Đánh giá tính kháng kháng sinh và các gene độc tố ở một số chủng staphylococcus aureus được phân lập từ da người

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH
VÀ CÁC GENE ĐỘC TỐ
Ở MỘT SỐ CHỦNG Staphylococcus aureus
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ DA NGƯỜI

Sinh viên thực hiện : Phạm Thị Quỳnh Thư
MSSV

: 1511540795

GVHD

: TS. Nguyễn Hữu Hùng
ThS. Thái Thị Tuyết Trinh

TP. HCM, 2020


ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH
VÀ CÁC GENE ĐỘC TỐ
Ở MỘT SỐ CHỦNG Staphylococcus aureus
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ DA NGƯỜI
Sinh viên thực hiện

: Phạm Thị Quỳnh Thư

Mã số sinh viên

: 1511540795

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hữu Hùng
ThS. Thái Thị Tuyết Trinh

TP. HCM, 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

------------------

-----oOo-----

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên: Phạm Thị Quỳnh Thư

MSSV: 1511540795

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Lớp: 15DSH1B

1. Đầu đề luận văn:
Đánh giá tính kháng kháng sinh và các gene độc tố ở một số chủng
Staphylococcus aureus được phân lập từ da người
2. Mục tiêu
-

Xác định các yếu tố độc tố của Staphylococcus aureus đã được phân lập.

-

Đánh giá tính kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus đã được phân lập.

3. Nội dung:
-

Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus trên da người viêm da.

-

Định danh vi khuẩn Staphylococus aureus bằng phương pháp sinh hóa và
sinh học phân tử.

-

Xác định các gene độc tố trên vi khuẩn đã phân lập và khảo sát tính kháng
kháng sinh.

4. Thời gian thực hiện: tháng 10/2019 đến tháng 4/2020
5. Người hướng dẫn chính: TS. Nguyễn Hữu Hùng
Người hướng dẫn phụ: ThS. Thái Thị Tuyết Trinh
Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ mơn.
TP. HCM, ngày…… tháng…… năm20…
BỢ MƠN
(Ký và ghi rõ họ tên)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Ký và ghi rõ họ tên)


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học y dược với đề tài Đánh
giá tính kháng kháng sinh và các độc tố Staphylococcus aursus ở người viêm da là kết
quả của quá trình cố gắng không ngừng nghỉ của bản thân và được sự giúp đỡ tận tình,
động viên khích lệ của thầy cô, bạn bè và người thân. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn

chân thánh đến những người đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập – Nghiên cứu khoa
học vừa qua.
Tôi xin trân trọng gửi đến thầy giáo TS. Nguyễn Hữu Hùng và cô ThS. Thái Thị
Tuyết Trinh – Người đã trực tiếp tận tình hướng dẫn cũng như cung cấp tài liệu, thông
tin khoa học cần thiết cho bài luận này lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất.
Xin cảm ơn lãnh đạo, ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học
Nguyễn Tất Thành, khoa Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt
công việc nghiên cứu khoa học của mình.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn
bên cạnh, động viên, ủng hộ để tơi có thể hồn thành nghiên cứu này
Tuy nhiên vốn kiến thức hạn hẹp và thời gian thực hiện đề tài cũng có hạn nên bài
báo cáo của tôi không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được những ý
kiến đóng góp, phê bình của quý thầy cô. Đó sẽ là hành trang quý giá để tơi có thể hồn
thiện mình sau này.
Tơi xin chân thành cảm ơn!

(Sinh viên ký tên)

Phạm Thị Quỳnh Thư
Khoa Công nghệ Sinh học
Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
SUMMARY.....................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH.................................................................................... vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU .......................................................................................... vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................... ix
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................1
1.1 Tổng quan về Staphylococcus aureus .......................................................................1
1.1.1 Lịch sử phát hiện ....................................................................................................1
1.1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Staphylococcus aureus...........................................1
1.1.3 Phân loại khoa học..................................................................................................1
1.1.4 Đặc tính sinh hóa ....................................................................................................2
1.1.5 Các yếu tố độc tố ....................................................................................................2
1.2 Tổng quan về bệnh viêm da.......................................................................................4
1.2.1 Bệnh viêm da ..........................................................................................................4
1.2.2 Triệu chứng bệnh ....................................................................................................4
1.3 Tổng quan các phương pháp sinh hóa .......................................................................5
1.3.1 Thử nghiệm Manitol ...............................................................................................5
1.3.2 Thử nghiệm Catalase ..............................................................................................5
1.3.3 Thử nghiệm Coagulase ...........................................................................................5
1.3.4 Thử nghiệm tan huyết .............................................................................................6
1.4 Tổng quan phương pháp PCR ...................................................................................6
1.5 Tổng quan phương pháp kháng sinh đồ ....................................................................6
ii


