Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein từ bã đậu nành của công nghiệp sản xuất sữa bằng chế phẩm enzyme thương mại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------

CAO THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU THU NHẬN SẢN PHẨM THỦY PHÂN PROTEIN
TỪ BÃ ĐẬU NÀNH CỦA CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT SỮA
BÀNG CÁC CHẾ PHẨM ENZYME THƯƠNG MẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------

CAO THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU THU NHẬN SẢN PHẨM THỦY PHÂN PROTEIN
TỪ BÃ ĐẬU NÀNH CỦA CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT SỮA
BÀNG CÁC CHẾ PHẨM ENZYME THƯƠNG MẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. QUẢN LÊ HÀ

Hà Nội - 2018


LỜI CAM ĐOAN

Học viên: Cao Thị Kim Chi
Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Người hướng dẫn : PGS.TS. Quản Lê Hà
Tên luận văn: “Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein từ Bã đậu
nành của công nghiệp sản xuất sữa bằng các chế phẩm enzyme thương mại”.
Nội dung cam đoan: Em xin cam đoan, trong suốt quá trình nghiên cứu luận
văn thạc sĩ, dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của giáo viên hướng dẫn, em đã tiến
hành nghiên cứu luận văn một cách trung thực, toàn bộ nội dung trong báo cáo luận
văn được em trực tiếp thực hiện. Tất cả các kết quả nghiên cứu không sao chép từ
các báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách của bất cứ tác giả nào.

Học viên

Cao Thị Kim Chi

1


LỜI CẢM ƠN
Đối với mỗi học viên cao học, luận văn tốt nghiệp là một cơng trình khoa
học nhỏ nhưng mang ý nghĩa lớn, đánh dấu bước trưởng thành đầu tiên của mỗi cá
nhân trên con đường ứng dụng những kiến thức đã được học vào thực tiễn.
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Quản Lê Hà, Viện
trưởng – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học

Bách Khoa Hà Nội, PGS.TS Phạm Thu Thủy – giảng viên bộ mơn Cơng nghệ sinh
học đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức quý báu để giúp em hoàn
thành luận văn này.
Trong thời gian thực tập và làm việc tại phịng Thí nghiệm bộ mơn Cơng
nghệ Sinh học- Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, em đã nhận
được sự quan tâm giúp đỡ, sự chỉ bảo tận tình về chun mơn, kĩ thuật cùng sự
động viên chân thành của thầy cô và tập thể học viên, sinh viên thực tập tại phòng.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Em xin được gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận
lợi giúp em hoàn thành luận văn.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên khuyến khích em
trong suốt q trình học tập để đạt được kết quả như ngày hôm nay.

Hà Nội, tháng năm 2018
Học viên

Cao Thị Kim Chi

2


DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
[a.a]: Hàm lượng axit amin
BĐ: Bã đậu
CK: Chất khơ
ĐPL: Độ pha lỗng
HSTH: Hiệu suất thu hồi
HSTP: Hiệu suất thủy phân
KL: Khối lượng

KLTB: Khối lượng trung bình
OD: Optical density (mật độ quang)
[Pr]: Hàm lượng protein
TLPT: Tỉ lệ phối trộn

3


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ 1
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 8
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ......................................................................... 10
ậu nành ............................................................................. 10
1.1.1.Sản xuất sữa đậu nành ............................................................................ 10
1.1.2.Bã đậu nành ............................................................................................ 11
1.1.3.Thành phần Bã đậu nành:....................................................................... 13
1.1.4.Protein Bã đậu nành ............................................................................... 14
1.1.5.Phương pháp xử lí protein ...................................................................... 15
1.2.Hệ enzyme protease .................................................................................. 18
1.2.1.Định nghĩa .............................................................................................. 18
1.2.2.Phân loại protease .................................................................................. 19
1.2.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của protease.................................. 20
1.3.Protein thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa của protein thủy phân ...... 22
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 26
2.1. Vật liệu nghiên cứu: ................................................................................. 26
2.1.1.Bã đậu nành ............................................................................................ 26
2.1.2.Các chế phẩn enzyme thương mại ......................................................... 26
2.2.Hóa chất

............................................................................................... 26

2.3.Thiết bị

............................................................................................... 26

2.4.Phương pháp xác định hoạt độ protease của các chế phẩm ...................... 27
2.5.Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu ......................................... 29
2.6.Phương pháp xác định protein hòa tan bằng phương pháp Lowry ........... 30
2.7.Phương pháp xác định axit amin bằng Ninhydrin .................................... 32
2.8.Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH: .................. 34
2.9.Sơ đồ nghiên cứu thủy phân Bã đậu nành bằng các chế phẩm protease .. 36

