượng đo được (y) và nồng độ
(concentration) là một đường thẳng (x) [hay trựự̣c tiếp tính toán dựa vào tương quan tỷ
lệ giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ (x)]
 Biểu thị bằng hệ số tương quan (coefficient of correlation) r hay r2

 Thực hiện trực tiếp trên mẫu chuẩn (bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc)
và/ hoặc cân riêng biệt các hỗn hợp tự tạo chứa các thành phần dược chất dựa trên
quy trình đã đặt ra. Cần tiến hành ít nhất với 5 nồng độ. Trong những trường hợp
khác cần nêu rõ lý do.
 Kết quả thử phải được đánh giá bằng phương pháp thống kê thích hợp, ví dụ
bằng cách tính đường hồi qui dựa vào phương pháp bình phương cực tiểu theo
phương trình Y= ax + b. Thông thường, hệ số tương quan r phải nằm trong khoảng
0,998- 1,002, nếu giá trị thu được nằm ngoài khoảng này cần phải có thuyết minh về
sự phù hợp của việc chấp nhận giá trị này.
38


Tính Tuyến Tính
 Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi
quy
dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy
Trắc Sử
nghiệm
t (phân phối Student)


Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj khơng có ý nghĩa thống kê”
HA: Bj  0 “Hệ số Bj có ý nghĩa thống kê”
Giá trị thống kê:
t

Biện luận:

Bi   i
S

2
b



B
S

2
b

2
b

S 

S2

 X

i

 X



2

Nếu t0 < t0,05 (N-2)  chấp nhận giả thuyết H0

Nếu t0 > t0,05 (N-2)  chấp nhận giả thuyết HA

39


Tính Tuyến Tính
Trắc nghiệm F (phân phối Fischer)
Giả thuyết:
H0: Bj = 0 “Phương trình hồi quy khơng tương thích”
HA: Bj  0 “Phương trình hồi quy tương thích”
Giá trị thống kê:

2
S
f
FPhương
 2 sai của yếu tố khảo sát
S r sai của yếu tố ngẫu nhiên
Phương

F0,05 = FINV(0,05, 1 , 2 )
1 = a-1 ; 2 = N-a
Biện luận:
Nếu F < F0,05  chấp nhận giả thuyết H0
Nếu F > F0,05  chấp nhận giả thuyết HA
40