1.6 Các nghiên cứu khoa học...........................................................................................7
1.6.1 Các nghiên cứu ngoài nước ....................................................................................7
1.6.2 Các nghiên cứu trong nước.....................................................................................8
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................9
2.1 Nơi thực hiện .............................................................................................................9
2.2 Nội dung nghiên cứu .................................................................................................9
2.3 Vật liệu nghiên cứu....................................................................................................9

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ .....................................................................................................9
2.3.3 Hóa chất và thuốc thử ...........................................................................................11
2.4 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................12
2.4.1 Phân lập và định danh S. aureus bằng phương pháp sinh hóa .............................12
2.4.2 Định danh S. aureus và xác định một số gene độc tố bằng sinh học phân tử (PCR)
.......................................................................................................................................16
2.4.3 Phương pháp kháng sinh đồ .................................................................................18
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................20
3.1 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus từ da người bệnh ..................................20
3.2 Định danh vi khuẩn Staphyloccoccus aureus bằng phương pháp sinh hóa ............21
3.3 Phân tích các gene định danh và các gene độc tố của S. aureus bằng phương pháp
PCR ................................................................................................................................25
3.3.1 Phân tích các gene xác định S. aureus bằng phương pháp PCR. .........................25
3.3.2 Phân tích các gene độc tố chủng S. aureus bằng phương pháp PCR ...................25
3.4 Phân tích kháng sinh đồ của các chủng S. Aureus...................................................26
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................31
PHỤ LỤC ......................................................................................................................33

iii


TÓM TẮT
Đề tài: “Đánh giá tính kháng kháng sinh và các gene độc tố ở một số chủng
Staphylococcus aureus được phân lập từ da người” được thực hiện từ tháng 10 năm
2019 đến 4 năm 2020 tại Phịng thí nghiệm Sinh hoá – Sinh dược – Ký sinh trùng và Tế
bào gốc, Bộ môn Công nghệ sinh học Y dược, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại
học Nguyễn Tất Thành toạ lạc tại 2347 Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, quận 12,
Tp Hờ Chí Minh.
Đề tài có ba nội dung

 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus trên da người viêm da.
 Định danh vi khuẩn Staphylococus aureus bằng phương pháp sinh hóa và
sinh học phân tử.
 Xác định các gene độc tố trên vi khuẩn đã phân lập và khảo sát tính kháng
kháng sinh.
Những kết quả đạt được sau 6 tháng nghiên cứu:
1. Phân lập được 13 chủng Staphylococcus aureus từ da người bằng môi trường
chọn lọc, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử.
2. Một số gene độc tố sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, tst, eta, etb, pvl và hlg
mà vi khuẩn dùng để gây bệnh trên da và một số bộ phận khác được đánh giá bằng PCR.
3. 19 mẫu đề kháng với kháng sinh nhóm beta-lactam. Trong đó có 3 chủng kháng
6/10 loại kháng sinh.

iv


SUMMARY
Thesis: "Evaluation of antibiotic resistance and Staphylococcus aureus toxins in
dermatitis" conducted from October 2019 to April 2020 at the Biochemical Biopharmaceutical - Parasitic and Stem Cell Laboratory, Department of Medical
Biotechnology, Department of Biotechnology, Nguyen Tat Thanh University is located
at 2347 National Highway 1A, Trung My Tay Ward, District 12, Ho Chi Minh City.
The thesis has three contents:


Isolate Staphylococcus aureus on dermatitis of human skin.



Identification of Staphylococus aureus bacteria by biochemical and

molecular biology methods.


Identify toxin genes on isolated bacteria and investigate antibiotic

resistance.
The results achieved after 6 months of research:
1. 13 strains of Staphylococcus aureus were isolated from human skin with
selective medium, physiological, biochemical and molecular biology characteristics.
2. Toxin genes including: sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, tst, eta, etb, pvl and
hlg that bacteria use to cause skin diseases and some other parts were evaluated. by PCR.
3. 19 samples resistant to beta-lactam antibiotics. There are 3 strains resistant to
6/10 types of antibiotics.

v


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Mơ tả áp xe do vi khuẩn S. aureus kháng Methicillin gây ra ...........................4
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ...................................................................................12
Hình 3.1 Hình thái nhuộm Gram chủng S. aureus ký hiệu T12 ....................................22
Hình 3.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính Catalase...........................................................23
Hình 3.3 Kết quả thử nghiệm tan huyết ........................................................................24
Hình 3.4 Kết quả thử nghiệm Coagulase.......................................................................24

vi


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị nghiên cứu ....................................................................9

Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ...............................................10
Bảng 2.3 Danh mục hóa chất và thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu..........................11
Bảng 2.4 Thử nghiệm Catalase phân biệt Staphylococci với Pneumococci và
Streptococci. ..........................................................................................................14
Bảng 2.5 Thử nghiệm tăng trưởng và lên men Mannitol của S. aureus với .................15
Bảng 3.1 Danh sách các mẫu phân lập S. aureus ..........................................................20
Bảng 3.2 Phân tích đặc điểm sinh hóa và hình thái sau khi phân lập của các chủng ....23
Bảng 3.3 Phân tích một số yếu tố độc tố của các chủng S. aureus bằng phương pháp
PCR. .......................................................................................................................25
Bảng 3.4 Tính kháng kháng sinh của các chủng S. aureus T1.1, T1.2, T3, T4, TC6.1,
TC6.2, T8, T12, T13, T14, T15, T16, T17, T18, T20.1, T20.3, T22, T23 và T25.
Am – Ampicillin; Ax - Amoxicillin; Cl - Clindamycin; Dx - Doxycyclin; Ge Genetamicin; Li - Linezolid; Ox - Oxacillin; Pn - Penicillin; Sm - Streptomycin;
Va - Vancomycin ...................................................................................................28

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
S. aureus

Staphylococcus aureus

S. epidermidis

Staphylococcus epidermidis

S. caprophyticus

Staphylococcus caprophyticus

PSM

Phenol-soluble modulin

SpA

Staphylococal protein A

Sea

Staphylococcal enterotoxin A

Seb

Staphylococcal enterotoxin B

Sec

Staphylococcal enterotoxin C

Sed

Staphylococcal enterotoxin D

See

Staphylococcal enterotoxin E

Seg

Staphylococcal enterotoxin G

Seh

Staphylococcal enterotoxin H

Sei

Staphylococcal enterotoxin I

Hlα

alpha-hemolysin

Hlg

gamma-hemolysin

Hlδ

denta-hemolysin

Eta

exfoliative toxin A

Etb

exfoliative toxin B

SSSS

Hội chứng bong vảy da do tụ cầu ở trẻ em (Staphylococcal scalded

skin syndrome)
TSST-1

Hội chứng sốc độc tố 1 (toxin shock syndrome toxin 1)

viii


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Viêm da dị ứng là một bệnh da phổ biến. Bệnh đang là một vấn nạn của con người
trong nhiều thế kỷ qua bởi chưa có biện pháp điều trị triệt để. Nguyên nhân chính của
bệnh viêm da dị ứng là sự suy giảm mạnh về đa dạng vi khuẩn, từ đó tạo cơ hội cho tụ
cầu vàng (Staphylococcus aureus) xâm nhập và gây nên các triệu chứng như: ngứa
thường xuyên trên da, mụn nước và các mẩn đỏ, chảy dịch tiết và sưng phù. Một số bệnh
viêm da nghiêm trọng hơn có thể dẫn đến biến chứng toàn thân chẳng hạn nhiễm khuẩn
huyết, viêm phổi, viêm cơ tim và nặng hơn có thể dẫn đến tử vong.
Tụ cầu vàng có khả năng làm suy yếu hàng rào bảo vệ và tác động trực tiếp lên hệ
thống miễn dịch của cơ thể. Ngồi tỷ lệ lưu hành cao, Staphylococcus aureus còn nởi
tiếng với khả năng kháng kháng sinh cao. Thực trạng tụ cầu vàng kháng kháng sinh
đang là gánh nặng ở các nước nghèo và các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam
bởi sự gia tăng chi phí thay thế kháng sinh cũ bằng kháng sinh mới đắt tiền là rất tốn
kém.
Bên cạnh việc phát hiện và phát triển mạnh mẽ bệnh viêm da dị ứng do S. aureus
thì việc xác định làm rõ các độc tố và khả năng gây bệnh kháng thuốc của những loại vi
khuẩn này có thể hỗ trợ cho việc hướng dẫn lựa chọn liệu pháp kháng sinh thích hợp, ít

tốn kém đang là vấn đề được quan tâm và nghiên cứu. Chính vì vậy, đó là lý do chúng
tôi chọn và quyết định thực hiện đề tài: “Đánh giá tính kháng kháng sinh và các gene
độc tố ở một số chủng Staphylococus aureus được phân lập từ da người”.
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập được các chủng S. aureus từ da người.
Xác định một số yếu tố độc lực và đặc điểm kháng kháng sinh của S. aureus đã
phân lập được