4


CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................ 40
3.1.Phân tích thành phần ban đầu của Bã đậu nành ........................................ 40
3.2.Xác định hoạt độ của các chế phẩm enzyme thương mại ......................... 40
3.3.Nghiên cứu thu hồi protein trong bã đậu ướt bằng các chế phẩm protease
thương mại

............................................................................................... 40

3.3.1.Nghiên cứu thủy phân protein trong bã đậu ướt bằng chế phẩm protease
............................................................................................... 40
3.3.2.Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ phối trộn bã đậu ướt và nước đến khả năng
thuỷ phân protein............................................................................................. 42
3.3.3.Nghiên cứu lựa chọn chế độ khuấy đến hoạt tính chống oxy hóa của
dịch thủy phân ............................................................................................... 45
3.3.4.Nghiên cứu lựa chọn nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân protein47

3.3.5.Nghiên cứu sự kết hợp 2 loại enzyme Neutrase và Flavourzyme trong
thủy phân protein Bã đậu nành thu nhận sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa
cao

............................................................................................... 49

3.4. Nghiên cứu khảo sát tỉ lệ phối trộn bã đậu khô và nước tới khả năng thu
hồi protein

............................................................................................... 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 54
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 58

5


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trên 100g bã đậu nành ướt ....................... 13
Bảng 1.2. Bảng so sánh thành phần axit amin trong protein Bã đậu nành ướt
và hạt đậu nành ............................................................................................... 15
Bảng 3.1. Thành phần Bã đậu nành ................................................................ 40
Bảng 3.2. Hoạt độ các chế phẩm enzyme ....................................................... 40
Bảng 3.3. Nghiên cứu kết hợp 2 chế phẩm enzyme Neutrase và Flavourzyme
trong thủy phân protein Bã đậu nành .............................................................. 50
Bảng 3.4. Nghiên cứu khảo sát tỉ lệ phối trộn bã đậu khô và nước tới khả năng
thu hồi protein ................................................................................................. 51
Bảng 1.1’: Bảng xác định độ ẩm nguyên liệu ................................................. 58

Bảng 1.2’: Bảng xác định protein hòa tan trong Bã đậu nành ........................ 59
Bảng 2.1’ : Xác định lượng protein của dịch trong ........................................ 60
Bảng 2.2’: Xác định lượng axit amin của dịch trong ...................................... 61
Bảng 3.1’. Bảng xác định lượng protein của dịch trong ................................. 64
Bảng 3.2’ . Bảng xác định lượng axit amin của dịch trong ............................ 65
Bảng 3.3’ : Kết quả phân tích dịch trong khi khảo sát tỷ lệ phối trộn bã đậu và
nước ................................................................................................................. 67
Bảng 3.4’ : Kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch trong khi
khảo sát tỷ lệ phối trộn bã đậu và nước .......................................................... 68
Bảng 4.1’. Bảng xác định lượng protein của dịch trong ................................. 69
Bảng 4.2’. Bảng xác định lượng axit amin của dịch trong ............................. 70
Bảng 4.3’ : Kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch trong khi
khảo sát chế độ khuẩy ..................................................................................... 71
Bảng 5.1’. Bảng xác định lượng protein của dịch trong ................................. 72
Bảng 5.2’. Bảng xác định lượng axit amin của dịch trong ............................. 74
Bảng 5.3’: Kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch trong khi khảo
sát nồng độ enzyme ......................................................................................... 75
Bảng 5.4’: Kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch trong khi khảo
sát tỉ lệ phối trộn bã đậu khô và nước ............................................................. 76

6


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Mơ hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein .................... 19
Hình 1.2. Hỗn hợp protein thủy phân ............................................................. 23
Hình 2.1. Đường chuẩn Tyrosine .................................................................... 28
Hình 2.2. Đường chuẩn albumin ..................................................................... 31
Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn glutamic .......................................................... 33

......................................................................................................................... 36
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình thu hồi protein sử dụng enzyme ............................ 36
Hình 3.1 (a) Lượng axit amin trong dịch thủy phân bã đậu ướt bằng 2 chế
phẩm Flavourzyme và Neutrase ...................................................................... 41
Hình 3.1 (b) Khả năng thủy phân protein trong BĐ ướt của chế phẩm enzyme
......................................................................................................................... 41
Hình 3.2 (a) Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn BĐ và nước tới lượng axit amin.
......................................................................................................................... 42
Hình 3.2 (b) Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn BĐ và nước tới hiệu suất thủy
phân của enzyme. ............................................................................................ 43
Hình 3.2 (c) Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn BĐ và nước tới hiệu suất thu hồi
protein.............................................................................................................. 43
Hình 3.2. (d) Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn BĐ và nước tới hoạt tính chống
oxy hóa của dịch thủy phân protein. ............................................................... 44
Hình 3.3 (a) Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới lượng axit amin trong dịch sau
thủy phân. ........................................................................................................ 45
Hình 3.3 (b) Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới hiệu suất thủy phân protein. .. 46
Hình 3.3 (c) Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới hiệu suất thu hồi protein........ 46
Hình 3.3 (d) Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới hoạt tính chống oxy hóa của
dịch thủy phân protein. .................................................................................... 46
Hình 3.4 (a). Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hàm lượng axit amin trong
dịch thủy phân ................................................................................................. 47
Hình 3.4 (b). Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thủy phân protein
......................................................................................................................... 48
Hình 3.4 (c). Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thu hồi protein . 49
Hình 3.4 (d). Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hoạt tính chống oxy hóa của
dịch thủy phân protein. .................................................................................... 49