ix


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về Staphylococcus aureus
1.1.1 Lịch sử phát hiện
Tụ cầu là một trong những vi khuẩn gây bệnh được ghi nhận sớm nhất vào năm
1878 bởi nhà khoa học Robert Koch (1843 - 1910) trong khi phân lập vi khuẩn từ mủ
ung nhọt. Dựa trên sự dạy dỗ của những người đương thời cao cấp của mình, Louis
Pasteur và Joseph Lister 1. Năm 1881, Alexander Ogston (1844 - 1929) là một bác sĩ
phẩu thuật người Scotland đã gây bệnh thực nghiệm. Ông đã quan sát thấy mủ từ 88 ổ
áp xe của con người dưới kính hiển vi của mình và ghi nhận vi khuẩn Gram dương hình
cầu. Lấy từ tiếng Hy Lạp cho những chùm nho của người Hồi giáo, anh đặt tên cho sinh
vật là Staphylococcus. Sau khi tiêm vi khuẩn phân lập vào chuột lang và chuột khỏe
mạnh và tái tạo áp xe từ đó phân lập được, ông đã kết luận giới thiệu với thế giới về tác
nhân truyền nhiễm, hiện được gọi là Staphylococcus aureus do màu vàng của nó trong
nuôi cấy 2.
1.1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Staphylococcus aureus
Tụ cầu vàng là những cầu khuẩn, có đường kính từ 0,8 – 1,0 μm và đứng thành
hình chùm nho, bắt màu Gram dương, không có lông, không có nha bào, thường không

có vỏ. Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10 – 45 ℃ và nồng
độ muối cao tới 10 %. Thích hợp được ở điều kiện hiếu và kỵ khí 3.
1.1.3 Phân loại khoa học
Ngành (phylum): Firmicutes
Lớp (class): Bacilli
Bộ (ordo): Bacillales
Họ (family): Staphylococcaceae
Chi (geneus): Staphylococcus
Loài (species): Staphylococcus aureus

1


Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1.4 Đặc tính sinh hóa
Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển ở nhiệt độ từ 10 – 45 ℃, pH = 7,0 7,5, môi trường chứa khoảng 15 % NaCl. Đặc trưng riêng của S. aureus dùng để phân
biệt S. aureus với những tụ cầu khác là khả năng đông huyết tương do chúng có chứa
enzym coagulase. Có 02 dạng coagulase: coagulase cố định và coagulase tự do.
Coagulase cố định được gắn vào thành tế bào. Phương pháp giúp phát hiện coagulase
cố định được thực hiện trên lam kính bằng cách cho phản ứng trực tiếp với fibrinogene.
Coagulase tự do được phóng thích khỏi thành tế bào. Phương pháp này thực hiện trong
ống nghiệm bằng cách phản ứng gián tiếp với fibrinogene với những yếu tố khác trong
huyết tương tạo thành từng khối hay cục.
Trên mơi trường thạch máu S. aureus có khả năng làm tan huyết, vòng tan huyết
phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vịng tan hút hẹp hơn so với đường
kính khuẩn lạc. Hầu hết S. aureus đều tạo sắc tố vàng thấy rõ nhất là sau 1 - 2 ngày ni
cấy ở nhiệt độ phịng. Ngồi ra, S. aureus cịn phản ứng DNase, phosphatase dương tính,
có khả năng lên men và sinh acid trên môi trường manitol tạo kh̉n lạc trịn, bờ đều và
lời, màu vàng nhạt đến đậm và làm đổi màu môi trường từ đỏ cam sang màu vàng.
1.1.5 Các yếu tố độc tố

Nhóm độc tố tụ cầu khuẩn S. aureus Enterrotoxin (SE) có các dạng: SEA, SEB,
SEC, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ là sản phẩm của các gene tương ứng sea, seb, sec,
sed, see, seg, seh, sei, sej trong đó:
Enterotoxin A (SEA) và Enterotoxin B (SEB) là các siêu kháng nguyên gây ngộ
độc thực phẩm 4.
Gene hlα mã hóa cho độc tố Hlα (Alpha-hemolysin) là độc tố khử màng mạnh nhất
của S. aureus. Nó ở dạng một monomer gắn kết với màng tế bào mẫn cảm. Ở người,
tiểu cầu và bạch cầu đặc biệt nhạy với alpha-hemolysin do chúng có thụ thể chuyên biệt
nhận diện và cho phép độc tố gắn kết hình thành lỗ nhỏ mà cation hóa trị một có thể qua
được 5.