7

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, ngành sản xuất sữa đậu nành phát triển một cách
vượt bậc. Theo số liệu thống kê của hãng thống kê thị trường Neilsen, năm 2014
Việt Nam tiêu thụ khoảng 613 triệu lít sữa đậu nành, có nghĩa khoảng 1,5 triệu lít /
ngày. Việt Nam là nước tiêu thụ sữa đậu nành nhiều thứ 3 trên thế giới [34]. Với thị
trường tiềm năng này, các doanh nghiệp cũng mạnh tay đầu tư cơ sở, công nghệ để
sản xuất mặt hàng này, nổi bật như nhà máy Vinasoy (Bắc Ninh và Quảng Ngãi),
nhà máy Vinamilk …Nhưng đi đôi với việc đẩy mạnh chế biến đậu nành thì việc
một lượng lớn bã đậu được thải ra. Theo một số thống kê cho biết, riêng nhà máy
Vinasoy với cơng suất thiết kế 180 triệu lít/năm, mỗi năm nhà máy thải ra 20000 tấn
bã đậu [34]. Phần lớn lượng bã này được sấy khô bán cho nhà máy chế biến thức ăn
gia súc. Với phương pháp tận thu này tiêu tốn năng lượng và không đem lại lợi
nhuận cao. Còn một phần bã đậu được bán tươi, tuy nhiên bã đậu chứa nhiều chất
dinh dưỡng cũng như độ ẩm cao nên rất dễ hư hỏng cần sử dụng. Để khắc phục
những nhược điểm trên, cũng đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng bã đậu như lên men
thu hồi axit xitric hay dùng enzyme cellulase và pectinase thủy phân bã đậu thu hồi
sản phẩm kích thước nhỏ bổ sung một phần vào bột làm bánh mì….bởi phần bã đậu
sau quá trình sản xuất sữa đậu nành vẫn chứa nhiều thành phần dinh dưỡng như
protein (20-30%), gluxit, chất béo và chất xơ. Nhận thấy nguồn protein trong bã đậu
có khả năng thu hồi và việc thu hồi protein trong bã đậu sẽ giúp tiết kiệm năng
lượng cũng như tăng giá trị thương mại của bã đậu. Xu hướng mở ra hiện nay là
phối hợp các chế phẩm enzyme thương mại để thủy phân bã đậu tạo ra các peptide,
các axit amin có hoạt tính chống oxy hóa được sử dụng để bổ sung vào thực phẩm
chức năng hay ứng dụng trong dược phẩm.
Xuất phát từ những mục đích thăm dị khả năng thu hồi protein trên bã đậu
khô bằng chế phẩm Neutrase và Flavourzyme nhằm đưa ra một hướng mới giúp tận
dụng tốt đa nguồn bã đậu thải ra hàng năm và mang lại giá trị kinh tế cao, tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein

8


từ Bã đậu nành của công nghiệp sản xuất sữa bằng các chế phẩm enzyme
thƣơng mại”.
Nghiên cứu
bã đậu ướt và bã đậu khô

thủy phân

chế phẩm Flavourzyme và Neutrase (tỉ lệ phối trộn,

chế độ khuấy và nồng độ enzyme

hiệu suất thu hồi protein cao nhất và tạo ra

các peptide có hoạt tính chống oxy hóa.

9


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.

bã đậu nành

1.1.1. Sản xuất sữa đậu nành
Sữa đậu nành được chế biến từ hạt đậu nành thu mua từ nhiều nguồn khác
nhau. Trước khi đưa vào dây chuyền sản xuất, chúng được làm sạch và phân loại để
đảm bảo loại hết tạp chất và độ đồng đều chất lượng. Sau đó, những hạt đậu này

được nghiền với nước nóng và ly tâm thu dịch. Để loại những enzyme có hại cho
sản phẩm như enzyme Lipoxygenase và Anti-tripsin, người ta dùng biện pháp gia
nhiệt và bài khí. Sau đó, dịch đậu nành sẽ được phối trộn với nguyên liệu khác
(nước, đường, phụ gia, hương và một số thành phần phụ khác) nhằm tạo ra hương
vị cho sản phẩm. Tuy nhiên, những thành phần này có thể bị lắng xuống nên cần
đồng hóa dịch. Dưới áp suất cao thì các phần tử trong dịch được phân tán đều tạo
dung dịch đồng nhất. Một công đoạn không thể thiếu trong dây chuyền sản xuất là
tiệt trùng với nhiệt độ cao và áp suất cao thì những vi sinh vật bị tiêu diệt mà khơng
làm thay đổi tính chất sản phẩm ban đầu. Cuối cùng dịch được trữ lạnh, đóng gói và
bảo quản [34]. Bã đậu nành thu được từ q trình này được ứng dụng vào đề tài của
tơi.