2


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Hlδ (Denta-hemolysin) là một exotoxin có khối lượng phân tử thấp nên tạo thành
nhiều cấu hình khác nhau với khả năng tiết ra nhiều loại tế bào. Nó gây độc trên bề mặt
tế bào và tiết ra các yếu tố độc lực thông qua bộ phận hổ trợ điều hòa gene 5.
Gene hlg mã hóa cho độc tố Hlg (gamma-hemolysin), khi S. aureus xâm nhập vào
máu tương tác với bạch cầu trung tính và hồng cầu. Bạch cầu trung tính ăn S. aureus
nhưng vẫn còn lại một số lượng đáng kể và nó tấn công tế bào hồng cầu. Nó liên kết với
màng hồng cầu và tiết độc tố Hlg làm phá vỡ hồng cầu gây ra hiện tượng tan huyết 6.
Gene eta, etb tạo ra sản phẩm là ETA và ETB sản xuất độc tố tẩy tế bào chết (Et)
là các protease serine và là tác nhân gây ra hội chứng bong vảy da do tụ cầu ở trẻ em
(Staphylococcal scalded skin syndrome: SSSS), hội chứng này cũng xảy ra ở người lớn
bị suy thận và suy giảm miễn dịch. Chúng vào lớp thượng bì và đi vào máu gây phồng
rộp da 7.
Gene tst tạo ra sản phẩm là TSST-1 (hội chứng sốc độc tố - 1) xảy ra cả người lớn
và trẻ em. Chúng thường xâm nhập vào máu qua các vết thương ở da hoặc vết thương
do phẫu thuật. Hội chứng này cũng có thể xảy ra ở phụ nữ có kinh dùng tampon hoặc

dùng cốc nguyệt san. Mức dộ gây tử vong của TSST-1 dường như không phụ thuộc vào
sự tăng sinh tế bào T mà thay vào đó liên quan đến các loại thụ thể tế bào chủ khác.
TSST-1 sẽ kích thích giải phóng các chemokine, chẳng hạn như IL-8 và MIP-3α, IL-2
và TNFα. Kích hoạt các tế bào miễn dịch sẽ tăng cường viêm và gây ra sự phá vỡ hàng
rào tế bào niêm mạc, cho phép tương tác của chất độc với tế bào T và đại thực bào, dẫn
đến hội chứng sốc độc 8.
Gene pvl tạo ra sản phẩm leukocidin thường xảy ra ở các chủng S. aureus kháng
Methicillin (MRSA). Nó gây nhiễm trùng da và nhiễm trùng mô mềm, đôi khi gây viêm
phổi hoại tử nghiêm trọng. Leukocidin tiết độc tố tiêu diệt các tế bào miễn dịch mà cụ
thể là quá trình thực bào. Bên cạnh đó Leukocidin cũng tiêu diệt các tế bào giết tự nhiên
và lympho T. Độc tố này cũng nhắm mục tiêu đến 2 loại phản ứng miễn dịch (bẩm sinh,
thích nghi). Ngoài hoạt động của bạch cầu, một số Leukocidin có khả năng ly giải hồng
cầu, bao gồm độc tố alpha, độc tố beta và các peptide gây độc tế bào gọi là Phenol
Soluble Modulins (PSM) 9.

3


Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.2 Tổng quan về bệnh viêm da
1.2.1 Bệnh viêm da
Bệnh viêm da là sự xâm nhập của vi khuẩn vào da và các mô mềm bên dưới da.
Các biểu hiện lâm sàng, nguyên nhân và mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào
sự xâm nhập, sức đề kháng và độc lực của vi khuẩn. Nhiễm trùng da và mô mềm bao
gồm các nhiễm trùng nhẹ và nhiễm trùng nặng. Một số nhiễm trùng nhẹ như: viêm mủ,
bỏng rộp, chốc lở, nhọt và nhiễm trùng nặng hơn có thể dẫn đến tử vong như viêm hoại
tử. Bệnh thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh
tối thiểu là chổ bị tổn thương có những đốm đỏ, phù ấm, có mủ hoặc khơng, cảm giác
đau buốt.
1.2.2 Triệu chứng bệnh

Chốc lở là biểu hiện của bệnh nhiễm trùng trên da vi khuẩn có thể xâm nhập trên
da bình thường hoặc da bị tổn thương, phổ biến ở trẻ em và rất dễ lây lan. Nhọt liên
quan đến nhiễm trùng nang lông và kéo dài vào mô dưới da. Bệnh nhân cảm thấy đau
đớn khi sờ vào, đỏ và sưng tấy. Nhọt thường phát triển ở dưới cánh tay, bẹn hoặc mông.
Viêm mô tế bào là khu vực lan rộng của ban đỏ và ấm áp. Nhiễm trùng cục bộ thường
đi kèm với viêm bạch huyết và bệnh bạch huyết. Hội chứng bỏng rộp khi nhiễm bệnh
vi khuẩn tiết ra một loại độc tố gây bỏng da, sưng tấy lên sờ vào có cảm giác ấm, mụn
nước hoặc phát ban.

Hình 1.1 Mô tả áp xe do vi khuẩn S. aureus kháng Methicillin gây ra

(Trích nguồn: />Một loạt yếu tố làm suy yếu hệ thống miễn dịch góp phần làm tăng nguy cơ nhiễm
bệnh tụ cầu vàng. Những đối tượng có thể có nhiều khả năng mắc bệnh bao gồm như:
4


Chương 1. Tổng quan tài liệu
 Người mắc bệnh đái tháo đường có sử dụng insulin
 Nhiễm HIV/AIDS
 Bệnh suy thận cần được lọc máu
 Hệ thống miễn dịch suy yếu
 Ung thư, những người trải qua hoá trị và xạ trị
 Da có những tổn thương như eczema, côn trùng cắn hoặc tổn thương có hở da
 Các vết thương sau phẫu thuật
 Vết bỏng.
Bên cạnh đó, còn có những yếu tố nguy cơ khác gây bệnh từ tác nhân bên ngoài
của con người dẫn đến bệnh như:
 Sống trong môi trường chật hẹp, đông đúc mất vệ sinh
 Tiêm chích ma tuý
 Quan hệ tình dục bừa bãi.

1.3 Tổng quan các phương pháp sinh hóa
1.3.1 Thử nghiệm Manitol
Vi khuẩn sử dụng các nguồn carbon để lên men thì các sản phẩm tạo thành đều
làm giảm pH của môi trường. Do vậy khả năng lên men được đánh giá sự làm giảm pH
của môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường 10.
1.3.2 Thử nghiệm Catalase
Vi khuẩn sinh enzyme Catalase để thủy phân H2O2 thành H2O và O2, tạo ra bọt
khí. Xét nghiệm này được dùng để phân tích đặc điểm ban đầu của hầu hết các vi khuẩn
11

.

1.3.3 Thử nghiệm Coagulase
Coagulase là chất giống Thrombin, có thể chịu nhiệt, có khả năng hoạt hóa
fibrinogen thánh fibrin, tạo thành cục đông fibrin. Hiện tượng này được biểu hiện trong
thử nghiệm hình thành cục đông khi cho vi khuẩn thuộc chi Staphylococcus vào huyết
tương. Vi khuẩn sinh Coagulase tự do, được phóng từ tế bào. Ở hầu hết các chủng S.
aureus, fibrinogen gắn trên bề mặt tế bào gọi là “Coagulase liên hợp” hoặc “yếu tố kết
5


Chương 1. Tổng quan tài liệu
cụm”. Nhờ yếu tố này, vi khuẩn có khả năng tác động trực tiếp lên finrinogen trong
huyết tương để gây đông vón trên lam kính 11.
1.3.4 Thử nghiệm tan huyết
Streptococcus agalactiae tạo ra một loại protein chịu nhiệt, ngồi tế bào, có thể
kh́ch tán, tác động hiệp đồng với yếu tố tan máu (tiêu huyết) beta (beta-lysin) do
Staphylococcus aureus sản xuất ra để tạo thành một vùng ly giải trong môi trường chứa
hồng cầu cừu hoặc bò. Protein này tên là yếu tố CAMP (CAMP factor) là từ ghép từ chữ
bắt đầu của tên các tác giả bài báo đầu tiên mô tả hiện tượng này. Đối với vi khuẩn

Staphylococcus aureus có 4 kiểu tan huyết: tan huyết alpha (alpha-hemolysin), tan huyết
beta (beta-hemolysin), tan huyết gamma (gamma-hemolysin) và tan huyết delta (deltahemolysin) 11.
1.4 Tổng quan phương pháp PCR
Nguyên tắc: Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng
hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số
lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym
polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn
DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bở sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ
hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới.
Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA
nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy
được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các
mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự
DNA xác định, cần phải có những thơng tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là
trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt 12.
1.5 Tổng quan phương pháp kháng sinh đờ
Kháng sinh có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn một cách đặc hiệu. Mặc dù
có rất nhiều loại kháng sinh được ra đời nhằm kiểm soát sự nhân lên và vi khuẩn nhưng
vi khuẩn cũng không ngừng biến đổi tạo ra khả năng đề kháng kháng sinh với tốc độ rất
nhanh, thậm chí còn nhanh hơn rất nhiều so với sự ra đời của một kháng sinh mới. Trong
6


Chương 1. Tổng quan tài liệu
cuộc chiến giữa con người và vi khuẩn, rất cần việc sử dụng kháng sinh hợp lý để khơng
những đảm bảo an tồn và hiệu quả trong điều trị mà còn hạn chế sự gia tăng các vi
khuẩn đề kháng kháng sinh. Xét nghiệm kháng sinh đờ thực hiện tại các phịng xét
nghiệm vi sinh lâm sàng nhằm xác định khả năng ức chế in vitro của kháng sinh với vi
khuẩn nhằm hai mục đích: - Định hướng cho bác sĩ lâm sàng lựa chọn kháng sinh phù
hợp cho từng bệnh nhân. - Cung cấp các bằng chứng dịch tễ học về xu hướng đề kháng