10


Sơ đồ quy trình sản xuất sữa đậu nành tại công ty Vinasoy Việt Nam

1.1.2. Bã đậu nành
Bã đậu nành hay còn gọi tắt là bã đậu: là phần rắn cịn lại sau khi lọc trong
q trình sản xuất đậu phụ, sữa đậu nành và các sản phẩm từ đậu nành khác.
Trên thế giới, từ ngữ thông dụng để chỉ bã đậu nành là “okara”, thuật ngữ này
xuất phát từ Nhật Bản (phát âm theo tiếng Nhật là “oh-KAR-uh”).

11


Okara là

bã màu trắng hoặc trắng ngà bao gồm các phần khơng hịa tan

của hạt đậu nành cịn lại, khi hạt đậu nành xay nhuyễn được lọc trong sản xuất sữa
đậu nành và đậu phụ. Khi sấy khô, bã đậu nành có màu vàng.
Okara là một sản phẩm phụ từ ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành và
đậu phụ. Nó chứa protein, chất xơ có giá trị và có thể được sử dụng trong các sản
phẩm thực phẩm để đáp ứng nhu cầu của thị trường. Tuy nhiên, chúng ta phải xử lý
một cách nhanh chóng để duy trì được các tính chất của nó. Bã đậu nành chứa hầu
hết cacbohydrate, một phần protein và một lượng nhỏ phần dầu của hạt đậu nành.
Bã ướt giống như mùn cưa ẩm, nó được cho là giống với cơm dừa về kết cấu và
hình thức, thường được sử dụng như một thành phần thực phẩm trong món súp
Nhật Bản, salad và các món ăn được chế biến từ thực vật.
Tình hình nghiên cứu okara ở nước ngoài:
- Ma và cộng sự (1997) đã tách các protein từ okara và nghiên cứu tính chất hóa lý,
chức năng của chúng để so sánh với protein thương mại tách chiết từ đậu nành.
Chan và Ma (1999) cũng đã thủy phân protein bã đậu bằng trypsin. Kết quả cho
thấy protein tách chiết từ okara có lượng axit amin phong phú so với tiêu chuẩn của
FAO/WHO và so với protein đậu nành thương mại; dễ tiêu hóa, có thể bổ sung vào
thực phẩm [10,11,21]
- Quitain và cộng sự (2005) đã tách chiết dầu từ okara sử dụng cacbon dioxit siêu
tới hạn. Lượng dầu thu được là 3,09g trên 100g bã đậu khơ. Ngồi ra isoflavone,
genistein và daidzen cũng được tách chiết cùng dầu làm tăng giá trị dinh dưỡng của
dầu với sức khỏe con người (hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, chống ung
thư…)[28].
- Sourel (2005) đã nghiên cứu quá trình sấy okara và chỉ ra rằng quá trình sấy làm
biến đổi cấu trúc sợi và làm giảm khả năng giữ nước. Tuy nhiên, hàm lượng
isoflavones trong okara không thay đổi nhiều trước và sau khi xử lý nhiệt [31].
Tình sử dụng và nghiên cứu bột okara trong nước:

12

- Đỗ Bích Thủy, Lê Thị Kim Anh (2017) đã thủy phân, lên men bã đậu nành bởi các
chế phẩm Bacillus amiloliquefaciens N1 và Lactobacillus fermentum DC4t2. Giá trị
dinh dưỡng của sản phẩm sau xử lý được đánh giá thông qua hoạt độ enzyme ngoại
bào protease, amlylase, hàm lượng axit amin tự do [2].
- Lê Chiến Phương và các cộng tác viên (2004) xử lý okara bằng nấm mốc Mucor
và vi khuẩn lactic [3].
Tính đến thời điểm hiện tại, chưa có sản phẩm nào trong số các sản phẩm
nêu trên được triển khai sản xuất thử ở quy mô công nghiệp. Điều này cho thấy ở
Việt Nam loại phụ phế liệu đậu nành này vẫn chưa được tận dụng có hiệu quả vào
các mục đích khác ngồi thức ăn chăn nuôi.
1.1.3. Thành phần Bã đậu nành:
Bã đậu nành chứa nhiều thành phần dinh dưỡng, theo Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ
(Cẩm nang “Dinh dưỡng người, thông tin dịch vụ Nông Nghiệp số 16/8”) công bố
thành phần bã đậu như sau:
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trên 100g bã đậu nành ướt
Thành phần

Giá trị

Đơn vị

Năng lượng

77

Kcal

Nước

81,6

g

Protein

3,2

g

Cacbohydrate

12,5

g

Chất xơ

4,1

g

Canxi

80

mg

Sắt

1,3

mg

Thiamin (B1)

0,02

mg

Riboflavin (B2)

0,02

mg

Niacin (B3 hay PP)

0,1

mg

13


Theo công bố của Li Bo và cộng sự (2012) thì thành phần hóa học của okara
sẽ phụ thuộc vào số lượng giai đoạn nước chiết xuất từ đậu nành và lượng nước tiếp
tục được bổ sung để trích xuất các thành phần chiết dư. Nó cũng phụ thuộc vào các
giống đậu nành và các phương pháp sản xuất, gồm: 46,3% chất xơ, 17,8% protein,
5,9% lipid, tro 3,9%, 2,6% đường khử, 0,22% flavone và 6,7% ẩm. Một số thành
phần của đậu nành khác cũng có khả năng hiện diện trong Bã đậu nành, bao gồm:

isoflavones, lignans, phytosterol, counestans, saponin và phytates.
1.1.4. Protein Bã đậu nành
Yuporn Puechkamut và Woralak Panyathitipong công bố protein trong Bã
đậu nành giảm khả năng hòa tan vào nước do trải qua các quá trình nghiền cơ học
và nhiệt làm biến tính protein. Nghiên cứu cũng kết luận protein trong bã đậu và
protein đậu nành thương mại tương đồng về khả năng tạo nhũ tương tuy nhiên độ
bền hệ nhũ tương của bã đậu bền hơn do quá trình cơ học và nhiệt làm thay đổi cấu
trúc hình cầu protein tăng số nhóm phân cực hình thành một lớp màng bền chặt
xung quanh giọt chất béo từ đó làm ổn định hệ nhũ tương [32].
Bên cạnh đó, sự tác động bởi cơ học và nhiệt độ làm tăng tương tác proteinprotein và thúc đẩy hình thành lớp màng khơng khí và nước nên tăng khả năng tạo
và giữ bọt của protein Bã đậu nành.
Khi chiết tách protein trong Bã đậu nành bằng NaOH 2N thì hiệu suất thu hồi
protein của bã ướt sẽ cao hơn bã khô (12,9g/100g BĐ và 12,3g/100g BĐ). Cịn các
tính chất khác (ổn định hệ nhũ tương, khả năng tạo và giữ bọt) gần như giống nhau
đối với protein bã đậu khô và bã đậu ướt.
Nghiên cứu trên cũng đã phân tích thành phần axit amin có trong protein Bã
đậu nành ướt như sau:

14


Bảng 1.2. Bảng so sánh thành phần axit amin trong protein Bã đậu nành
ướt và hạt đậu nành [32]

Nhận thấy tỷ lệ axit amin trong bã đậu hầu như thấp hơn có với axit amin
trong hạt đậu nành ngoại trừ một số axit amin như : Cystein, Threonine,
Glycine.
1.1.5. Phƣơng pháp xử lí protein
Thủy phân protein là sự phân cắt các liên kết peptide khi có mặt của nước. Do
liên kết peptide là liên kết bền nên cần có những tác nhân xúc tác có thể hóa học

hoặc sinh học.
Phương pháp hóa học

15


a. Thủy phân protein bằng axit
Đây là phương pháp thủy phân khắc nghiệt, dùng axit HCl nồng độ cao và
thủy phân ở nhiệt độ 100-120oC trong thời gian 24-48 giờ. Sản phẩm thu được chủ
yếu là các axit amin tự do dưới dạng hydrogenclorate. Một số axit amin như serine,
threonin bị phá hủy một phần, tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và
asparagine phân ly thành axit glutamic và axit asparic và NH4+.
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện
Nhược điểm: cần thiết bị chịu được nồng độ axit cao, xử lí chất thải sau q
trình thủy phân tốn kém, phản ứng khơng có tính đặc hiệu và q trình thủy
phân làm phá hủy một số axit amin.
b.Thủy phân bằng NaOH
Phương pháp sử dụng NaOH nồng độ 4-8N, thủy phân trong thời gian dài 2448 giờ và nhiệt độ > 100oC.
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện
Nhược điểm: cần thiết bị chịu được nồng độ kiềm cao, xử lí chất thải sau quá
trình thủy phân tốn kém và nguy hại tới mơi trường, gây hiện tượng racemic
hóa giảm giá trị dinh dưỡng và quá trình thủy phân làm phá hủy một số axit
amin như cystein, serine, treonine.
Phương pháp sinh học
a.Phương pháp vi sinh
Phương pháp này thủy phân protein nhờ enzyme từ vi sinh vật. Các enzyme
này có thể được tạo ra từ việc nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường riêng sau đó
được đưa vào mơi trường giàu đạm (cơ chất). Dung dịch sau thủy phân thu được
gồm protein, peptide, axit amin.
Ưu điểm: Phương pháp có tính đặc hiệu cao, phản ứng xảy ra trong điều kiện

ơn hịa, thiết bị đơn giản.
Nhược điểm: hiệu suất thủy phân thấp và thời gian thủy phân kéo dài.