kháng sinh của các vi khuẩn trong từng giai đoạn, ở từng khu vực, là cơ sở để xây dựng
các hướng dẫn điều trị kháng sinh. Có hai kỹ thuật kháng sinh đồ là kỹ thuật kháng sinh
đồ khoanh giấy kh́ch tán và kỹ thuật kháng sinh đờ pha lỗng.
Ngun lý của kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán.
Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thử nghiệm được đánh
giá dựa vào vùng ức chế tạo ra xung quanh khoanh giấy thấm kháng sinh. Khi đặt khoanh
giấy kháng sinh trên bề mặt thạch, kháng sinh sẽ khuếch tán vào trong thạch; càng xa
khoanh giấy, nồng độ kháng sinh càng giảm. Sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế khi
kháng sinh đạt đến một nờng độ nhất định. Dựa vào đường kính vùng ức chế và điểm
gãy trong tài liệu hướng dẫn phiên giải kết quả kháng sinh đồ, mức độ nhạy cảm có thể
phân chia thành phân loại S (susceptible - nhạy cảm), I (intermediate - trung gian), R
(resistant - đề kháng) hoặc NS (non-susceptible - không nhạy cảm) 11.
1.6 Các nghiên cứu khoa học
1.6.1 Các nghiên cứu ngoài nước
Nhóm nghiên cứu của Keenan cùng cộng sự thuộc trường Đại học Dublin, Ireland
đã bước đầu cho thấy vai trò quan trọng của protein bề mặt CWA từ chủng S. aureus là
yếu tố độc lực trong nhiễm trùng da và đặc biệt là khả năng kích hoạt tế bào T, loại tế
bào có liên quan đặc biệt trong việc bảo vệ vật chủ chống lại nhiễm trùng da do S. aureus
13

.
Nhóm nghiên cứu của Sunhyo và cộng sự của khoa công nghệ sinh học, trường

Đại học Chosun, Hàn Quốc đã chỉ ra sự gia tăng của các chủng S. aureus kháng thuốc
khi nhiễm trùng trên da. Sự tồn tại của nhiều cơ chế kháng thuốc cho thấy vai trò quan
trọng của CAMP (Cationic Antimicrobial Peptides) trong việc bảo vệ da của vật chủ
7


Chương 1. Tổng quan tài liệu

chống vi khuẩn. Những thay đổi trên CAMP như gia tăng điện tích dương, thay đởi trình
tự acid amin được coi là một cách tiếp cận dược lý đầy hứa hẹn chống lại vi khuẩn kháng
thuốc 14.
Nhóm nghiên cứu của Keenan cùng cộng sự thuộc trường Đại học Dublin, Ireland
đã phát hiện ra một cơ chế hoàn toàn mới lạ của S. aureus tạo thành áp xe trong nhiễm
trùng da là ClfB, một yếu tố độc lực quan trọng trong S. aureus. ClfB một loại protein
bề mặt của S. aureus, hình thành áp xe bằng cách liên kết với loricrin protein chủ. Nghiên
cứu mới này là một sự hứa hẹn góp phần hỡ trợ cho mục tiêu điều trị quan trọng đối với
S. aureus 13.
1.6.2 Các nghiên cứu trong nước
Vũ Tuấn Anh thuộc Bệnh viện Phong – Da Liễu Trung ương Quy Hoà đã nghiên
cứu thành công vai trò của tụ cầu vàng trong viêm da cơ địa. Nghiên cứu chứng minh
rằng màng của tụ cầu vàng có chứa diacylliprotein kích hoạt quá trình viêm da cơ địa
đồng thời làm rõ vòng xoắn bệnh lý giữa nhiễm tụ cầu vàng trên da và bệnh viêm da 15.

8


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nơi thực hiện
Đề tài thực hiện từ tháng 9/2019 tại Khoa CNSH, Trường Đại học Nguyễn Tất
Thành, 2347 Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, TP. Hồ Chí Minh.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập S. aureus từ da người bị viêm da.
Định danh S. aureus bằng hình thái và các phản ứng sinh hoá.
Khẳng định lại S. aureus và xác định một số gene mã hóa yếu tố gây độc bằng sinh
học phân tử.
2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ
Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị nghiên cứu
STT

Thiết bị

STT

Thiết bị

1

Máy ly tâm

10

Tủ hấp

2

Máy PCR

11

Cân kỹ thuật

3

Máy vortex

12

Cân phân tích

4

Máy

13

Lị vi sóng

5

Spindown

14

Bể ơn nhiệt

6

Tủ ấm

15

Máy ủ lắc

7

Tủ cấy

16

Máy nước cất

8

Tủ lạnh

17

Thiết bị điện di

9

Tủ mát

18

Kính hiển vi

9


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
STT

Dụng cụ

STT

Dụng cụ

1 Khẩu trang

1

Đền cờn

2 Găng tay y tế

2

Bình tam giác

3 Khay đựng eppendorf

3

Bình xịt cờn

4 Hộp đựng đầu tp

4

Ống phacol

5 Đầu týp các loại

5

Ống PCR

6 Giấy bạc

6

Bút lông

7 Giấy báo

7

Lam kính

8 Que cấy vịng

8

Lamen

9 Que cấy trang

9

Đĩa petri

10

Pipet nhựa

10 Giấy cuộn

10


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.3 Hóa chất và thuốc thử
Bảng 2.3 Danh mục hóa chất và thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu
STT