16


b.Phương pháp enzyme
Phương pháp này thủy phân protein nhờ các chế phẩm enzyme thương mại.
Những enzyme này được thu từ các nguồn khác nhau: vi sinh vật, thực vật, động vật
và đã được tinh sạch.
Ưu điểm: Quá trình thủy phân xảy ra trong điều kiện ơn hịa; phản ứng có
tính đặc hiệu, dễ kiểm soát và điều chỉnh; thiết bị đơn giản; hiệu suất thủy
phân cao.
Nhược điểm: Chi phí cao hơn so với phương pháp hóa học.
Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến ngày này, những chế phẩm
enzyme thương mại được bổ sung vào các quá trình thu hồi protein từ phụ phẩm
trong quá trình sản xuất.
Phương pháp sấy
Bã đậu nành tươi có độ ẩm lớn cùng với hàm lượng chất dinh dưỡng trong đó
rất phù hợp cho vi khuẩn gây thối phát triển. Do đó, vấn đề bảo quản bã đậu nành là
vấn đề được quan tâm. Nhiều tác giả ở nước ngoài (Chung và cộng sự, 1978;
Fujigami và cộng sự, 1980; Hirotsuka và cộng sự , 1987) đã nghiên cứu chế độ sấy
để kéo dài thời gian bảo quản bã đậu nành.
Bã đậu nành được thải ra từ quá trình sản xuất sữa đậu nành ở dạng ướt, độ ẩm
cao 70-85% ẩm được chuyển vào thiết bị sấy phù hợp với công suất từng nhà máy.
Bã đậu này, thường được sấy bằng thiết bị sấy băng tải ở nhiệt độ 70-90oC trong
thời gian dài đưa ẩm về 10-12%. Sau đó bã khơ được bán cho các nhà máy sản xuất
thức ăn chăn nuôi để phối trộn với các thành phần khác tạo hỗn hợp thức ăn gia súc.
Phương pháp được sử dụng từ lâu đời và được ứng dụng rộng rãi do tính chất
đơn giản cuaa phương pháp. Tuy nhiên, phương pháp này tiêu tốn nguồn năng

lượng vơ cùng lớn mà sản phẩm sau q trình lại đem lại lợi nhuận khơng cao.
Chính vì vậy, hiện nay người ta đang nghiên cứu tìm kiếm những giải pháp đem lại
hiệu quả cao hơn.

17


Phương pháp lên men
Để tận dụng lượng lớn xenluloza còn sót trong Bã đậu nành, người ta đã tiến
hành nghiên cứu lên men Bã đậu nành bằng nấm mốc. Nhờ đó, lượng gluxit trong
bã đậu bị phân giải tạo axit pyruvic và CH3CHO, từ đó tổng hợp tạo axit xitric. Axit
xitric là loại axit có độ chua nhẹ, tan trong nước. Axit xitric được ứng dụng trong
ngành công nghệ thực phẩm như bánh kẹo, nước giải khát…Ngoài ra, axit xitric cịn
được sử dụng trong các ngành cơng nghiệp khác như mỹ phẩm, y học, dược phẩm,
phim ảnh và trong sản xuất chất tẩy rửa.
Phương pháp lên men đậu nành cũng được ứng dụng trong sản xuất tương. Bã
đậu nành được lên men bởi nấm mốc bổ sung vào như: Aspergillus, Mucor,
Rhizopus có hoạt tính amylase và protease cao nên thường được bổ sung trong quá
trình sản xuất.
Các chế độ (nhiệt độ, pH, thời gian..) được điều chỉnh phù hợp với loại nấm mốc sử
dụng. Việc tận dụng Bã đậu nành trong sản xuất tương đã đem lại nguồn lợi lớn cho
doanh nghiệp.
Phương này tận dụng được nguồn dinh dưỡng trong bã đậu và năng lượng cần thiết
rất thấp. Bên cạnh những ưu điểm đó, thì việc sử vi sinh vật lên men bã đậu cần
nhiều thời gian cũng như có những rủi ro (nhiễm các loại vi sinh vật khác khơng
mong muốn), khó kiểm sốt q trình.
Phương pháp thủy phân
Để tận thu nguồn protein trong bã đậu thì người ta còn sử dụng các enzyme,
các chế phẩm enzyme thương mại để thủy phân protein trong các điều kiện tương
ứng tạo peptide và axit amin. Xu hướng nghiên cứu phối hợp các loại chế phẩm

khác nhau hoặc khảo sát điều kiện để thu hồi protein nhiều nhất đang mở ra một
hướng đi mới trong vấn đề xử lí Bã đậu nành.
1.2.

Hệ enzyme protease

1.2.1. Định nghĩa
Protease là nhóm enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptide, là loại liên kết
chủ yếu trong phân tử protein và polypeptide.

18


Nhóm enzyme protease xúc tác q trình thuỷ phân liên kết peptide (-CO-NH- )n
trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài
ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit
amin.

Hình 1.1. Mơ hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ
dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên proteasevi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
1.2.2. Phân loại protease
Dựa vào vị trí phân cắt các liên kết peptide của protease, người ta chia

protease thành 2 loại:
Exo peptidase: là nhóm protease xúc tác phân cắt các liên kết ở đầu mạch
polypeptide, có thể là đầu cuối C hoặc đầu cuối N, sản phẩm tạo ra là phân tử nhỏ
như axit amin, dipeptide.
Endo peptidase: là nhóm protease xúc tác phân cắt các liên kết peptid nội
mạch, sản phẩm tạo ra là các phân tử lượng vừa và lớn.

19


1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của protease
Ảnh hƣởng nhiệt độ tới thủy phân
Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn tới khả năng xúc tác của protease. Nhiệt độ ứng với
hoạt độ enzym cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu của enzym và tùy thuộc vào loại,
cũng như nguồn enzyme. Ngồi ra nó cịn có thể thay đổi tuỳ thuộc cơ chất, pH môi
trường, thời gian phản ứng,…
Nhiệt độ mà enzym bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn. Ở nhiệt độ
tới hạn enzym bị biến tính, ít có khả năng phục hồi, thường nhiệt độ tới hạn khoảng
90-950C. Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00C hoạt độ enzyme tuy bị giảm nhưng lại có
thể tăng lên khi nâng nhiệt độ lên.
Đối với chế phẩm Neutrase khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp 40-60oC, khi
nhiệt độ nằm ngồi khoảng này thì hoạt tính enzyme giảm xuống.
Ảnh hƣởng của pH
pH mơi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym, do ảnh hưởng đến
mức độ ion hoá trung tâm hoạt động của enzym, cơ chất. Giá trị pH môi trường
tương ứng với hoạt độ enzym cao nhất gọi là pH tối ưu của enzym và thay đổi tùy
thuộc nguồn enzym. Một số enzym có pH tối ưu rất thấp (pepsin, proteinase axit
của vi sinh vật,..) hoặc khá cao (substilizin có pH tối ưu >10). Ngồi ra pH tối ưu
của một enzym cịn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như cơ chất, tính chất dung
dịch đệm, nhiệt độ,…

Nghiên cứu của Siriporn.D và Kongpob.R cho thấy hiệu suất thu hồi protein
cao nhất với chế phẩm Neutrase tại pH 7 [12].
Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng xúc
tác bởi enzym phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym. Tuy nhiên, khi nồng độ
enzym quá lớn thì hiệu quả xúc tác lại giảm.
Theo kết quả nghiên cứu của Dey và Dora [13] khi tối ưu các điều điện để
thủy phân protein trong phế liệu tôm bằng protease cho thấy khi tăng nồng độ

20


enzyme từ 1% đến 1,5% thì hiệu suất thủy phân tăng, nhưng khi tiếp tục tăng nồng
độ lên nữa thì hiệu suất thủy phân hầu như không thay đổi.
Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Trong phản ứng thủy phân dưới xúc tác của enzym, tốc độ phản ứng phụ thuộc
vào nồng độ cơ chất theo phương trình hypecpol. Ở nồng độ cơ chất thấp, khi tăng
nồng độ cơ chất tốc độ phản ứng tăng, nhưng tăng đến một mức nào đó thì vận tốc
phản ứng sẽ khơng tăng nữa.
Ngồi ra nồng độ cơ chất tối đa còn phụ thuộc vào trạng thái hòa tan của cơ
chất.
Ảnh hƣởng của các chất hoạt hóa và kìm hãm
Tính hoạt động của một số enzym protease cịn phụ thuộc vào sự có mặt của
các ion kim loại và một số hợp chất khác. Một số trong những chất đó có tác dụng
làm tăng tính hoạt động của enzym, cịn một số khác lại có tác dụng kìm hãm hoạt
động của các enzyme.
Protease của Aspergillus awamori 78 – 2 bị kìm hãm bởi các ion Co2+, Fe2+, Cu2+,
Hg2+, Ca2+, Mg2+,Mn2+, Zn2+, Ni2+ và EDTA (etylen diamin tetraaxetic).
Protease I, II,III của Aspergillus oryzae khơng bị kìm hãm bởi các ion Ba2+, Ca2+,
Mn2+, Mg2+, Zn2+, nhưng bị kìm hãm bởi các ion kim loại khác như