Hóa chất

Nơi SX

STT

1

Crystal violet

Nam khoa

15

Doxycycline (Dx)

Nam khoa

2

Lugol

Nam khoa

16

Genetamicin (Ge)

Nam khoa

3

Alcohol 95 %

Nam khoa

17

Amoxicillin (Ax)

Nam khoa

4

Safanine

Nam khoa

18

Linezolid (Li)

Nam khoa

5

Dầu soi kính

19

Penicillin ( Pn)

Nam khoa

6

Cồn 96

Việt Nam

20

Clindamycin (cL)

Nam khoa

Himedia

21

Oxacillin (Ox)

Nam khoa

Himedia

22

Vancomycin (Va)

Nam khoa

Nam khoa

23

Streptomycin (Sm)

Nam khoa

Himedia

24

Ampicillin (Am)

Nam khoa

Himedia

25

TAE 50X

Việt Á

7
8
9
10
11

Sheep Bood
Agar Base
Brain Heart
Infusion Broth
Máu cừu
Mannitol Salt
Agar
Mueller
Hinton Agar

Hóa chất

Nơi SX

12

Nutrient Agar

Himedia

26

Primer

Phù Sa

13

My-TaqMix
2X

Bioline

27

Agarose

Seakem

14

DNA Maker

Bioline

28

Gelred

11

TBR


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.4 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.4.1 Phân lập và định danh S. aureus bằng phương pháp sinh hóa
2.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu
Mục đích: nhằm thu nhận các chủng vi sinh vật trên bề mặt da.
Các bước tiến hành: dùng tăm bông đã hấp khử trùng chà nhẹ lên các khu vực có
mụn trên mặt của các bệnh nhân rồi cấy trực tiếp lên đĩa thạch Chapman. Các đĩa môi
trường sau khi cấy được ủ 37 ℃ trong 24h.
2.4.1.2 Phân lập và làm thuần mẫu
Mục đích: thu nhận các chủng vi sinh vật có trên da mặt.
Các bước tiên hành: các đĩa môi trường sau khi cấy có kh̉n lạc mọc, chọn các
kh̉n lạc rời làm đởi màu môi trường sang màu vàng cấy ria sang đĩa môi trường
Chapman mới để thu nhận các khuẩn lạc rời lặp lại quá trình này 2 - 3 lần để được chủng
vi khuẩn thuần.

12

Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.4.1.3 Phương pháp nhuộm Gram tế bào vi khuẩn.
Mục đích: xác nhận hình dạng và nhóm Gram của vi kh̉n.
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn
thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào.
Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan
Mạch Hans Christian Gram (1853 - 1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884
để phân biệt các Pneumococcus với Klebsiella pneumoniae.
Các bước thực hiện
Bước 1: Cố định mẫu, cho giọt nước muối sinh lý (NaCl 0,9 % đã hấp khử trùng)
lên lam kính, dùng khuyên cấy vòng lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc rời sau khi đã làm
thuần tán đều vào giọt nước muối sinh lý, để khô tự nhiên trong không khí hoặc có thể
hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn.
Bước 2: Nhuộm tiêu bản với các dung dịch nhuộm.
-

Đầu tiên phủ dung dịch tím Genitan khoảng 60 giây sau đó rửa dưới vòi
nước chảy nhẹ. Bước này sẽ giúp tất cả vi khuẩn bị nhuộm thành màu tím
đen.

-

Tiếp theo phủ dung dịch Lugol để cố định màu, cũng để khoảng 60 giây
rồi rửa dưới vòi nước. Dung dịch sẽ giúp gắn màu tím vào vi khuẩn đậm
hay nhạt tùy thuộc vào loại của nó.

-

Tẩy màu bằng cồn 96 độ để khoảng 30 giây rồi rửa nước. Đây là bước rất
quan trọng để phân loại vi khuẩn đã được dung dịch Lugol gắn chắc màu

tím vào và loại màu tím bị tẩy trôi.

-

Cuối cùng phủ dung dịch đỏ Fuchsin 1/10 của Gram để khoảng 60 giây
rồi rửa dưới vòi nước sex làm các vi khuẩn đã được tẩy hết màu tím bắt
lại màu đỏ, những vi khuẩn đã bị nhuộm tím đen sẽ không bị ảnh hưởng.

Bước 3: Để khô tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi.

13