Cu2+,Co2+,Cd2+,Fe3+. Protease của Bacillus subtilis bị mất hoạt tính bởi hợp chất tạo
phức và khi nồng độ urê cao, ngồi ra nó bị kìm hãm bởi EDTA. Conovalov và
Dorokhow nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần nước quả đến hoạt độ của enzym
protease nhận thấy ion Na+ và Ca2+ là chất hoạt hố enzym protease. Đường có tác
dụng kích thích enzym protease, ngược lại axit có tác dụng ức chế enzym protease.
Chất chát có nồng độ 0.02 % có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzym
protease.

21


1.2.4. Một số chế phẩm protease thƣơng mại:
Flavourzyme là một phức hợp enzyme thủy phân protein đượ

ả hai hoạt tính

Aspergillus oryzae
ạ

phân cắt nộ

ừ

ử peptide (endoprotease và exopeptidase)

để chuyển hóa protein đến tận đơn vị cuối cùng là acid amin.
Nhiệt độ tối ưu cho Flavourzyme hoạt động là khoảng 50OC – 55OC, pH tối ưu
là từ 5.0 – 7.0 và có khả năng chịu mặ

bất hoạt ở 75 ºC trong 10

phút.
ế phẩm: dạng bột (Flavourzyme 500MG) và dạng
lỏng (Flavourzyme 500L)
Hoạt tính của Flavourzyme ghi trên nhãn là 500 LAPU/g (Leucine Amino
Peptidase Units/g)
Neutrase

®

là mộ

Bacillus amyloliquefaciens
ới hoạt độ tối ưu

khoảng pH 5,5-7,5 và 45-55° C. Hoạt tính của Neutrase ® được ghi trên nhãn là 1,5
AU/g (Anson unit/g). Nó là một protease kim loạ

–

kẽm trong trung tâm hoạt độ
ức chế. Sự ổn định của Neutrase ® ở

được ổn đị

một nhiệt độ nhất định bị ảnh hưởng bởi loại và nồng độ củ
-glucanase. Nếu được bảo

quản ở nhiệt độ 3-5 ° C, Neutrase
quản.

ấ

®

sẽ có hoạt tính ít nhất là một năm sau khi bảo

ở 85o

o

C trong 5 giây.

1.3. Protein thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa của protein thủy phân
Protein thủy phân là hỗn hợp sản phẩm thủy phân protein, bao gồm các axit
amin tự do, các polypeptide, các peptide với chiều dài mạch khác nhau và cả các
protein chưa bị thủy phân [7].

22


Hình 1.2. Hỗn hợp protein thủy phân
Khơng chỉ có peptide và các axit amin thu được từ quá trình thủy phân protein
có hoạt tính chống oxy hóa mà bản thân protein cũng có hoạt tính chống oxy hóa
[7]. Trong phân tử protein đã chứa sẵn những đoạn peptide có hoạt tính sinh học.
Tuy nhiên, khi nằm trong mạch protein (hay polypeptide) các hoạt tính này tồn tại
dưới dạng tiềm ẩn, khơng được thể hiện. Khi được giải phóng ra khỏi mạch bằng
cách thủy phân với enzyme đặc hiệu, các đoạn peptide và các axit amin tự do này sẽ
thể hiện được hoạt tính của chúng [26, 30].
Các axit amin tự do thường thể hiện hoạt tính chống oxy hóa khơng cao trong

thực phẩm và các hệ thống sinh học; sự phân giải triệt để protein tạo thành các axit
amin tự do thường làm giảm hoạt tính chống oxy hóa [14, 19].
Hoạt tính chống oxy hóa của các peptide thường cao hơn so với các axit amin
tự do, khả năng đó có liên quan tới tính chất đặc biệt được hình thành từ thành phần
cấu tạo, tính chất vật lý và sự ổn định của các peptide [25]. Liu và Chiang (2008)
nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa, đặc điểm, tính chất của sản phẩm thủy phân từ
hạt vừng tách béo. Kết quả thu được sản phẩm là các peptide ngắn mạch, có khối
lượng phân tử khoảng 4 - 6 kDa, có hoạt tính chống oxy hóa cao và có tác dụng làm
giảm huyết áp. Bên cạnh đó nghiên cứu cịn cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của
sản phẩm thủy phân phụ thuộc vào loại enzyme thủy phân và các thơng số của q
trình thủy phân như nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) và thời gian thủy phân
[19].
- Phần lớn các peptide chống oxy hóa có nguồn gốc thực phẩm có khối lượng
khoảng 500 - 800 Da, một số peptide có khối lượng phân tử 8 - 15 kDal. Trong

23